（1徐州医科大学附属徐州临床学院泌尿外科 江苏 徐州 221009）
（2昆山市瑞科药物研发有限公司 江苏 昆山 215300）
（3徐州医科大学附属徐州临床学院中心实验室 江苏 徐州 221009）
（4重庆威斯滕生物医药科技有限责任公司 重庆 400010）
【摘要】目的：检测前列腺癌细胞株PC3中 hTERT/PSA基因转录水平和蛋白表达水平。方法：分三组采用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测正常前列腺组织及前列腺癌PC3细胞中基因和蛋白表达。结果：荧光定量PCR及Wsetern bolt检测前列腺癌PC3细胞较正常前列腺组织表达升高明显。结论：hTERT/PSA在在人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株 PC3中表达升高，在靶向调控中起重要作用。
【关键词】 hTERT；PSA；人前列腺癌PC3；PCR；Western blot
【中图分类号】R737.25 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）09-0202-02
近年来,前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，已经跃升为男性泌尿生殖系统肿瘤的第3位[1]。在前列腺癌治疗中，靶向治疗成为泌尿外科医生研究的重点。相对于前列腺癌组织，目前，hTERT属于光谱类肿瘤生物分子的标记物，而前列腺肿瘤特异性抗原（PSA）是目前公认的前列腺癌分子标志物。通过荧光定量PCR及蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测正常前列腺组织及前列腺癌细胞中基因和蛋白表达情况。
1.材料与方法
1.1 临床资料
前列腺癌PC3细胞购于中国科学院，BPH组织来自徐州市中心医院病理科，标本经直肠超声引导下前列腺13点活检技术采集；所有组织切片都经过病理的证实。
1.2 材料
引物来自Western Biotechnology公司，DEPC购于美国Sigma公司，RT试剂及荧光定量PCR试剂购于Western Biotechnology公司，一抗hTERT/PSA、内参一抗、二抗羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG均购于美国Abcam公司，PVDF膜购于美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
（1）在对齐长短玻璃以后，植入制胶夹之中并卡紧，在止胶架上应用垂直卡来灌胶。（2）10%的分离胶配置，在添加以后需要及时混匀，然后灌胶。将胶加至适量高度（绿线附近）后，轻柔加上双蒸水压胶。（3）如果水胶间存在折线，代表凝胶，过3分钟胶就可以彻底凝固，再把胶上的水通过滤纸吸干。（4）5%浓缩液的配制，在添加TEMED以后需要及时混匀，然后灌胶。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆（5）在凝固浓缩胶以后，将含胶的玻璃板加入电泳夹卡紧，放入电泳槽（电极红对红，黑对黑）。（6）提取样品和5×SDS缓冲液，根据4：1的比例进行混合。（7）加入电泳液以后，根据等量的蛋白进行上样。（8）打开夹子，维持水平，并在上面垫上海绵垫与滤纸等，把电泳液转变为转移液。（9）把电流调整为200mA。根据蛋白分子量的大小，越大的蛋白转膜时所用的时间也越长，但是也不能太久都则会转透到滤纸上。（10）将膜提出，进行标记，于TBST之中进行清洗。（11）通过封闭液把对应一抗稀释为（1：500）的浓度，并且内参一抗稀释最终浓度（1：1000）。（12）通过TBST清洗三次，5min/次。（13）通过封闭液把二抗稀释为（1：1000)的浓度，温育1.5小时。（15）通过TBST洗四次，5min/次。（16）曝光。将ECL曝光液按A液：B液1:1混匀后均匀覆盖在整片膜上，反应2min放入曝光仪曝光检测。
2.结果
蛋白免疫印迹(Western blot)方法能够检测出正常前列腺组织及前列腺癌PC3细胞中基因和蛋白表达。
3.讨论
前列腺的常规治疗方法主要包含手术治疗、激素与放化疗等，这类治疗方法在局灶患者的治疗方面比较有效，然而依然有患者会复发，容易发生不良的反应；很多患者在就诊时处在中晚期，治疗难度比较大，通过姑息性的治疗，会导致患者肿瘤转移与复发[2]。伴随免疫学与分子生物学发展，逐渐开始应用基因治疗，并且基因治疗也变成肿瘤学的研究热点。前列腺癌治疗中也开始应用基因治疗，尤其在原发性与转移性的前列腺癌治疗有着有显著效果。此外，载体系统与治疗基因都与临床治疗的效果有着密切的关系，治疗基因属于关键部分，载体属于基础。hTERT为人端粒酶的逆转录酶(humantelomerasere versetranscriptase)缩写，而人端粒酶通过3个亚单位共同组成：端粒酶的逆转录酶(hTERT)、RNA组分与端粒酶。在发现端粒酶以后，便受到人们关注，hTERT在端粒酶的活性有着重要作用，属于端粒酶研究热点[3]。
根据前列腺肿瘤的病理和免疫学特点，本文采用PCR及蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测正常前列腺组织及前列腺癌PC3细胞中基因和蛋白表达[4]。从结果可以得知前列腺癌PC3细胞中hTERT/PSA基因及蛋白表达明显升高。由此可以筛选PSA的启动子与hTERT的启动子特异性，同时作为前列腺癌特异性的导向靶点，同时联合各个靶点，建立双调控肿瘤特异性的病毒载体、hTERT与PSA双靶向强化治疗基因对于前列腺肿瘤靶向性，提高临床治疗的效果。
【参考文献】
[1] McInnes IB.Psoriatic arthritis: embracing pathogenetic and clinical heterogeneity? Clin Exp Rheumatol.2016,34(4):9-11.
[2] Wood, David P.Extracapsular Extension But Not the Tumour Burden of Lymph Node Metastases is an Independent Adverse Risk Factor in Lymph Node-Positive Bladder Cancer Editorial Comment.Journal of urology，2013,189(2):484.
[3] Roointan A,Sharifi-Rad M,Badrzadeh F.A comparison between PLGA-PEG and NIPAAm-MAA nanocarriers in curcumin delivery for?hTERTsilencing in lung cancer cell line. Cell Mol Biol.2016,62(9):51-6.
[4] Ramlee MK, Wang J,Toh WX,Li S.Transcription Regulation of the Human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT) Gene. Genes, 2016,18;7(8).
基金项目：江苏省重点研发计划（BE2015623）、国家自然科学基金（81272557）、江苏省自然科学基金（BK2012647）、江苏六大人才高峰项目（WSW-185）、江苏省“科教兴卫”工程医学重点人才科研项目（RC2011046）、徐州市医学领军人才基金（2010001）
论文作者:史振铎1，2,郝林1，2,贺厚光1,董洋1,周家合1
论文发表刊物:《医药前沿》2017年3月第9期
论文发表时间:2017/4/2
标签：前列腺癌论文; 蛋白论文; 前列腺论文; 徐州论文; 基因论文; 肿瘤论文; 组织论文; 《医药前沿》2017年3月第9期论文;