熊飞 （苏州大学生物医学研究院 江苏苏州 215123）
【摘要】目的 比较经不同固定液处理的小鼠肝脏石蜡切片HE染色效果，优化实验方法。方法 用3种不同固定液（10%中性福尔马林、4%多聚甲醛、AF固定液）处理小鼠肝脏组织，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，HE染色，观察比较染色效果。结果 10%福尔马林、4%多聚甲醛固定的肝组织结构完整、清晰，细胞界限清楚，染色鲜艳；AF固定液固定的肝组织结构不完整，界限不清，胞浆中出现大量空泡。结论 10%中性福尔马林和4%多聚甲醛是制作小鼠肝脏石蜡切片HE染色标本的理想固定液。
【关键词】固定液 肝脏 石蜡切片 HE染色
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）33-0116-02
Effects of different fixative for HE staining on mouse liver paraffin sections
Xiong Fei
（Jiangsu Key Laboratory of Infection and Immunity, Institutes of Biology and Medical Sciences, Soochow University,
Suzhou 215123, China）
【Abstract】Purpose: To compare of mouse liver paraffin section and HE staining effect treatment with different fixative, optimization of experimental method. Methods: Mouse livers were immersed in three different fixatives (10% buffered formalin, 4% polyformaldehyde, and AF fluid) respectively. The tissue were dehydrated, transparentized and immersed in paraffin as routine procedure. The paraffin embedded liver tissue were sectioned and stained with Hematoxylin and Eosin, liver sections were compared under the light microscope. Results: The tissues fixed with 10% buffered formalin and 4% polyformaldehyde showed complete and clear structure, and the hepatocytes well stained. The structure of liver tissues fixed with AF fluid was not complete, ill-defined, and with large vacuoles in cytoplasm.Conclusion: 10% buffered formalin and 4% polyformaldehyde fixative is the most effective fixative for mouse liver HE staining.
【Key words】Fixative Liver Paraffin section HE staining
肝脏是人体消化系统中最大的消化腺，也是人体内脏中最大的器官，主要担负着代谢功能，并在体内发挥去氧化，储存肝糖，分泌性蛋白质的合成，制造胆汁，免疫调节等重要的作用。石蜡切片HE染色是形态学研究最常用的方法，我们在之前的实验中发现肝脏在石蜡切片制作过程中因所选的固定液、脱水时间等的不同导致结果有较大差别，其中固定液的选择是非常重要的一方面，对标本最终染色结果有决定性作用。当前有大量的研究涉及肝脏的动物模型制作及组织病理学鉴定，如肝硬化、肝癌等[1-3]，因此有必要建立一种标准的肝组织石蜡切片HE染色方法，便于正确评估实验结果。
本实验通过使用三种病理学实验中常规的固定液10%福尔马林，4%多聚甲醛和AF固定液固定正常小鼠的新鲜肝脏组织，进行石蜡切片和HE染色，观察并比较不同固定液对小鼠肝脏的HE染色结果的影响。
1.实验材料
1.1仪器设备
全自动脱水机Leica-TP1020，石蜡包埋机Leica-EG1150H，手动转轮切片机Leica-RM2235，电热恒温鼓风干燥箱DHG9146A，Nikon-90i图像分析系统。
1.2实验动物及主要试剂
主要试剂：10%中性福尔马林（饱和甲醛溶液10ml+pH7.4磷酸盐缓冲液90ml）；4%多聚甲醛（4g多聚甲醛溶于100ml PBS中，用NaOH调节pH至7.4）；AF固定液（95%乙醇85 mL+40%甲醛溶液10 ml+冰醋酸5 ml）。
实验动物：实验选用健康雄性balb/c小鼠3只，体重20±2g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司（SCXK(沪)2012-0002）。
2.实验方法
2.1取材与固定
1%戊巴比妥钠腹腔麻醉动物（30mg/kg），分别取同一小鼠肝脏中叶，剪成片状，厚度3mm，分别置入3种固定液中（10%中性福尔马林、4%多聚甲醛、AF固定液），每组数片，固定24h。
2.2固定后处理
根据不同固定液的要求，采取不同处理方式：10%中性福尔马林和4%多聚甲醛固定后流水冲洗30min；AF固定液不冲洗，直接脱水。
2.3脱水与透明
用全自动脱水机将固定后的组织常规脱水、透明。具体程序：75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ脱水各1h，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水各50min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ透明各30min，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ浸蜡各90min。
2.4包埋与切片
用Leica-EG1150H包埋机将组织包埋好，进行切片，厚度为4μm，50℃水浴裱片，切片晾干后置于75℃烘箱中烘烤30min。
2.5HE染色与封片
将脱蜡入水的组织用Harri苏木素染液室温染色6min，盐酸乙醇溶液4s，伊红染色1min，中性树胶封片。
3.实验结果
通过镜下观察可见10%中性福尔马林固定的肝组织结构完整，中央静脉及其周围放射状排列的肝细胞索清晰，彼此连接成网状，肝细胞呈多边形，界限清楚，胞浆丰富，核质对比明显；4%多聚甲醛固定的组织，结构完整，细胞清晰，呈多边形，界限清楚，但胞浆略显不够丰富且少量细胞有散在小空泡；AF固定的组织肝小叶结构，中央静脉及其周围肝细胞索可辨，肝细胞结构不够完整，界限不清，胞浆中出现大量空泡。
图1 图2
图1 小鼠肝脏石蜡切片HE染色标本 10%中性福尔马林固定 ×200
图2 小鼠肝脏石蜡切片HE染色标本 4%多聚甲醛固定 ×200
图3 小鼠肝脏石蜡切片HE染色标本 AF固定液固定 ×200
4.讨论
组织固定是形态学研究中必不可少的步骤，组织经过固定可以迅速防止自溶与腐败，将蛋白质、脂肪、糖等物质转变为不溶性物质，沉淀和凝固组织中各种物质，硬化组织等，使要观察的组织构造尽量接近于它生前的正常状态和便于切片观察。固定液中化学成分的渗透压，pH值等诸多因素会影响固定液的效果[4]。
上述三种不同的固定液处理的小鼠肝脏石蜡切片HE染色标本的结果各有不同：10%中性福尔马林固定液是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，收缩性小，对大多数抗原物质保存较好，但其对细胞膜通透性有影响，可使某些大分子抗原失去活性；4%多聚甲醛固定液也适用于光镜免疫组织化学方法，作用和10%中性福尔马林类似，但更适合组织标本的长时间固定用；AF固定液具有固定和脱水作用，节省时间，但是细胞收缩性较大，不可水洗[5-7]。
通过实验发现10%中性福尔马林和4%多聚甲醛可以迅速地渗入肝组织内部，防止自溶与变性，能够稳定细胞内的各种结构，保持肝脏的正常形态，经过固定后，HE染色鲜艳，对比度明显；经AF固定液固定过的肝组织脆性较大，切片易碎，胞浆中有大量空泡，切片和HE染色结果不理想。
5.结语
AF固定液不适用于病理学研究中的肝脏组织固定，10%中性福尔马林和4%多聚甲醛均可以较好地用于小鼠肝脏HE染色的固定。由于4%多聚甲醛配制麻烦，长时间存放甲醛固定液会变酸影响细胞核染色，并且产生福尔马林色素，但是短期使用不影响，故10%中性福尔马林和4%多聚甲醛都可以用于小鼠肝脏HE染色的组织固定，制作过程应视具体情况加以调整。
参考文献
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论文作者:熊飞
论文发表刊物:《医药前沿》2013年11月第33期供稿
论文发表时间:2014-1-13
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