马伟光[1]1992年在《细胞因子对破骨细胞性骨吸收和成骨细胞增殖及成骨功能影响的体外研究》文中认为颌骨疾病是口腔颌面外科常见病之一，其主要病理变化是各种原因引起的骨吸收或骨缺损而造成颌骨功能障碍。本实验通过建立分离、培养破骨细胞和成骨细胞的方法。为进一步研究颌骨代谢生理、病理变化，骨生长因子的促骨生成作用，以及颌骨移植材料和口腔种植材料骨生物活性的体外研究提供了实验基础。 一、破骨细胞的分离、培养：采用机械法，从引产胎儿的长骨骨腔中分离出破骨细胞，进行培养。经组织形态学、光镜和相差显微镜观察，破骨细胞具有胞体大，多核，胞浆泡沫状间有空泡，胞浆有伪足样突起，并可移动，酸性磷酸酶反应阳性。将其与人股骨皮质骨片共同培养24小时左右，骨片上出现吸收陷窝，结果表明，本实验体外分离、培养人破骨细胞的方法是可行的。 二、成骨细胞的分离、培养：采用改良的酶消化法，从新生兔的颅骨中分离出成骨细胞，进行培养。除了在细胞形态学上对其鉴定外，还根据成骨细胞的生物学特性，首次引用了骨形成蛋白单克隆抗体(BMP—McAb)免疫细胞化学技术，以及碱性磷酸酶染色和含量测定，成骨细胞对甲状旁腺激素(PTH)-cAMP反应等方法，验证了经酶消化分离培养的兔颅骨细胞具有成骨细胞的功能和特性。可供实验使用。
吴菲菲[2]2013年在《鹿角盘提取物的体外抗骨质疏松作用》文中研究表明骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构退行性改变,骨的脆性增加,易于发生骨折为特征的全身代谢性骨骼疾病,多发于绝经后妇女及老年人。骨质疏松性骨折发病率高,严重威胁着人们的生命健康,并给社会和国家带来了沉重的经济负担。目前,用于治疗骨质疏松症的西药,如鲑鱼降钙素、双膦酸盐类和重组人甲状旁腺素等,具有明显的副作用且价格昂贵。因此,研究开发安全、高效、经济的抗骨质疏松症药物已成为目前的研究热点。据《神农本草经》记载,鹿角盘具有温补肝肾、强筋健骨、活血消肿等作用。经我们课题组前期的体内实验研究发现,鹿角盘微切助粉对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松症模型有明显且良好的治疗效果。但是,关于鹿角盘防治骨质疏松症的作用机制至今仍未有报道。因此,本论文旨在系统地研究鹿角盘提取物对体外培养的成骨细胞骨形成功能和破骨细胞骨吸收活性的影响,并进一步探讨其防治骨质疏松症的作用机制。具体研究内容和结果如下：(1)采用微切变-助剂互作技术加工制备鹿角盘微切助粉。然后经粒径分析及扫描电镜观察分析细胞的破碎程度,并检测其中与骨质疏松症相关的活性物质的含量。粒径分析及扫描电镜观察结果显示,经微切变-助剂互作技术处理后,鹿角盘微切助粉在粒径1-30μm范围内的颗粒数占82.73%,且细胞已被充分破碎,细胞内有效成分被暴露出来,呈释放的状态。活性物质含量分析结果显示,鹿角盘微切助粉中含有328.79士34.21pmol/L雌二醇、25.38士4.48nmol/L睾酮、17.56士3.45nmol/L孕酮,0.750±0.033μg/g类胰岛素生长因子-1,16.17±0.52mg/L柠檬酸钙和133.6±13.55mg/L钙,而不含有延胡索酸钙。且这些活性物质的含量均高于其粗粉,说明微切变-助剂互作技术增加了目标活性物质的溶出量,有利于鹿角盘中活性成分的释放,体现了该技术的优越性。(2)以人类成骨样细胞MG-63为研究对象,系统地研究了鹿角盘提取物(水提物和醇提物)对成骨细胞生长、分化和矿化的影响及其防治骨质疏松症的可能作用机制。LDH活性检测和细胞形态观察结果表明,鹿角盘提取物对成骨细胞没有细胞毒性作用。采用结晶紫试验、中性红吸收试验、台盼蓝排斥试验、MTT法和ALP活性检测考察细胞的生长和分化情况。结果表明,鹿角盘提取物不仅刺激了成骨细胞的生长和增殖,而且还促进了成骨细胞的分化。此外,茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测结果显示,鹿角盘提取物是通过促进钙的沉积和增加Ⅰ型胶原蛋白的合成和分泌,促进矿化骨基质的形成,从而发挥促进骨形成的作用。采用ELISA法和RT-PCR分别检测了OPG和RANKL的蛋白含量和mRNA的表达量,结果显示,鹿角盘提取物极显著地增加了成骨细胞中OPG蛋白含量和OPG mRNA的表达量,而降低了RANKL蛋白含量和RANKL mRNA的表达量,提高了成骨细胞中OPG/RANKL的比值,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟,从而起防治骨质疏松症的作用。(3)以RAW264.7细胞作为一种破骨前体细胞模型,诱导其分化成破骨细胞,并研究鹿角盘提取物对破骨细胞的形成和骨吸收活性的影响。TRAP染色和破骨细胞计数结果显示,用50ng/mL RANKL成功地诱导RAW264.7细胞分化成为成熟的破骨细胞。而且鹿角盘提取物可剂量依赖性地减少破骨细胞的数量,降低破骨细胞中TRAP的活性,从而抑制了RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成成熟的破骨细胞。LDH活性检验、PI染色和DNA碎片定量分析结果一致表明,鹿角盘提取物是通过诱导成熟的破骨细胞发生凋亡而抑制其活性。而且,RT-PCR检测结果表明鹿角盘提取物是通过下调破骨细胞表型基因TRAP mRNA和MMP-9mRNA的表达,来抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,从而起防治骨质疏松症的作用。(4)采用p38特异性抑制剂SB203580干预处理MG-63成骨细胞,进一步验证鹿角盘提取物的抗骨质疏松作用机制。用p38特异性抑制剂SB203580干预处理成骨细胞,然后采用MTT法、ALP法、茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测分别评价SB203580对成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响。结果表明,SB203580可以有效地阻断鹿角盘提取物对成骨细胞增殖、分化和矿化骨基质形成的促进作用。而且,用ELISA法和RT-PCR检测OPG和RANKL蛋白含量和基因的表达,结果显示鹿角盘提取物上调了OPG蛋白和mRNA的表达,下调了RANKL蛋白和mRNA的表达,且通过调控成骨细胞中OPG和RANKL的表达,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟。而SB203580能有效地阻断鹿角盘提取物对破骨细胞的抑制作用,提示鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路,双向影响成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡,从而起抗骨质疏松的作用。综上所述,本研究证实了鹿角盘提取物是通过调控p38MAPK信号通路来促进成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收,从而起抗骨质疏松的作用,为鹿角盘用于治疗骨质疏松症提供了理论依据。
郎红梅[3]2007年在《离体条件下低氧环境对破骨细胞生成及功能影响的实验研究》文中研究表明【研究背景】骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是以骨量减少,骨微结构破坏为特征,致使骨强度降低、骨脆性增加,易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。随着世界人口的老龄化,骨质疏松已成为全球关注的公共卫生问题之一。目前全世界约有2亿人患骨质疏松症,其发病率已跃居常见病、多发病第七位。我国于1999年进入老龄化社会,骨质疏松症发病率呈逐年上升趋势,目前已有八千八百万名患者,预计到今年年底将超过一亿。中国内地总患病率为百分之十二点四,老年人中患病比例超过一半以上,其中骨折发生率接近三分之一,骨质疏松不仅影响患者的生活质量,而且可导致脊柱、四肢等部位的骨折。年龄越大,骨折的风险性越高,该病引起的致残率、致死率较高。我国西部省区地处高原,约占全国陆地面积的一半,人口4亿多,占全国总人口近三分之一。高原地区由于海拔高,空气含氧量明显低于平原,特殊的高原环境对骨代谢的影响的研究结果显示:高原干燥、缺氧的环境对骨代谢有影响,平原人群到高原后不久会引起骨量丢失,在高原发生骨折会引起延迟愈合甚至不愈合。与低海拔地区相比,高海拔地区骨吸收增加,骨量减少。大量的研究表明表达于干细胞和成骨细胞表面的肿瘤坏死因子受体家族的NF-κB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和护骨素(osteoprotegerin ,OPG)在破骨细胞分化调节中起着重要的作用,许多局部因子通过调控OPG、RANKL和NF-κB受体活化因子(Receptor activator of NF-κB, RANK)之间的比例,介导破骨细胞生成并维持其功能。本研究从体外模拟低氧环境入手,探讨不同低氧浓度对破骨细胞生成及骨吸收功能的影响,试图从分子水平揭示低氧对破骨细胞分化的影响的可能机制,探讨低氧引起骨量丢失的可能的分子机制。【目的】通过在体外模拟不同海拔高度的低氧环境,观察不同氧浓度在不同时间点对小鼠骨髓细胞向破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。【方法】取出生2天内的新生小鼠,取其颅盖骨用组织块法培养成骨细胞,纯化后传代。取6~9周龄小鼠骨髓细胞,用含1,25(OH)2D3(10-8mol/L)、地塞米松(10-8mol/L)分化培养基在模拟不同海拔高度的氧浓度中培养。骨髓细胞纯化后加入第3~5代成骨细胞进行共培养,随机分组,每组样本数为4,选择不同时间点进行下面的实验,每项试验重复3次。用TRIzol提取细胞总RNA,用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测OPG、RANK及RANKL mRNA的表达;用Western blotting检测RANK蛋白的表达情况。缺氧48小时后用流式细胞仪检测小鼠破骨细胞的细胞周期;用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色和在骨片上形成骨吸收陷窝作为破骨细胞分化成熟的标志,利用酶动力方法测定培养上清液中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性。将小鼠骨髓细胞接种到无菌骨片上,随机放入不同氧浓度的低氧环境中进行培养,7天后取出,将骨片进行甲苯胺蓝染色,采用Olympus倒置光相差显微镜计数TRAP染色阳性多核细胞的数目;扫描电镜扫描骨吸收陷窝,通过Leica Quantimet 500图像分析仪处理不同低氧环境下破骨细胞所形成骨吸收陷窝数目及面积。【结果】1、氧浓度及缺氧时间对前破骨细胞上RANKmRNA和RANK蛋白的表达有显著影响(P<0.01)。缺氧第1天,各低氧组与常氧组相比无明显差异;缺氧第3天,各低氧组RANKmRNA和RANK蛋白的表达较常氧组增加(P<0.05),但各低氧组之间无明显差异;缺氧第5天,各低氧组RANKmRNA和RANK蛋白的表达较常氧组显著增加(P<0.01),其中3%氧浓度时表达增加最明显;缺氧第7天,各低氧组RANKmRNA和RANK蛋白的表达较常氧组显著增加(P<0.01),但与第5天相比,RANKmRNA和RANK蛋白的表达相对减弱。2、氧浓度及缺氧时间对成骨细胞上RANKLmRNA的表达有显著影响(P<0.01)。缺氧第1天,与常氧组相比,各低氧组RANKLmRNA表达明显增加(P<0.01),但各低氧组之间无明显差异;缺氧第3天,与常氧组相比,各低氧组RANKLmRNA的表达显著增加,以3%氧浓度升高最显著;在缺氧第5,7天,与常氧组相比,RANKLmRNA的表达明显增加(P<0.01),但与前三天相比,其表达较前减弱。3、氧浓度及缺氧时间对成骨细胞上OPGmRNA的表达有显著影响(P<0.01)。在缺氧第1天,与常氧组相比,各低氧组OPGmRNA表达明显减低(P<0.01),但各低氧组之间无明显差异;在缺氧第3天,与常氧组相比,各低氧组OPGmRNA表达明显减低(P<0.01),3%、1%氧浓度较6%氧浓度减低更明显,但二者之间无明显差异。在缺氧第5,7天,与常氧组相比,各低氧组OPGmRNA表达显著减低,且各低氧组之间的差异显著,以1%氧浓度减低最明显。4、随着氧浓度降低,骨吸收陷窝数目由7.58±1.08个/骨片升至9.67±0.98,12.50±1.45,11.00±0.85个/骨片(P<0.01);骨吸收陷窝面积由341.86±195.46μm2 /个增至470.62±207.89,688.08±429.02,583.27±224.54μm2 /个(P<0.01);抗酒石酸酸性磷酸酶的酶活力由3.87±1.58IU/L升至4.99±0.25,7.40±0.53,6.11±0.37IU/L(P<0.01)。5、氧浓度对破骨细胞周期有影响。在G1期,常氧组与低氧组之间破骨细胞细胞数含量比有明显差异(P<0.01),由81.13±1.31%减少到66.77±0.70%,73.60±0.76%和增加到84.87±1.60%;在G2期,常氧组与低氧组细胞数含量比有明显差异(P<O.O1),由8.57±0.48%增加到13.13±3.18%,14.20±0.44%和11.10±3.08%;在S期,常氧组细胞数含量比有明显差异(P<0.01),由10.63±1.17%升至20.17±3.36%,12.20±0.33%,1%氧浓度时降至6.56±0.39%。6、随着氧浓度的降低,200倍光镜下观察到的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞的数目由3.30±0.45个/玻片增加到6.10±0.55,7.90±0.42,5.00±0.61个/玻片(P<0.01)。【结论】1、氧浓度及缺氧时间对小鼠破骨细胞生成有显著影响。随着氧浓度降低,前破骨细胞向破骨细胞分化明显增加,与常氧组相比,破骨细胞核数增多,体积增大,以3%氧浓度增加最明显;随着缺氧时间延长,破骨细胞生成逐渐增多,以缺氧第5天增加最明显,以后随着缺氧时间延长破骨细胞生成相对减弱。2、氧浓度对小鼠破骨细胞骨吸收功能有显著影响,随着氧浓度降低,破骨细胞骨吸收功能逐渐增强,尤其在3%氧浓度时,破骨细胞骨吸收功能达到高峰,以后随着氧浓度降低骨吸收功能相对减弱。3、随着氧浓度降低,RANKL基因的表达先增多后减弱,OPG基因的表达随着氧浓度降低而降低,且呈时间依赖性,RANK基因的表达随着氧浓度的降低而增加,提示低氧促进破骨细胞的生成可能部分是通过RANKL/RANK/OPG系统实现的。
张元豫[4]2014年在《重组结核杆菌热休克蛋白10对骨代谢平衡分子机制影响的研究》文中提出目的：采用成骨细胞及破骨细胞培养体系，探索结核杆菌热休克蛋白10（Mtcpn10）是否通过参与成骨细胞增殖和破骨细胞生成，从而影响骨关节结核患者局部骨代谢平衡的分子机制，为骨结核骨质破坏基因治疗寻找新的治疗靶点。方法：1）建立体外人成骨细胞及破骨细胞培养体系：使用髂骨块体外培养获取成骨细胞，通过显微镜下细胞形态出现钙结节及碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定对其鉴定。破骨细胞通过外周静脉血单个核细胞，用含RANKL和M-CSF的α-MEM培养液重悬后接种在含有骨膜片和盖玻片孔板上，培养21d后获得获得破骨细胞，通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色和瑞氏-吉姆萨染色进行细胞形态鉴定，通过甲苯胺兰染色及电镜观察鉴定骨陷窝的形成；2）以10μg/mL、1μg/mL及0.1μg/mL不同浓度的r-Mtcpn10作用于上述体外培养的成骨细胞，观察成骨细胞的增殖、细胞周期、碱性磷酸酶活性及钙结节形成情况。应用Realtime-PCR方法检测成骨细胞OPGmRNA及RANKL mRNA，并用Western-blot免疫印迹法检测OPG及RANKL蛋白表达情况；3）以1μg/mL、0.1μg/mL及0.01μg/mL不同浓度r-Mtcpn10诱导实验组破骨细胞的形成，比较各组TRAP阳性多核细胞形态及数目、骨陷窝数量和面积、上清液中钙离子浓度，ELISA检测上清液中肿瘤坏死因子TNF-α浓度，应用Realtime-PCR方法检测破骨细胞NFATc1mRNA、c-Fos mRNA，Western-blot免疫印迹法分别检测其蛋白表达；4）建立人成骨细胞-外周血单核细胞共培养体系，用1μg/mL r-Mtcpn10作用于共培养体系，培养18d后观察破骨细胞大小和数量、骨陷窝数量和面积、上清液中钙离子浓度，应用Realtime-PCR方法检测NFATc1mRNA、ｃ-Fos mRNA、RANKL mRNA及OPG mRNA。结果：1）体外人成骨细胞及破骨细胞培养体系成功建立：成骨细胞培养25d后融合形成不透光矿化结节并染色阳性，第8d碱性磷酸酶染色呈蓝色沉淀，第10d碱性磷酸酶活性达到峰值随后下降；培养外周血单核细胞于第21d形成TRAP（+）破骨细胞，出现骨陷窝并释放钙离子。2）r-Mtcpn10对体外培养的成骨细胞增殖的影响：MTT实验检测比较各浓度实验组与对照组的成骨细胞增殖能力，结果显示r-Mtcpn10与成骨细胞的增殖活性间存在浓度-活性及时间-活性依赖关系，高浓度r-Mtcpn10及长时间的作用均能抑制成骨细胞的增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期结果显示，与对照组比较，经r-Mtcpn10处理的各浓度实验组G1期、G2期细胞数量明显增多，S期细胞数量明显减少，实验组G1期增长了8.12%（24h，P＜0.05）、22.77%（48h，P＜0.05），G2期增长了5.58%（24h，P＜0.05）、194%（48h，P＜0.05），S期减少了71.6%（24h，P＜0.05）、89.01%（48h，P＜0.05），PI减少了29.8%（24h，P＜0.05）、44.92%（48h，P＜0.05）；碱性磷酸酶活性测定结果显示，10μg/mL组降低6.33±1.67（7d，P<0.05）、6.97±1.40（10d，P<0.05），1μg/mL组降低4.95±1.57(7d，P<0.05）、5.68±1.23（10d，P<0.05）；高浓度r-Mtcpn10组（10μg/mL）钙结节形成的数量、面积、颜色均较对照组明显减少；Realtime-PCR实验结果显示，r-Mtcpn10浓度与OPG mRNA的表达相关，其中，10μg/mL组降低41.6%（48h，P＜0.05）、52.6%（72h，P＜0.05），1μg/mL组降低45.9%（48h，P＜0.05）、48.3%（72h，P＜0.05），0.1μg/mL组降低9.3%（48h，P＞0.05）、26.7%（72h，P＜0.05）；r-Mtcpn10浓度-时间依赖性增加了RANKL mRNA，10μg/mL组增加98.2%（48h，P＜0.05）、124%（72h，P＜0.05），1μg/mL组增加85.7%（48h，P＜0.05）、67.3%（72h，P＜0.05），0.1μg/mL组增加45.4%（72h，P＜0.05）；10μg/mL组RANKL蛋白随时间有相应的增加，而OPG蛋白表达降低。3）TNF-α浓度ELISA实验显示，不同浓度r-Mtcpn10作用于外周血单核细胞，各实验组与对照组TNF-α浓度差别无统计学意义（F=2.098，P＞0.05）；r-Mtcpn10对破骨细胞的形成的影响：形态学观察结果显示，除M-CSF实验组外，其他各实验组均见TRAP（+）破骨细胞和骨陷窝形成；与对照组比较，RANKL+r-Mtcpn10组和r-Mtcpn10组在破骨细胞数量（P＜0.05）、骨陷窝数量（P＜0.05）、骨陷窝面积（P＜0.05）、上清液钙离子浓度（P＜0.05）均明显增加；两组r-Mtcpn10为1μg/mL时破骨细胞细胞数量有统计学意义（P＜0.05），各组骨陷窝数量无统计学意义（P＞0.05）、骨陷窝面积有统计学意义（P＜0.05）；r-Mtcpn10浓度-时间依赖性增加NFATc1mRNA表达，各浓度组与对照组比较均有统计学意义（P＜0.05），与RANKL组比较，1μg/mL组表达无差异（P＞0.05）、0.1μg/mL组和0.01μg/mL组表达有差异（P＜0.05）；r-Mtcpn10增加c-Fos mRNA表达，与对照组比较，1μg/mL组表达增加了19倍（2h，P＜0.05）、0.1μg/mL组表达增加了7倍（2h，P＜0.05），各浓度组与RANKL组比较均有统计学意义（P＜0.05）；1μg/mL组NFATc1蛋白表达随时间而增加，c-Fos蛋白却降低。4）1μg/mL r-Mtcpn10对人成骨细胞-外周血单核细胞共培养体系的影响：r-Mtcpn10组和对照组均有TRAP（+）破骨细胞和骨陷窝生成，1μg/mL r-Mtcpn10组破骨细胞细胞数量、骨陷窝数量、骨陷窝面积及钙离子浓度与对照组比较，差别均有统计学意义（P＜0.05）；r-Mtcpn10组NFATc1mRNA、c-Fos mRNA、RANKL mRNA、OPG mRNA表达量分别为3.878±0.5748、0.4192±0.1030、2.832±0.3075、1.135±0.0457，除了c-Fos mRNA，与对照组比较均低于r-Mtcpn10组有统计学意义（P＜0.05）。结论：1）重组结核杆菌热休克蛋白10（r-Mtcpn10）可能通过阻滞细胞周期，抑制成骨细胞增殖，并通过降低碱性磷酸酶活性，促进成骨细胞RANKL mRNA表达，抑制OPG mRNA表达，因此降低OPG mRNA/RANKL mRNA比值抑制了成骨细胞的成骨能力；2）r-Mtcpn10可能通过上调NFATc1mRNA、c-Fos mRNA表达，激活NF-κB通道，促进破骨细胞的生成；3）在成骨细胞和单核细胞共培养体系中，r-Mtcpn10促进成骨细胞RANKL表达后，可能促进破骨前体细胞NFATc1和c-Fos表达，增加破骨细胞形成，为骨结核靶向基因治疗提供新的治疗靶点。
刘水涛[5]2011年在《体外冲击波对成骨细胞与破骨细胞共培养系中破骨细胞形成及活性影响的研究》文中提出目的:健康骨骼处于成骨细胞(osteoblast, OB)骨形成与破骨细胞(osteoclast, OC)骨吸收动态平衡的状态,这种平衡一旦被打破可导致骨质疏松(osteoporosis)、骨硬化病(osteopetrosis)等多种骨代谢性疾病。力学刺激在调节骨骼重塑和维持骨量方面具有重要的作用,以往研究已证明有效力学刺激能促进成骨。破骨细胞是唯一具有骨吸收功能的细胞,它由来源于单核/巨噬细胞谱系(monocyte/macrophage lineage),通过多个单核的祖细胞融合形成多核巨细胞。力学刺激对破骨细胞形成和活性的影响研究少见。体外冲击波(Extracorporeal Shock Wave,ESW)是由压力瞬间急剧变化产生的一种机械波,它产生的能量可经相应仪器二次聚焦形成高能量冲击波,产生治疗作用。体外冲击波具有可定量作用于治疗部位、无创、并发症少、治疗周期短、风险低等许多优势。实验研究发现适宜能量的冲击波可以增加成骨细胞的成骨活性,进而促进骨折愈合。但冲击波作为一种能量刺激形式,对破骨细胞的形成及骨吸收活性的影响,目前未见国内外有相关研究。本实验通过将体外冲击波作用于成骨细胞与破骨前体细胞共培养体系,模拟破骨细胞在体内与成骨细胞相互作用的环境,通过观察破骨细胞形成过程中的形态变化、RT-PCR分析形成过程中调控基因的表达水平、ELISA检测破骨细胞特异性蛋白分泌水平及电镜下定量分析其骨吸收能力,探讨冲击波对破骨细胞形成及骨吸收作用的影响。方法:1骨髓血分离hMSCs及成骨诱导:选择10名志愿者(排除代谢性疾病),各抽取骨髓20ml,梯度离心法获得hMSCs,常规培养1周后获得大量hMSCs,采用经典成骨培养基(10nM地塞米松、50uM抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠)经4周诱导,获得成骨细胞,ALP染色、茜素红染色验证成骨细胞活性。2成骨细胞和破骨细胞共培养体系建立:10名志愿者再次骨髓穿刺获得骨髓血20ml,密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMCs)。将BMMCs加入预先放置骨片的悬挂式培养皿,培养液中加入0.1μM的1,25(OH)2VD3为破骨诱导剂。由此建立底层为成骨细胞,上层为破骨细胞,大分子能相互影响的共培养系统。3体外冲击波对共培养系中破骨细胞的作用:BMMCs贴壁后12小时,使用500频次0.12mJ/mm2的体外冲击波对培养系进行干预,在光镜下连续观察细胞形态变化,培养一周后ELISA法分析检测培养液中组织蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b、白细胞介素1β,肿瘤坏死因子α的含量,RT-PCR分析破骨细胞RANK,NFATc1和c-Fos表达水平,行TRAP染色,定量分析ESW对破骨细胞形态及融合的影响,骨片电镜扫描分析骨陷窝数量及面积。以单个核细胞单独培养ESW干预组,单独培养组及共培养非干预组组为对照。对所有数据x±s表示统计学分析,方差分析比较其差异,设定P<0.05为有统计学意义。结果:1骨髓间充质干细胞经成骨诱导28天后,经ALP和茜素红染色,可见钙结节,证明已获得高活性成骨细胞。加入单个核细胞建立共培养体系后,各组单个核细胞在1-3天都可见聚集趋势,聚集密度2-10个不等,但此时仍可见细胞膜完整,未发生融合。4-6天可见细胞逐渐融合,形成2-6个核不等的多个核巨细胞。经ESW干预组与未干预组相比,细胞融合发生较晚,融合后形成的细胞核数量较少。2 ELISA法检测破骨细胞特异性蛋白分泌水平,共培养干预组组织蛋白酶K 2.23±0.35ng/ml,TRAP 5b 1.53±0.29ng/ml,IL1β53.28±7.45 ng/ml,TNFα5.87±0.80ng/ml,经统计学分析发现明显低于非ESW干预组,但高于BMMC单独培养ESW干预组(P<0.05),显示共培养中成骨细胞分泌的相关因子促进了破骨细胞特异性蛋白的分泌,但ESW对这些蛋白的分泌有抑制作用。RT-PCR检测RANK,NFATc1和c-Fos基因表达水平,冲击波干预组荧光亮度低于未干预组,证明冲击波抑制了破骨细胞形成过程中关键基因的表达。3培养后的单个核细胞经TRAP染色,各组细胞均被染为酒红色,证明各组均表达特异性抗酒石酸酸性磷酸酶,所产生的细胞为破骨细胞。破骨细胞融合指数ESW干预共培养组为0.46±0.10,未干预组为0.73±0.14,两者间有显著性差异,证明ESW抑制了共培养系中BMMC的融合(P<0.05)。扫描电镜分析骨陷窝面积,ESW干预共培养组为12963±952μm2,未干预组为16257±1423μm2,两者之间的差别具有统计学意义(P<0.05)。证明ESW干预后破骨细胞骨吸收能力降低。结论:1采用成骨细胞及BMMCs诱导培养可建立人成骨细胞与破骨细胞共培养体系,可获得足够破骨细胞用于体外研究。2在共培养系中,成骨细胞具有促进BMMCs融合生成破骨细胞的作用。3 ESW可有效抑制共培养系中破骨细胞形成相关基因表达、特异性蛋白分泌、抑制其骨吸收能力,ESW对破骨细胞的形成及活性具有明显的抑制作用。
韩大庆[6]2006年在《破骨细胞完善体外类骨组织重建的探索性研究》文中研究指明近来，越来越多的证据明确表明了破骨细胞的调节作用对于正常的骨形成是至关重要的。破骨细胞缺乏动物所表现出来的骨形成异常在目前的组织工程化骨中也都有所反映。因此，破骨细胞参与到骨体外重建策略中来不仅能洞察移植后骨重塑以及成骨细胞和破骨细胞相互作用，而且也能为完善组织工程化骨提供必要的解决办法。本研究主要探索既符合生理过程又实际有效的破骨细胞引入途径。目的：1)获取破骨细胞前体(融合前破骨细胞，pOCs)并描述其生物学特征；2)实验分析成骨细胞的分化程度与pOCs成熟的关系；3)建立创新的破骨细胞在组织工程化骨生成方法；4)观察破骨细胞的生成，功能表达，以及对支架类骨结构的影响。方法：2个月昆明鼠全骨髓细胞与新生鼠原代颅骨成骨细胞共同培养在含有1，25(OH)_2 D_3的培养液中6天。通过轻轻吹打新加的介质，打下黏附不紧密的细胞作为pOCs使用。当这种细胞悬液接种于培养板，半小时后经抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和碱性磷酸酶(ALP)染色，确定pOCs的存在和数目以及有无多核细胞和成骨细胞的混杂。TRAP荧光染色进一步对结果进行确认。通过融合试验来研究原代成骨细胞对pOCs融合的影响。为了研究成骨细胞分化程度与pOCs成熟的关系，成骨细胞系MC3T3-El细胞被接种到培养板，使用成骨介质培养到细胞汇聚(4d)、矿化开始(16d)和高度矿化(28d)，矿化是通过茜素红染色来判定。这三种培养物分别代表骨形成过程中细胞增殖、基质沉积和成熟以及基质矿化。pOCs分别接种到三种培养物，在生长介质中共培养3d。然后进行TRAP染色确定类破骨细胞的形成；纤维肌动蛋白(F-actin)荧光染色判断其吸收活性。在建立破骨细胞符合生理过程引入实验中，MC3T3-El细胞首先接种于支架上，在成骨介质中培养5w和12w，接着pOCs分别接种到低矿化(5w)和高矿化(12w)支架结构上，在生长介质中培养3d和8d。支架的矿化程度通过支架上磷含量检测来判定。然后进行无任何处理的环境扫描电镜(ESEM)和一般电镜检测(SEM)，观察类破骨细胞的形成和功能表达；支架切片F-actin荧光染色判断其吸收活性。结果：在pOCs制备物中，没发现多核细胞和ALP阳性的成骨细胞，TRAP阳性细胞约占接种细胞总数的60％。融合试验表明成骨细胞的存在对于pOCs融合是必不可少的。在分析成骨细胞分化与pOCs成熟关系实验中，在高度矿化培养物中，可见到大小不等的矿化结节。结节的矿化程度可用透光度来表示。这些结节，依其透光度，可分为带有黑色纹理的不充分矿化结节、除边缘以外全黑的相对充分矿化结节和全黑的充分矿化结节。TRAP染色后，在增殖期和刚矿化共培养物中，TRAP阳性细胞分散存在，没发现大于两个核的TRAP阳性细胞。在高度矿化共培养物中，可见到TRAP阳性细胞聚集在为数很少的大的不充分和相对充分矿化结节周围。约95％大于两个核TRAP阳性细胞在这样的细胞中存在。这表明pOCs的成熟不仅与基质的矿化有关也与矿化量有关。聚集在相对充分矿化结节周围的TRAP阳性细胞有向其集中的趋势。大的充分矿化结节周围无明显细胞聚集现象；但一些原本不透光的结节却有不同程度的TRAP染色。这种TRAP染色结节说明矿物有吸收；间接反映了所形成的类破骨细胞有骨吸收活性。细胞在大矿化结节周围分布的差异反映了在大小类似的情况下，结节矿化程度越高，对周围的TRAP阳性细胞的趋化能力越强。F-actin荧光染色显示了在大矿化节结上F-actin环的出现，这是破骨细胞具有吸收活性的特征标志，直接证明了所形成的类破骨细胞具有骨吸收活性。在研究破骨细胞生理引入实验中，通过ESEM和SEM观察到各种形态的类破骨细胞生成。在高度矿化支架结构上(12周)，类破骨细胞更容易发现并且尺寸更大；这可能是类破骨细胞的形成与骨基质功能状态相适应的反映。而且使用ESEM观察到正在吸收的类破骨细胞，这个细胞展示了面向骨面的细胞膜特化结构—皱褶缘和封闭区及其足体，同时吸收坑也清晰可见。这无疑表明使用这一策略产生的类破骨细胞能够吸收由成骨细胞在体外产生的类骨基质。支架切片F-actin荧光染色显示了F-actin环的出现，进一步确认类破骨细胞的吸收活性。在原本总是被成骨细胞异常生长所形成的膜状或条索状结构占据的支架孔壁上，出现巨大的细胞融合体。在类破骨细胞出现的地方，观察不到明显的成骨细胞异常生长结构。这些现象表明类破骨细胞能以某种方式去除异常细胞结构。结论：1)通过机械分离从破骨细胞分化培养物中获取pOCs是一种简单、有效的获取破骨细胞来源细胞的方法。2)在模拟骨组织发育和形成过程中，pOCs的成熟需要骨基质的形成和累积。3)由pOCs在细胞矿化支架结构上生成破骨细胞是生理、有效、可行的破骨细胞引入方法。4)破骨细胞的引入可以起到改善组织工程化骨结构的作用。
薛黎明[7]2012年在《基于蛋白质组学淫羊藿苷防治骨质疏松作用机理及药对“淫羊藿仙茅”配伍机制研究》文中研究表明淫羊藿仙茅是临床常用的温补肾阳的药对。两药均为我国传统中药，2010版《中华人民共和国药典》中均有收录。淫羊藿和仙茅配伍相须为用，相得益彰。使补肾壮阳，强筋健骨，祛风除湿功力增强。淫羊藿的抗骨质疏松作用已有较多报道，其活性部位淫羊藿总黄酮和活性成分淫羊藿苷能显著促进成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性，减少骨质的丢失；能促进下丘脑，海马及骨组织中雌激素受体(ER)表达和增强骨组织护骨素(OPG)表达。仙茅作为补肾壮阳的药物，具有确切的防治骨质疏松作用。仙茅能够抑制骨吸收、降低去卵巢大鼠的骨丢失；仙茅苯甲酸酯类总酚苷能够增加成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性；仙茅苷降低破骨细胞的形成分化和抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。仙茅酚苷类成分具有抗氧化、调节免疫和植物雌激素等作用。本实验在明确二仙汤对骨质疏松确切防治作用的基础上，对二仙汤内君药药对淫羊藿仙茅抗骨质疏松的配伍机制进行了研究。主要包括：一、基于蛋白组学研究淫羊藿苷防治骨质疏松作用机理淫羊藿苷对下丘脑-垂体-性腺(甲状腺，肾上腺)轴靶器官(下丘脑，垂体，子宫，骨骼)的蛋白质组学结果显示，差异蛋白功能与细胞凋亡，能量代谢，细胞骨架，蛋白质聚集、折叠，分子伴侣，氧化应激以及MAPK通路等相关。揭示淫羊藿苷多靶点、多途径的作用机制。二、淫羊藿仙茅药对抗骨质疏松活性成分筛选本研究考察了淫羊藿苷、淫羊藿次苷、宝藿苷和朝藿定C、仙茅苷、仙茅素、苔黑酚葡萄糖苷和苔黑酚龙胆二糖苷的成骨细胞活性和破骨细胞活性。主要内容为对新生大鼠颅盖骨成骨细胞成骨细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性的影响；对新生大鼠颅盖骨成骨细胞为模型，骨髓单核细胞经1,25-(OH)2-VD3和地塞米松共同诱导而得到的破骨细胞进行TRAP酶活性的影响；并观察了对骨髓单核细胞经细胞因子M-SCF、RANKL诱导的破骨细胞和成骨细胞的细胞线粒体膜电势、细胞内ATP含量及细胞骨架结构的影响，筛选得出仙茅苷和淫羊藿苷的作用明显。三、淫羊藿总黄酮及仙茅苯甲酸酯类总酚苷配伍防治骨质疏松作用研究本研究采用去卵巢骨质疏松大鼠模型(OVX)，通过骨密度，骨组织形态计量学，血清、尿液骨相关生化指标(Ca、P、Cr含量，ALP活性，孕激素含量)，血清中氧化应激相关酶活性(谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶)及丙二醛的含量)等指标来考察淫羊藿总黄酮、仙茅苯甲酸酯类总酚苷以及配伍前后防治骨质疏松的作用；通过观察靶器官(子宫、阴道、乳腺)切片和考察这些中器官雌激素表达的变化，确定淫羊藿总黄酮和仙茅苯甲酸酯类总酚苷以及配伍后有无显著毒性作用。结果显示，不论是有效性或安全性，配伍后均体现为相加作用。我们还通过代谢组学考察了OVX大鼠和给药大鼠血浆及尿液中代谢产物变化，结果显示，淫羊藿总黄酮组以及配伍组能显著改善OVX导致的尿液和血液的代谢物变化这些显著变化的代谢物仙茅苯甲酸酯类总酚苷主要与能量代谢、氨基酸代谢、氧化应激和脂肪代谢相关。四、淫羊藿苷和仙茅苷防治骨质疏松配伍作用研究根据蛋白组研究结果，骨质疏松参与调控能量代谢、细胞骨架形成。因此，我们观察了淫羊藿苷和仙茅苷以及配伍对成骨细胞和破骨细胞作用线粒体膜电势，ATP含量以及细胞骨架的作用。结果显示，成骨细胞活性包括(增殖、ALP活性，骨结节)体现相加关系，破骨细胞活性(破骨细胞数目，TRAP活性，CK活性)体现显著的协同作用。依据骨质疏松发生的原理，进一步考察了淫羊藿苷和仙茅苷以及配伍对破骨细胞MAPK通路及OPG/RANKL通路的影响。结果显示显著的协同作用。综上所述，骨质疏松与能量代谢、细胞骨架关系密切。淫羊藿总黄酮和仙茅苯甲酸酯类总酚苷配伍，对骨质疏松整体动物有效性和安全性总体呈现相加作用。淫羊藿苷和仙茅苷配伍对成骨细胞活性体现相加作用，破骨细胞活性体现协同作用。本实验为复方二仙汤有效成分间的关联性研究提供方法和思路。
翟赞京[8]2015年在《双向调控骨吸收和骨生成防治骨溶解疾病的新手段》文中认为背景和目的无菌性松动是人工关节置换远期失效的主要原因,而磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解则是造成无菌性松动的罪魁祸首。这一过程的发生与以下三个因素密切相关:炎性因子浸润、骨吸收亢进及骨生成障碍。三者相互促进,我们对任何一方的轻视,都将在无菌性松动的防治中付出代价。与此同时,感染也是关节置换的主要并发症之一,其结果具有灾难性,假体常需取出,并行二次翻修术。研究表明,内植物表面细菌黏附和生物膜的形成是假体感染形成的关键环节。而矛盾的是,骨内植物需满足良好的生物相容性,促进成骨细胞黏附以利于骨整合,但这无疑又会促进细菌黏附进而增加感染的机会。因此,理想的骨内植物材料需兼顾促进骨整合和抗感染活性。本课题拟针对磨损颗粒诱导骨溶解的发生机制,从对抗炎症因子释放、抑制骨吸收及促进骨形成的角度出发,探讨镁降解产生的局部微环境在防治假体无菌性松动中的潜在应用价值。并观察镁作为骨内植物的抗感染性能。同时,从调控机体全身骨代谢为出发点,探讨植物天然提取物穿心莲内酯(Andrographolide)的全身骨保护作用。以期从局部及全身出发,对抗磨损颗粒诱导骨溶解的发生,为防治假体无菌性松动提供新手段。内容与方法1.按照国标ISO10993浸泡镁(99.9%)模拟镁降解产物(Magnesium Degradation,Mg D),观察镁降解产物对单核-巨噬细胞(BMMS)增殖、破骨细胞分化及骨吸收功能的影响,探讨其引起的破骨细胞应答反应;建立磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型,利用micro-CT、组织形态计量等评价镁降解产物对骨溶解的抑制效果。观察镁降解产物对骨髓间充质干细胞(BMSC)粘附、铺展、增殖及向成骨细胞分化的影响,探讨其引起的h BMSC应答反应。2.体外观察镁(99.9%)的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)效果,建立SD大鼠骨髓炎模型,将镁棒作为髓内钉放入大鼠髓腔内,观察对骨髓炎的治疗效果和周围骨量的改变,并探讨作用机制。3.通过观察Andrographolide对成骨细胞和破骨细胞分化及功能的影响,探讨其引起的骨应答反应,并阐述其作用机制;建立磨损颗粒诱导局部骨溶解模型和LPS诱导全身炎症性骨丢失模型,腹腔注射Andrographolide,利用micro-CT、组织形态计量等评价Andrographolide对小鼠局部和全身的骨保护作用。结果1.镁降解产物通过抑制破骨细胞特异性转录因子NFATc1的转录活性,进而显著抑制破骨细胞形成和骨吸收功能;在磨损颗粒诱导骨溶解小鼠体内,镁降解产物降低组织中活化破骨细胞数量和炎症因子TNF-?、IL-1β及RANKL水平,显著抑制骨丢失。此外,镁降解产物提高BMSC表面integrinα3/α5/β1表达水平,促进BMP2下游SMADs复合物核转位,增强BMSC增殖、黏附及成骨分化功能,但并不利于胞外钙沉积。2.镁在体外显著抑制MRSA的粘附和生物膜的形成,这可能得益于镁降解产生的碱性环境。同时,镁植入骨髓腔后显著抑制骨髓炎的进展,并有大量新生骨。3.体外研究发现,Andrographolide通过抑制RANKL下游p65入核和ERK磷酸化,进而发挥抑制破骨细胞功能的作用。与此同时,Andrographolide提高成骨标志性基因的表达和OPG/RANKL水平,促进成骨分化,促进骨代谢向骨生成方向发展。在LPS诱导的全身性骨丢失和磨损颗粒诱导局部骨溶解中,Andrographolide显著改善炎症浸润和骨溶解,骨小梁表面破骨细胞数量显著减少,显示出良好的骨保护作用。结论1.镁降解产生的微环境可抑制破骨细胞分化和骨吸收功能,促进BMSC增殖、粘附和成骨分化,降低炎症因子水平,对抗骨溶解发生机制,抑制磨损颗粒诱导的局部骨丢失。镁可能成为未来防治骨溶解疾病的新手段。2.镁在体外抑制MRSA粘附和生物膜形成,在体内抑制骨髓炎进展并减少感染周围骨丢失。3.Andrographolide抑制破骨细胞分化和骨吸收,促进成骨分化,在全身水平降低炎症水平,正向调节骨代谢,具有显著的全身骨保护作用。
毛翠平[9]2006年在《基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学评价方法的建立》文中认为骨质疏松症是危害人类健康的主要疾病之一,寻找切实有效的抗骨质疏松药物已成为当今医学领域的重大课题。传统中药里有许多活性物质具有抗骨质疏松作用,又因其具有副作用小等优点,在治疗骨质疏松中发挥着越来越重要的作用。但长期以来,临床医生只是凭经验使用中药来治疗疾病,中药成分复杂,即便是临床上经常使用的中药,也很少有人去研究它们的作用机制。目前中药现代化的实现和细胞培养技术的逐步发展,使得在更深的层次上研究中药的药理作用成为可能。本研究的目的就是建立一种基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学的评价方法。 首先,建立成骨细胞和破骨细胞的体外培养方法。通过酶消化法获得新生大鼠的成骨细胞。通过碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞;用1,25(OH)_2D_3诱导骨髓单核细胞获得破骨细胞,并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色进行鉴定。最后应用激光共聚焦显微技术,Bodipy FL Phallacidin荧光抗体和碘化丙啶(PI)进行标记后,观察两种细胞的细胞骨架F-actin。 然后本文采用传统血清药理学的方法制备含药血清,并对这一方法进行了改进。传统的方法是对成年大鼠直接灌胃给药,一段时间后取血制备含药血清。我们知道,骨质疏松症有很大一部分发生在绝经后的女性,雌激素的下降对骨质疏松症有着明显的作用。而本文在灌胃前将雌性SD大鼠进行去势处理,消除血清中雌激素的影响,从而更好的研究血清中的药物成分对细胞功能的影响。 再次,我们用体外培养的成骨细胞,建立了抗骨质疏松中药作用于骨形成的药效学评价方法。通过WST-1检测细胞代谢情况与增殖活力,用酶标仪检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶和胰岛素样生长因子的功能。最后加入龟鹿复方不同剂量组10%含药血清,观察其对成骨细胞各项功能指标的影响。结果发现,高剂量组血清可明显促进成骨细胞增殖、ALP活性和IGF-1的分泌,说明龟鹿复方可以促进成骨细胞的骨形成。 最后,我们用体外培养的破骨细胞,建立抗骨质疏松中药作用于骨吸收的药效学评价方法。我们用扫描电镜(Scanning Microscope)技术观察破骨细胞形成的骨凹陷;同时检测TRAP(+)细胞数和破骨细胞TRAP活性。最后加入龟鹿复方含药血清进行干预,方法同成骨细胞。结果表明,中剂量组血清可明显抑制骨髓细胞向破骨细胞转化,抑制骨凹陷形成,降低细胞内TRAP的活性,减少TRAP(+)细胞数。说明龟鹿复方可以抑
刘梅洁[10]2006年在《左归丸对破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL表达的影响》文中进行了进一步梳理目的 采用成骨细胞与破骨细胞培养的方法,从破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL变化的角度,部分揭示左归丸治疗骨质疏松症的作用机制,并为中医“肾主骨”机理的研究提供科学依据。 方法 1 左归丸含药血清的制备 将15只雌性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组、卵巢切除(OVX)组、OVX加左归丸组,每组5只。 OVX组和OVX加左归丸组:摘除这两组大鼠的双侧卵巢。在术后3个月,OVX加左归丸组大鼠灌服左归丸,一日2次,连续5次,于末次给药后1h,乙醚麻醉,无菌条件下,经腹主动脉采血,冷置1h后,离心(2500r/min,25min),分离血清,是为含药血清,-20℃冰箱保存备用。 OVX组和正常对照组按以上程序,灌服等容积的蒸馏水,所取血清分别为OVX组血清和正常对照组血清。 2 破骨细胞所致骨吸收陷窝数目及面积的检测 2.1 成骨细胞与破骨细胞共同培养 在超净台内对96孔细胞培养板进行改装,在培养孔侧壁中部打孔,使相邻的两孔相通:其中一孔为成骨细胞培养室,另一孔为破骨细胞培养室,紫外线照射2h,做共培养用。 取第3代生长良好的成骨细胞,经胰酶消化,以终浓度1×10~4/ml接种到96孔细胞培养板的成骨细胞培养室,24h后细胞已牢固贴于孔底,然后将吸附破骨细胞的骨片加入破骨细胞培养室,置37℃,5%CO_2培养箱中共同培养。 2.2 分组及含药血清的添加 本实验分为6组:破骨细胞(OC)+正常血清组、OC+OVX血清组、OC+OVX含药血清组、OB+OC+正常血清组、OB+OC+OVX血清组、OB+OC+OVX含药
参考文献：
[1]. 细胞因子对破骨细胞性骨吸收和成骨细胞增殖及成骨功能影响的体外研究[D]. 马伟光. 第四军医大学. 1992
[2]. 鹿角盘提取物的体外抗骨质疏松作用[D]. 吴菲菲. 大连理工大学. 2013
[3]. 离体条件下低氧环境对破骨细胞生成及功能影响的实验研究[D]. 郎红梅. 第三军医大学. 2007
[4]. 重组结核杆菌热休克蛋白10对骨代谢平衡分子机制影响的研究[D]. 张元豫. 新疆医科大学. 2014
[5]. 体外冲击波对成骨细胞与破骨细胞共培养系中破骨细胞形成及活性影响的研究[D]. 刘水涛. 河北医科大学. 2011
[6]. 破骨细胞完善体外类骨组织重建的探索性研究[D]. 韩大庆. 中国协和医科大学. 2006
[7]. 基于蛋白质组学淫羊藿苷防治骨质疏松作用机理及药对“淫羊藿仙茅”配伍机制研究[D]. 薛黎明. 第二军医大学. 2012
[8]. 双向调控骨吸收和骨生成防治骨溶解疾病的新手段[D]. 翟赞京. 上海交通大学. 2015
[9]. 基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学评价方法的建立[D]. 毛翠平. 浙江大学. 2006
[10]. 左归丸对破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL表达的影响[D]. 刘梅洁. 中国中医科学院. 2006
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