刘霞[1]2003年在《采用组织工程技术体外再造心肌组织的初步研究》文中研究指明本研究应用微载体技术和旋转生物反应器(RCCS)规模化培养心肌细胞，在体外模拟微重力条件下构建心肌细胞-支架材料复合体，探索组织工程化心肌组织体外再造的可行性，为生理学和药理学研究提供叁维体外模型。实验应用国产支架材料，对采用组织工程技术建造组织工程化心肌组织进行了研究，主要包括以下叁个部分：1．对中科院化学所研制的聚乙交酯-丙交酯(PLGA)泡沫材料进行了生物学评价。2．新生大鼠心肌细胞的分离、纯化及培养。3．采用组织工程技术体外建造组织工程化心肌组织的实验研究。研究方法及结果简述如下： 第一部分，对中科院化学所研制的PLGA多孔支架材料进行了细胞毒性实验以及肌内植入实验，对其生物相容性进行了检测和评价，结果表明PLGA支架材料具有良好的生物相容性，从而为该聚合材料作为心肌细胞的支架材料提供了必要的安全性依据。 第二部分，进行心肌组织工程种子细胞的获取与纯化研究。采用胰蛋白酶顺序消化法及差速贴壁法从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞，观测心肌细胞的形态、搏动状态和反映心肌细胞代谢状况的生化参数，如葡萄糖比消耗率、乳酸比产率、乳酸转化率。结果表明，分离所得的心肌细胞纯度高，在培养的第3d就开始自发搏动，以后连接成片，进而同步收缩，细胞代谢旺盛。 第叁部分，研究心肌细胞与多孔材料的复合体。将心肌细胞与PLGA的复合体常规培养以及在RCCS中进行培养，动态观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化，并将它们与正常心肌组织和二维培养的心肌细胞进行比较。同时以Cytodex-3为心肌细胞的体外培育载体，观察心肌细胞-Cytodex-3微载体在体外微重力条件下自发形成组织样叁维结构的能力和过程。结果表明，在RCCS中培养的组织工程化心肌组织具有心肌的特殊超微结构，包括肌丝，Z线，大量糖原颗粒和发达的线粒体，免疫组化显示组织中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性，在复合体的周边区域细胞较致密，形态均一，形成了多层心肌细胞结构，细胞与细胞间以及细胞与多孔材料间都相互连接而形成了叁维结构。常规培养的复合体中细胞较少且排列疏松。与常规培养相比，RCCS中复合体的细胞代谢更加旺盛。Cytodex-3微载体上的心肌细胞于接种后的12h即已贴附于微载体上，细胞间相互连接，细胞代谢比较旺盛。 结果表明，心肌细胞在体外模拟微重力条件下具有自发形成叁维心肌组织样结构的内在能力，说明采用组织工程技术应用PLGA支架可以在RCCS中培育出组织工程化心肌组织。
王静[2]2007年在《构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究》文中指出组织工程是一门正在迅速发展的学科,它的目标是结合细胞、生物材料和生物活性分子来制造、修复甚至替代组织和器官。心肌组织工程是组织工程研究领域的热点之一。近年来,心肌组织工程研究发展迅速,要保证工程化心肌组织在体内移植后存活并发挥功能,充分的血液供应和完善的神经支配起着重要作用。到目前为止,工程化心肌组织的血管化研究进展顺利,而其神经支配研究由于神经系统的复杂性及缺乏合适的体外模型,目前尚未见报道,本研究拟对组织工程化心肌的神经支配问题进行初步的探索性研究。本研究第一部分首先采用NGF诱导的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠的心室肌细胞共培养,进行二维培养条件下心肌细胞的神经支配研究,探索NGF诱导的交感神经元样PC12细胞作为体外再造心肌神经支配研究模型的可行性;第二部分以液态胶原为支架,以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,体外构建适用于临床修复治疗用的工程化心肌组织片层;第叁部分以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,以液态胶原为支架材料,构建工程化心肌组织;同时在其中添加PC12细胞,利用NGF诱导使PC12细胞在工程化心肌环境中分化为交感神经元样细胞,观察神经细胞与心肌细胞之间的关系,并进行初步的组织学鉴定与超微结构观察,对工程化心肌组织的神经支配进行初步探索性研究。通过上述研究我们发现,在二维共培养模型中,NGF诱导的交感神经元样PC12细胞长出神经突起,突起及其上的膨体并能够到达跳动的心肌细胞表面,神经突起随心肌细胞一起跳动;采用新生大鼠心肌细胞与液态Ⅰ型胶原复合方式可以在体外再造出片层状心肌组织,构建的组织工程化心肌片层具有心肌组织类似的结构和特性;PC12细胞与心肌细胞在叁维条件下共培养,神经细胞生长的神经突起呈放射状到达心肌细胞的表面,与心肌细胞一起跳动,并在超微结构上形成类似突触的结构。本研究结果表明,采用神经元样PC12细胞作为组织工程化心肌神经支配的模型是可行的,神经细胞与心肌细胞可能有支配关系存在。本研究是对心肌组织工程神经支配研究的首次探索性。具体研究内容如下:第一部分:NGF诱导后的交感神经元样PC12细胞与新生大鼠心肌细胞共培养的实验研究第二部分:以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞构建工程化心肌组织片层的实验研究。第叁部分:构建具有神经支配的工程化心肌组织的初步研究
金姬[3]2008年在《构建组织工程化血管化心肌组织的实验研究》文中提出组织工程是一门正在迅速发展的学科,它的目标是结合细胞、生物材料和生物活性分子来制造、修复甚至替代组织和器官。心肌组织工程是组织工程研究领域的热点之一。近年来,心肌组织工程研究发展迅速,要保证工程化心肌组织在体内移植后存活并发挥功能,及时充分的血液供应起着重要作用。在组织工程化心肌血管化研究方面常使用的方法有:细胞支架材料复合体中添加促血管生长因子、心肌细胞支架材料复合体中添加内皮细胞、将复合体移植到体内血运丰富的部位来促进其血管化等。血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞,到目前为止,通过在心肌细胞和支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。本研究首先尝试分离培养人脐静脉来源的内皮细胞,并与细胞外基质凝胶混合制备组织工程化内皮片层,探索内皮细胞能否在细胞外基质凝胶中存活,并形成一定结构;然后以细胞外基质凝胶为支架,以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,体外构建适用于临床修复治疗用的组织工程化心肌片层;最后以新生大鼠心室肌细胞与人脐静脉内皮细胞为种子细胞,以细胞外基质凝胶为支架材料,并施以静态拉伸,混合构建组织工程化血管化心肌片层。观察内皮细胞和心肌细胞之间相互作用的关系,并进行初步的组织学鉴定与超微结构观察,对组织工程化心肌片层的血管化进行初步探索性研究。本实验尝试以细胞外基质凝胶为支架加入人脐带来源的内皮细胞构建组织工程化心肌片层,并施以静态拉伸力,不但可以使构建的组织工程化心肌片层更为稳定,同时也可以使再造的组织体外维持一定的张力,增强了再造组织的致密性和质量,以期使组织工程化心肌能够在移植后快速的血管化,提高细胞存活率,更好的应用于临床,相关研究未见报道。通过上述研究,我们发现在叁维培养模型中,人脐静脉来源的内皮细胞在支架中生长状态良好,随着体外培养时间的延长,支架材料内的血管内皮细胞逐渐聚集并形成条索样的血管组织,采用新生大鼠心室肌细胞与细胞外基质凝胶复合方式可以在体外再造出片层状心肌组织,构建的组织工程化心肌片层具有心肌组织类似的结构和特性。在叁维共培养模型中,可观察到心肌细胞在支架内活力良好(包括跳动强度,活细胞数量、死细胞数量、心肌形成质量、收缩频率、细胞凋亡率),通过细胞凋亡检测发现支架内心肌细胞凋亡少,明显优于单纯心肌细胞组(P＜0.05,t检验)。随着体外培养时间的延长,支架材料内的心肌细胞逐渐聚集并发育成心肌组织,心肌组织质量优于单纯心肌培养组。电镜观察可见明显的横纹结构,以及心肌组织的特征性的超微结构,如T小管,闰盘等。与单纯心肌细胞组相比,在形成的心肌组织中,随着时间的延长,可见更为明显的条索样微血管网络结构的形成,至21天检测发现微血管网络范围、密度加大,并可见口径较大的管腔结构样的小血管形成。本研究是在液态胶原中对心肌组织工程血管化研究的首次尝试。具体研究内容如下:第一部分:分离培养人脐静脉来源的内皮细胞,并与细胞外基质凝胶混合制备组织工程化内皮片层。第二部分:以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,与细胞外基质凝胶混合构建工程化心肌组织片层。第叁部分:以新生大鼠心室肌细胞与人脐静脉内皮细胞为种子细胞,以细胞外基质凝胶为支架材料,并施以静态拉伸,混合构建组织工程化血管化心肌片层。
周瑾[4]2010年在《基于胶原/Matrigel支架材料的工程化心肌组织构建及体内移植的实验研究》文中研究指明缺血性心脏疾病是威胁人类健康的头号杀手之一。心肌梗死伴随着功能性心肌细胞大量死亡,最终导致心力衰竭。针对心衰晚期患者,心脏移植手术是目前临床治疗的唯一选择。但因存在供体器官短缺、免疫排斥反应及一系列移植后并发症等问题,而无法在临床广泛应用,急需寻找新的有效治疗方法和手段。组织工程这门交叉学科的兴起,为根治心脏疾病带来了希望。近年来,心肌组织工程研究进展迅速。国内外相继以新生大鼠心肌细胞、间充质细胞、胚胎干细胞(ESC)源心肌细胞为种子细胞,在体外成功再造了工程化心肌组织,再造心肌组织具有节律性收缩特性,并在组织结构方面与正常新生在体心肌组织相类似。尽管如此,目前心肌组织工程仍面临种子细胞来源选择、如何优化心肌细胞-支架材料体外培育环境,以及如何提高再造心肌组织的质量等一系列关键问题。从国内外研究现状分析,Zimmermann等利用胶原/Matrigel为支架体外构建心肌这一实验体系最为成功。但是该体系作为心肌体外再造模型采用的是动态力学拉伸,作为体外心肌再造研究模型的稳定性和可靠性尚有待提高。此外,随着相关研究的不断深入,研究人员对如何实现工程化组织体外血管化、以及针对再造心肌组织中非心肌细胞成分对再造心肌组织质量和心肌细胞体外叁维重构的影响给予了越来越多的关注。与此同时,本室以往利用该实验体系,以ESC源心肌细胞为种子细胞,虽然成功在体外制备了心肌组织,但因获得种子细胞实验流程复杂、费时长而影响了再造心肌效率与质量。针对以上分析,本研究利用胶原/Matrigel实验体系,开展了基于静态力学拉伸模型下的心肌组织体外再造研究,并通过添加血管内皮细胞的方式,研究了血管内皮细胞提高再造心肌组织的质量的能力;与此同时,利用胶原/Matrigel实验体系,进行了ESC分化发育的研究,重点观察了ESC自发分化发育及向心肌细胞定向诱导分化情况,在此基础上,利用已探索的定向诱导分化条件,研究ESC在本实验体系下进一步分化形成心肌组织的能力,并对其动物心梗修复能力进行研究。本论文的主要研究内容与结果简要概括如下,共分为以下四个部分:第一部分:基于静态力学拉伸模型下的心肌组织体外再造研究再造心肌组织的质量与微环境和非心肌细胞的作用关系密切。其中力学微环境对于再造心肌组织的质量至关重要。目前国内外常见的体外力学拉伸条件以动态力学拉伸为主,该力学拉伸条件存在一定的局限性。相比之下,再造心肌作为心肌体外发育研究模型,静态力学拉伸具有明显的优势,其稳定性和可靠性均较高。此外,近年来发育生物学研究表明,心肌中非心肌细胞成分对心肌细胞叁维重构与心脏功能的发挥均起着重要作用,尤其是针对Telocytes细胞在心脏发育中作用的研究,是目前研究的热点之一。在本部分研究中,首先建立了基于胶原/Matrigel叁维立体静态力学拉伸体系;其次,利用该体系,以新生大鼠心肌细胞为种子细胞,成功在体外构建了工程化心肌组织片层。在此基础上,通过组织学染色及免疫组织化学染色,对体外再造心肌组织中是否存在Telocytes细胞进行检测,并对其在心肌细胞叁维重构与心脏功能发挥中的作用进行探讨。研究结果分别简要介绍如下。在基于胶原/Matrigel叁维立体静态力学拉伸体系建立方面:研究结果表明,静态力学拉伸抵抗了胶原凝胶在细胞存在时的强烈收缩,避免了由于过度收缩而引起的组织变厚,防止了材料中央部位细胞的大量死亡。在实施静态力学拉伸后,再造心肌组织在体外始终维持一定的形状和厚度,形成较均一的组织片层。在工程化心肌组织片层制备方面:研究结果表明,心肌细胞在胶原/Matrigel叁维立体静态力学拉伸体系中,排列形成致密的肌纤维束,沿着静态拉伸力的方向充分伸展。激光共聚焦观察发现,可见心肌细胞相互连接部位部分区域存在Connexin43阳性染色,说明心肌细胞之间形成功能合胞体。此外,透射电镜结果表明工程化心肌组织中,心肌细胞肌小节排列具有方向性,并且可以观察到与细胞机械收缩和电信号传导密切相关的超微结构,如缝隙连接、桥粒等。在工程化心肌组织中是否存在Telocytes细胞方面:组织学染色可以观察到再造心肌组织中存在一种长梭形细胞,具有两个或叁个长细胞突起,形态上与Telocytes细胞相似。此外,免疫组织化学染色结果表明,这类长梭形细胞表达SMA阳性、Vimentin阳性和CD117阳性。根据以上实验结果,我们初步判定在工程化心肌组织中可能存在Telocytes细胞。第二部分:组织工程化心肌体外血管化研究再造组织血管化研究一直是组织工程包括心肌组织工程研究关注的焦点。近年来国内外研究报道表明,血管内皮细胞在叁维支架材料中可形成血管样结构,并且血管内皮细胞还对心肌细胞体外空间重构、存活和提高再造心肌组织的质量发挥重要作用。本部分研究,在前期建立基于胶原/Matrigel支架材料构建工程化心肌组织的基础上,进一步在凝胶体系中将血管内皮细胞与心肌细胞复合,深入研究了血管内皮细胞对心肌组织血管化能力和提高心肌组织质量的促进作用。研究结果表明,复合了血管内皮细胞的组织工程化心肌中,血管样结构形成明显增加,可见较多vWAg阳性的血管内皮细胞排列形成条索样结构。此外,血管内皮细胞还对心肌细胞空间排布上产生影响,cTnT和vWAg荧光双标记激光共聚焦检测发现,心肌细胞与血管内皮细胞在空间上相互靠近,心肌细胞更偏向于在血管内皮细胞网中存在。此外,加入血管内皮细胞还可以稳定再造心肌组织结构,提高再造心肌组织的收缩能力。第叁部分:ESC在胶原/Matrigel支架材料中分化发育的实验研究在ESC分化发育研究中,拟胚体(EBs)的形成对于ESC分化发育发挥着重要作用。现有ESC分化发育研究体系多是将ESC形成EBs与EBs进一步分化发育这一连续过程分割为两个阶段:首先是在二维或叁维环境中形成EBs,随后将所形成的EBs二维贴壁诱导分化或接种在叁维支架材料中进一步诱导分化。在本研究中,基于胶原/Matrigel这一实验体系在心肌再造方面取得的良好结果和建立的平台条件,将ESC以单细胞形式直接接种在胶原/Matrigel支架材料中,进而观察EBs形成以及后续分化发育情况,从而探讨胶原/Matrigel对ESC在叁维立体环境中直接形成EBs的可行性。重点针对ESC接种密度对EBs形成的影响、不同支架材料组成对EBs形成与分化的影响以及ESC在本体系下自发分化情况进行了研究。其中,在ESC接种密度对EBs形成影响的研究方面,结果表明ESC在胶原/Matrigel支架材料中可以直接启动EBs形成,并且ESC接种浓度对EBs形成具有明显影响,其最佳接种密度在105个/mL至106个/mL之间。在这一密度范围内,ESC所形成的EBs数量多、体积大。在不同支架材料组成对EBs形成与分化的影响研究方面,将ESC分别在单纯胶原凝胶及胶原/Matrigel不同体系中培养发现,支架材料中的胶原凝胶成分主要影响EBs形成,而Matrigel成分则对EBs分化发育与发挥重要作用。在ESC自发分化研究方面,将ESC在胶原/Matrigel叁维立体环境中培养,在不施加任何诱导条件的情况下,通过组织学染色结果表明,体外培养21d后EBs自发分化形成了与在体结构类似的各种组织结构,如有心肌细胞合胞体样结构、管腔样结构形成。针对CK18、CD31、cTnT、Nestin等免疫组织化学染色结果证实,ESC可以分化为cTnT阳性的心肌细胞、CK18阳性的上皮细胞、CD31阳性的内皮细胞以及Nestin阳性细胞等。第四部分:基于ESC为种子细胞的心肌组织构建及体内移植的实验研究在本部分研究中,利用我室在心肌组织工程研究方面既有的研究平台和技术体系,在前期利用胶原/Matrigel进行ESC定向体外分化研究的基础上,探索了ESC进一步定向诱导分化并形成心肌组织的能力及其动物心梗修复能力。ESC在本体系下是否可以通过特定诱导条件而向心肌细胞分化进而形成心肌组织是本论文研究关注的焦点之一。在本部分研究中,通过添加抗坏血酸作为ESC向心肌细胞分化的诱导剂,进行了ESC体外定向诱导分化及心肌组织叁维再造研究,并对再造组织进行了组织学及免疫组织化学鉴定。在此基础上,将所构建的工程化心肌组织移植到心梗部位,观察其在心梗部位存活、分化,及对心功能的改善情况。研究发现ESC在胶原/Matrigel支架材料中培养10-11d时(诱导3-4d)分化形成大量跳动的细胞,并且随着培养时间的延长,跳动细胞的数量和面积逐渐增多,14d(诱导7d)左右可见形成大面积跳动区域,体外培养19d(诱导12d)左右出现一致性跳动区域。对其进行免疫组织化学染色证实,再造心肌组织中含有大量表达cTnT、Nkx2.5和GATA4阳性的心肌细胞。与向心肌细胞自发分化相比,诱导分化后cTnT阳性细胞的大量增多,提示抗坏血酸显着促进了ESC向心肌细胞分化。并且,随着再造心肌组织中心肌细胞逐渐成熟,可见心肌细胞相互连接部位部分区域存在Connexin43阳性染色。免疫组织化学染色同时还揭示了在再造心肌组织中存在ESC分化来源的Nestin阳性细胞和CD31阳性细胞。将上述体外再造心肌组织进行心梗部位移植,并将单纯心梗组和非收缩片层移植组作为对照组。移植术后4w进行心功能检测,结果表明,与单纯心梗组和非收缩片层移植组相比,工程化心肌组织移植组可以显着改善梗死心肌的收缩及舒张功能。组织切片染色观察显示工程化心肌组织片层紧密贴附于梗死心肌部位,并已在结构上与宿主心肌发生整合,两者之间界限不明显。此外,针对心肌特异性标志cTnT,Nkx2.5,GATA4,connexin43免疫组织化学检测结果显示,再造工程化心肌组织中存在具有分化心肌细胞表型的细胞,并且Connexin43染色结果表明工程化心肌组织及工程化心肌组织与宿主心肌细胞之间形成了较广泛的细胞间连接。CD31染色结果显示在移植的工程化心肌组织中存在较丰富的血管内皮细胞,并且形成了管腔样结构。在此基础上,对工程化心肌组织移植后畸胎瘤形成情况进行了检测。移植4w后,开胸观察畸胎瘤形成。工程化心肌组织移植组移植后会引起畸胎瘤发生,发生率在25%(3+/12),形成的畸胎瘤位于心肌梗死部位,具有一定肉眼可见的体积,而在动物胸腔和腹腔均未检测到畸胎瘤形成。所形成的畸胎瘤包含典型的叁胚层结构。综上所述,本论文以胶原/Matrigel为支架材料,在体外建立了叁维立体静态力学拉伸体系,并利用该体系,以新生大鼠心肌细胞为种子细胞,体外构建了工程化心肌组织片层,并对再造心肌组织中是否存在Telocytes细胞进行研究。此外,通过将血管内皮细胞与心肌细胞复合在胶原/Matrigel支架材料中,进一步研究了再造心肌组织血管化能力。在此基础上,基于静态力学拉伸体系,以胶原/Matrigel为支架材料,建立了ESC体外分化发育模型,开展了ESC叁维立体分化与体外心肌再造研究,并将所构建的工程化心肌组织移植到心梗部位探索其动物心梗修复能力,结果表明,工程化心肌组织片层能够与宿主发生整合,并改善受损心肌功能。
高群[5]2008年在《基于液态胶原的组织工程化肾脏片层体外再造的实验研究》文中研究表明肾脏是人体重要的生命器官,肾脏疾病严重影响着患者的健康和生活质量,针对这种疾病的治疗一直受到国内外研究人员的广泛关注。血液透析和肾脏移植是目前临床上常用的治疗终晚期肾病与急性肾衰的方法,透析只能替代肾脏的部分功能,肾脏移植则受到移植器官来源有限及移植后引发免疫排斥反应等因素的限制。因此,针对终晚期肾病和肾衰的治疗迫切需要寻找新的技术和手段。随着组织工程研究的不断深入,运用组织工程技术研制可供移植的肾脏组织为肾病的治疗带来了新的希望。鉴于肾脏组织结构和功能的复杂性,如何在体外成功地再造组织工程化肾脏是组织工程研究面临的重要挑战之一。近年来,肾脏组织工程的相关研究取得了较大进展,如:将重构胚来源的胚胎肾脏细胞接种于多聚碳酸膜上并移植入核供体动物,肾脏细胞自发聚集形成了肾组织;将胚胎组织中的肾脏前体细胞移植入裸鼠体内,这些细胞可以继续分化并形成功能性的肾单位。这些研究结果显示了肾脏细胞具有通过自组装过程重新形成肾脏组织结构的能力,但是,以原代新生大鼠肾脏细胞为种子细胞,体外构建包含肾小管和肾小球样结构的完整肾脏组织的研究国内外尚未见报道。本研究中,我们首先以MDCK细胞为种子细胞验证构建组织工程化肾脏实验体系的可行性,并采用原代肾小管上皮细胞为种子细胞构建了组织工程化肾小管;在此基础上,以原代新生大鼠肾脏细胞为种子细胞,以添加Matrigel的Ⅰ型胶原为支架材料,并模拟正常机体的张力环境对构建的组织施加静态拉伸力作用,体外构建包含肾小管和肾小球样结构的组织工程化肾脏片层,采用组织学检测、免疫荧光染色、超微结构以及肾功能检测等方法对构建的组织进行鉴定,旨在探讨该组织工程方法体外构建肾脏组织的可行性。本论文的主要研究内容包括以下叁个部分:第一部分:以MDCK细胞为种子细胞体外构建组织工程化肾小管片层的实验研究。本实验首先采用MDCK细胞为种子细胞,以添加不同浓度Matrigel的Ⅰ型液态胶原为支架材料,体外构建组织工程化肾小管片层。培养过程中观察MDCK细胞的生长、聚集和小管结构发育情况,培养2周后进行组织学检测,鉴定Matrigel浓度对MDCK细胞生长和肾小管结构发育的影响,以确定最佳的胶原、Matrigel比例。实验结果表明,Matrigel在肾小管管腔结构的形成过程中起到关键性作用,添加Matrigel的组织工程化肾小管片层中有管腔明确的肾小管结构形成,且以10%浓度Matrigel的片层内细胞活力较高。然后,采用MDCK细胞为种子细胞,以10%浓度Matrigel的Ⅰ型液态胶原为支架材料,体外构建组织工程化肾小管片层,并在培养过程中通过自制模具施加静态拉伸力作用,比较孔板内和自制模具中片层的大体形态变化情况差异,培养2周后,通过组织学检测鉴定静态拉伸力作用对MDCK细胞生长和肾小管结构发育的影响。结果表明,施加静态拉伸力作用的片层内细胞活力较高且形成的小管结构数量较多,静态拉伸力作用有助于细胞活性的维持和肾小管管腔结构的形成,提高再造组织的质量。第二部分:以新生大鼠肾小管上皮细胞为种子细胞体外构建组织工程化肾小管片层的实验研究。本研究首先采用筛网法结合酶消化法原代分离新生大鼠肾小管上皮细胞,利用免疫组织化学的方法进行细胞鉴定。然后,以原代新生大鼠肾小管上皮细胞为种子细胞,以添加10% Matrigel的Ⅰ型液态胶原为支架材料,体外构建组织工程化肾小管片层,并在培养过程中施加静态拉伸力作用,培养过程中观察片层大体形态变化,并分别在体外培养1周和2周时取材,进行组织学检测、免疫荧光染色、超微结构以及叁维立体结构检测。结果表明,片层在体外培养过程中逐渐收缩形成蝴蝶样的外观,片层内的原代肾小管上皮细胞在较长培养时间内不仅保持了良好的细胞表型,表达上皮细胞表面标志物CK18,并重新获得上皮细胞极性形成具有明确管腔结构的叁维立体肾小管结构。第叁部分:以新生大鼠肾脏细胞为种子细胞体外构建组织工程化肾脏片层的实验研究。本研究以原代新生大鼠肾脏细胞为种子细胞,以添加10%Matrigel的Ⅰ型液态胶原为支架材料,体外构建组织工程化肾脏片层,并在培养过程中施加静态拉伸力作用。培养过程中观察片层内细胞生长和结构发育的情况,并在培养的第1周、第2周和第3周取材,进行组织学检测、免疫荧光染色、超微结构以及片层的肾功能检测。结果表明,原代新生大鼠肾脏细胞在叁维基质凝胶环境中具有良好的细胞活性,表达上皮细胞表面标记物CK18或内皮细胞标记物Flk-1,同种类型的细胞或不同类型细胞之间可以相互接触、粘附、聚集,形成了不同发育阶段各种形态的肾小管结构和肾小球样的结构。组织工程化肾脏片层的一些功能性指标也有改变,提示形成的肾脏结构可能具备一定的功能。综上所述,本研究分别以MDCK细胞、原代肾小管上皮细胞以及包含有肾小管上皮细胞、肾小球细胞的原代肾脏细胞为种子细胞,以添加Matrigel的Ⅰ型胶原为支架材料,体外构建了组织工程化肾小管片层及组织工程化肾脏片层,并在培养过程中施加静态拉伸力作用。研究结果表明在叁维细胞外基质凝胶中,肾脏细胞具有明显的自组装能力,能够形成肾小管和肾小球样结构。体外构建的组织工程化肾小管片层和组织工程化肾脏片层可以作为肾脏发育研究以及肾脏疾病治疗药物筛选的模型,深入研究也将具有潜在的临床应用前景。本研究所采用的工程化组织构建方法也为其它复杂生命器官的体外再造提供了思路。
何文俊[6]2007年在《重构胚来源的胚胎干细胞作为种子细胞构建工程化心肌组织的实验研究》文中进行了进一步梳理背景：心脏缺血性疾病具有很高的发病率和死亡率，故针对这种疾病的治疗一直受到国内外研究人员的广泛关注。心脏疾病在晚期往往需要进行器官移植，但却受到移植器官来源有限及移植后引发免疫排斥反应等因素的限制。随着组织工程研究的不断深入，运用组织工程技术研制可供移植的心肌组织给治疗心脏缺血性疾患带来了新的希望。本文采用重构胚来源的小鼠胚胎干细胞(NT-mESC)作为种子细胞来源，体外构建工程化心肌组织，NT-mESC既可为组织工程化心肌再造提供无限的细胞来源，也有望解决移植后引发的免疫排斥问题，相关研究国内外尚未见报道。方法：应用STLV型生物反应器大规模制备拟胚体(EBs)，采用抗坏血酸作为诱导剂，将EBs诱导分化为心肌细胞，通过Percoll密度梯度离心富集NT-mESC来源的心肌细胞，将富集的心肌细胞与液态Ⅰ型胶原及ECM gel混合后构建工程化心肌组织(ECTs)，体外力学拉伸刺激后将ECTs移植到大鼠心肌梗死部位，移植4周后，对ECTs在体内的存活及血管化情况进行评价。结果：NT-mESC在STLV型生物反应器中能够高效形成EBs，EBs中心区域未见明显坏死，无广泛的凝聚现象。在贴壁诱导分化培养后，EBs能迅速贴壁并有细胞爬出，抗坏血酸诱导EBs向心肌细胞分化的效率超过90％。NT-mESC来源的心肌细胞经Percoll密度梯度离心后，主要富集在第Ⅲ层和第Ⅳ层，其纯度分别为35±2％和73±4％。收集第Ⅲ、Ⅳ层细胞作为种子细胞，以液态Ⅰ型胶原为支架构建出的ECTs体外拉伸7天后，具有类似于新生小鼠心肌的结构特征，心肌细胞在ECTs中发生重排，但肌原纤维比较稀疏。移植到大鼠心梗部位4周后，ECTs能够继续存活并进一步发育成熟，血管化程度较高，且未发现畸胎瘤的形成。结论：本文采用NT-mESC作为心肌组织工程种子细胞来源，构建出工程化心肌组织，构建的ECTs具有类似于新生小鼠心肌的结构特征，体内移植后ECTs能够存活，在ECTs中不仅有心肌组织形成而且还发生血管化，表明其具有较强的心肌损伤修复能力。
张文君[7]2010年在《基于胶原/Matrigel的肺脏组织工程实验研究》文中进行了进一步梳理目前,慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘以及肺纤维化(PF)都已成为高死亡率的肺脏疾病。伴随着气候和环境的改变,人类现在面临的肺脏疾病呈明显增长的趋势。近半个世纪以来,随着人们对于肺脏的基础理论研究的不断深入,以及针对一些肺脏疾病发病机理研究所取得的积极进展,氧气疗法、手术治疗和肺脏疾病康复疗法等治疗手段有了长足进步。尽管如此,肺脏移植仍是肺脏疾病晚期的主要治疗手段。然而,由于缺少肺脏器官来源,目前很多患者根本无法得到有效治疗。寻找新的治疗方法和手段业已成为肺脏疾病治疗的当务之急。组织工程技术的不断发展已为肺脏疾病的治疗带来新的希望。组织工程是融合了生命科学、材料科学以及工程科学的原理和方法,旨在再造人体组织器官的新兴交叉学科。近年来,组织工程研究先后在皮肤、软骨、神经、血管及心肌组织再造中取得了突破性进展,并有部分组织工程产品进入临床应用。肺脏具有通气和换气功能,肺实质为肺内支气管的各级分支和其末端的肺泡。近年来肺脏组织工程研究进展迅速,先后有研究人员成功在体外再造了组织工程化肺泡和支气管粘膜。尽管如此,针对肺脏体外再造,仍存在如何优选细胞支架材料,如何优化细胞-支架复合体体外培育环境以及进一步提高再造肺脏组织质量等一系列问题。本论文采用组织工程技术开展了肺泡和支气管粘膜体外再造研究。其中,在肺泡体外再造方面,以小鼠胚胎期肺脏细胞(FPCs)为种子细胞,利用胶原/Matrigel为细胞提供叁维立体生长环境,并针对目前国际上尚无有效手段控制体外再造肺泡结构现状,首次应用海藻酸钠(APA)微囊发挥空间占位作用,通过APA微囊控制肺泡样结构的形成,成功在体外再造了肺泡样结构,取得了预期结果。在支气管粘膜体外再造方面,以胶原/Matrigel为胚胎期肺脏成纤维细胞和支气管上皮细胞支架,成功在体外再造了支气管粘膜样结构,并研究了Matrigel对人支气管上皮细胞再生的影响。目前,针对Matrigel对支气管上皮细胞再生的影响尚未见报道。本论文基于肺脏体外再造所需支架(APA微囊)以及肺脏再造不同结构(肺泡及支气管粘膜样结构),主要研究内容共分叁个部分,概括介绍如下:第一部分:制备海藻酸钠(APA)微囊及其物理与生物学性能的评价微囊是一种可以形成免疫隔离屏障的半透膜结构,它的物理和生物学特性通过控制制备过程中的物理参数可以加以调控。本研究的目的是,在已有的研究基础上,制备出适合用于肺泡样结构再造中保持肺泡大小与形状的APA微囊,并对其物理和生物学特性进行评估。我们在已有的研究基础上,选定以下参数制备微囊:静电场为6kV/1.5cm,泵推进速度为15mL/h,针头内径为0.09mm,海藻酸钠浓度为2%,多聚赖氨酸浓度为0.05%,作用时间为6min,制备粒径为200-300μm。人的肺泡平均直径在250μm左右。因此在这些参数控制下,制备的微囊更适宜用于肺泡样结构的构建。在物理性能评价方面,研究结果表明,APA微囊具有较好的机械强度;制备的APA微囊可以使4kD的小分子物质自由扩散进微囊内,70kD的中等分子物质可部分通过,而150kD的大分子物质不能或大部分不能通过微囊膜。在生物学性能方面,观察APA微囊腹腔移植后的形态表明,其具有较好的生物相容性。在本部分研究中,研制了APA微囊,掌握了APA微囊研制的关键技术,摸索了微囊研制的系列条件,并对其物理和生物学性能进行评价。研究发现,研制的APA微囊大小适用于肺泡样结构构建研究,并且具有良好生物相容性。第二部分:以胶原/Matrigel-海藻酸钠微囊为支架材料体外构建组织工程化肺泡样结构的实验研究对于远端肺脏组织的构建,肺泡样结构的实现至关重要。本研究的目的是以FPCs为种子细胞,采用胶原/Matrigel为细胞提供叁维生长环境,采用APA微囊这种材料来发挥空间占位作用,进而通过改变制备过程的物理参数来控制肺泡大小和形状,从而更好地实现组织工程化结构的构建。大体观察发现,FPCs与胶原/Matrigel-APA微囊复合可以形成组织片层,随着培养时间的延长,片层逐渐收缩;培养14d后观察发现片层收缩更加明显,继续培养至21d,最终形成蝴蝶状外观。倒置显微镜下观察,发现在叁维支架材料中FPCs在微囊周围生长,APA微囊保持良好的完整性。H.E.染色结果显示,体外构建7d和14d的组织片层中的囊泡样结构和小鼠正常肺脏的组织结构很相似。通过免疫组织化学染色可以看出,在体外培养7d和14d的肺脏组织片层中,均有广谱细胞角蛋白(pan-CK),波形蛋白(Vimentin)和细胞表面活性物质C(SpC)阳性表达。通过透射电子显微镜观察体外培养7d和14d的组织片层可以观察到板层小体,表明Ⅱ型肺泡细胞在囊泡状空间结构的环境下能够保持未分化状态。扫描电子显微镜观察发现肺脏组织片层纵剖面有球形中空的囊状结构。本部分研究,成功在体外构建了肺泡样结构,使微囊发挥空间占位作用,并能够保持Ⅱ型肺泡细胞的未分化状态。第叁部分:以胶原/Matrigel为支架材料体外构建组织工程化支气管粘膜的实验研究支气管粘膜在肺脏导气部发挥着重要的作用。我们采用支气管上皮细胞(Beas-2B)和胚胎期肺脏成纤维细胞(MRC-5)为种子细胞,以胶原/Matrigel为支架材料,应用气液界面培养的方法体外构建支气管粘膜。其中,上皮细胞的接种位于成纤维细胞与胶原/Matrigel混合并凝胶化之后。在研究中,还通过是否在接种上皮细胞之前添加Matrigel的方式,来探讨了Matrigel对上皮细胞再生的影响。倒置显微镜下观察,发现构建的支气管粘膜表面有支气管上皮细胞的聚集、融合,其下层成纤维细胞在胶原/Matrigel支架材料中,可以相互连接并形成网络样结构。H.E.染色结果表明,在成纤维细胞和胶原/Matrigel复合后,如果添加Matrigel后再接种上皮细胞层,可以形成表面完整的上皮细胞层。相反,没有添加Matrigel的支气管粘膜上皮细胞层不完整。免疫组织化学染色结果显示,添加Matrigel的支气管粘膜pan-CK阳性表达细胞较多,说明Matrigel可以促进气道上皮细胞的生长;没有添加Matrigel的支气管粘膜pan-CK阳性表达细胞较少。添加Matrigel对成纤维细胞的生长基本没有影响。扫描电子显微镜观察体外构建的支气管粘膜,发现添加Matrigel后,有纤毛样结构的形成,说明Matrigel可以促进气道上皮细胞的进一步分化。本部分研究,在体外成功构建了支气管粘膜,并证实Matrigel可以促进气道上皮细胞的再生。综上所述,本研究中,在支架研制方面,掌握了APA微囊研制的关键技术,摸索了微囊研制的系列条件,成功制备了适用于肺泡样结构构建的APA微囊,且具有良好的物理性能和生物相容性。在肺泡构建方面,以FPCs为种子细胞,胶原/Matrigel为支架材料,充分发挥APA微囊的空间占位作用,在体外构建了肺泡样结构,其中,通过调节微囊的大小和形状可以有效控制再造肺泡样结构中肺泡的大小和形状,实现了对肺泡样结构的初步控制。在支气管粘膜构建方面,以Beas-2B和MRC-5为种子细胞,胶原/Matrigel为支架材料,在体外构建了支气管粘膜,并证实Matrigel可以影响气道上皮细胞的再生。组织工程化肺脏的构建,可以为肺脏疾病治疗提供新的技术和手段,此外,上述再造组织还可以作为肺脏疾病研究模型或者治疗肺脏疾病药物筛选、毒性检测的模型。
隋润钤[8]2011年在《复合心肌组织工程联合大网膜移植术治疗心肌梗死的实验研究》文中研究说明第一部分可降解组织工程材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的制备及评价目的：采用电纺丝技术制备新型可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)叁维立体支架；通过扫描电镜观察支架超微结构；进行体外力学、降解性能及细胞相容性评价；进行皮下包埋,评价其组织相容性；初步探讨其作为心肌组织工程支架应用的可行性。方法：1、PLGA叁维支架的制备及超微观察：PLGA电纺丝使用PLGA(50/50)颗粒,以氯仿/DMF(体积比2：1)的混合溶液为溶剂,配成浓度分别为8%的溶液,溶液在室温下搅拌过夜。纺丝时将聚合物溶液倒入30ml玻璃注射器中,选用8#针头,纺丝电压为+10kV,接收距离为12cm,供料速率为3ml/h,接收装置为上覆铝箔的铜板。将获取的纺丝样品真空喷金后用扫描电镜观察其表面形貌,加速电压为20 kV。2、对PLGA纺丝布片进行缝合强度、断裂强度测试：将PLGA纺丝布片修剪成20mm×5mm的长方形(n=7),然后将其一端夹在拉力机的夹具中,另一端用4#手术线与布片缝合在一起,测试其缝合强度；将PLGA布片修剪成工字形样条(n=8),两端夹在拉力机的夹具中,测试范围长20mm,宽2mm,厚约0.5mm,进行断裂强度测试。3、PLGA纺丝布片的体外水解降解测试：将PLGA纺丝布片裁剪成尺寸约为10mm×10mm的正方形样片(n=3×4),去污、蒸馏水冲洗、干燥后称重,然后放入6孔培养板内,加入PBS缓冲液完全浸润样片,放入37℃恒温箱内。在第1、2、4、6周之后将样片取出,用去离子水冲洗样片表面的盐离子,然后在室温下真空干燥至恒重,进行重量损失计算。4、PLGA纺丝布片的细胞相容性测试：以有机锡为稳定剂的聚氯乙烯(PVC)为阳性对照组,将收集到的PVC、PLGA膜片修剪成10×10mm大小,进行冲洗、消毒,按照膜片表面积；浸提递质=3 cm2：1ml的比例进行浸提液的制备。采用浸提液L929细胞培养MTT法进行细胞毒性测试、采用浸提液BrdU细胞增殖法观察细胞增殖情况、采用直接接触培养法进行细胞形态学观察。5、PLGA纺丝布片的体内组织相容性测试：将PLGA纺丝布片裁剪成尺寸约为10mm×10mm的样片(n=3×3),建立大鼠皮下包埋模型,分别于术后1、2、4周取出材料,进行组织切片HE染色,观察材料变化情况。结果：1、PLGA纺丝布片丝形貌良好,尺寸较均匀,内部相互贯通,孔径约100-150微米不等,孔隙丰富,分布均匀,适于营养物质的交换及代谢产物的排出,能够满足种植细胞生长的需求。2、经体外力学测试PLGA电纺丝布片的缝合强度为(4.9+0.6)N,断裂拉伸强度为(1.6±0.3)MPa,可以满足心肌补片材料的力学要求。3、经重量损失计算发现PLGA纺丝布片在磷酸盐缓冲液中水解降解6周后,质量损失为13.4%,而且从第4周开始支架的降解速度加快,此外我们还观察到第8周时材料出现崩解,说明此PLGA支架具有可降解性。4、细胞毒性测试PLGA材料细胞毒性稳定在0-1级水平,对照组PVC组毒性稳定在4级水平,表明PLGA材料毒性较小,有利于细胞生长；应用BrdU细胞增殖法观察发现L929细胞从2-5天经历了4天的快速DNA合成期,增殖情况良好。细胞形态学观察显示L929细胞在PLGA膜片上呈梭形或叁角形伸展,贴壁良好,生长旺盛,提示该材料细胞相容性良好,符合组织工程心肌支架材料的应用要求。5、大鼠皮下包埋术后标本切片观察支架材料符合慢性炎症反应过程,大鼠细胞向材料内部迁移、增殖,并沿纺丝纤维排列,第4周形成致密结构,组织相容性良好。结论：1、应用电纺丝技术制备的PLGA纺丝支架的微观形貌良好,满足心肌组织工程支架材料的几何要求；2、PLGA纺丝支架具有良好的缝合强度和抗拉强度,满足组织工程心肌支架材料的力学要求；3、PLGA纺丝支架具有可降解性,随着时间的延长,其降解速度加快；4、PLGA支架材料无明显细胞毒性,细胞在浸提液中的增殖良好,细胞形态学观察也证实该材料良好的细胞相容性；5、PLGA纺丝支架具有良好的组织相容性,体内置入未见明显炎症及排异反应,可安全得进行体内移植。第二部分复合组织工程联合大网膜移植术治疗心肌梗死的在体实验研究目的：缺血性心脏病具有很高的发病率和死亡率,心肌梗死后心肌细胞大量死亡,最终导致心力衰竭,对人类健康构成巨大威胁。内科药物治疗、冠脉介入及外科手术虽能改善症状,但均有不足。细胞移植是一种很有前途的针对缺血性心脏病的治疗手段,目前已有大量相关实验报道,目前的细胞治疗多采用注射方式,但其移植效率仍存在不足,急需寻找新的有效的治疗手段和方法。新兴的组织工程医学为我们提供了新的思路：通过体外构建出可降解PLGA叁维立体支架,在体外将骨髓间充质干细胞种植于支架材料上构建出复合组织工程移植物进行心外补片治疗,提高细胞移植效率；针对移植后的血供缺陷,我们采用带蒂大网膜包裹术(OP)改善局部微环境,为移植物提供血运支持；通过建立大鼠心梗模型,评价上述治疗措施对心肌梗死治疗的疗效,为将来心肌组织工程的临床应用打下坚实的实验基础。方法：雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠MSCs采用全骨髓差速贴壁培养法进行分离、培养,选取生长旺盛的第3代细胞进行体外DAPI标记,种植于PLGA支架上体外培养4天。选择4周龄雌性SD大鼠,结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死(Myocardial infarction, MI)模型。心梗后1周,经胸心脏超声筛选左室射血分数(LVEF)小于60%同时左室缩短分数(LVFS)小于30%的心梗鼠进行随机分为4组,分别为MI对照组(n=10)、MSCs-PLGA组(n=12)、PLGA-OP组(n=12)及MSCs-PLGA-OP组(n=35),进行二次开胸手术操作。MI对照组仅行二次开胸对照；MSCs-PLGA组单纯行工程材料心梗区心外膜补片移植；PLGA-OP组行无细胞种植的PLGA补片心外膜移植复合带蒂大网膜包裹术；MSCs-PLGA-OP组行工程材料移植复合带蒂大网膜包裹术。术后4周,应用超声心动图评价左心功能,标本取材做病理学检测(HE染色、免疫组化染色及免疫荧光染色)。另外,MSCs-PLGA-OP组分别于术后1、2周各处死9只观察MSCs随时间变化的存活情况。结果：术后各组大鼠存活状态良好,未见明显副作用发生。超声心动图检测显示,与MI对照组(49.85%±5.03%&22.06%±2.78%)相比,MSCs-PLGA-OP组(59.68%±5.78%&27.65%±3.81%)及MSCs-PLGA组(56.89%±7.57%&26.22±4.55%)的EF和FS均有改善(P< 0.05,ANOVA检测),而PLGA-OP组(55.46%±3.75%&25.28%±2.22%)心功能虽有改善趋势,但无统计学意义；各组间的LVEDD和LVESD无统计学差异,说明PLGA纺丝支架富有弹性,未明显影响心脏的舒缩功能。MSCs-PLGA-OP组术后1、2、4周观察发现移植细胞随时间延长发生凋亡,但从2～4周细胞凋亡趋于稳定,说明大网膜已对移植细胞提供了足够的血供支持,免疫组化检测也证实了这一点；通过观察还发现第4周时已有MSCs向心梗区迁移,并有少量细胞向心肌方向分化。结论：通过体外构建种子细胞复合叁维立体支架的组织工程移植物,联合大网膜包裹术能够提高细胞移植效率,改善心梗区局部微环境,进而改善心功能。
王立曼[9]2014年在《基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究》文中认为肝脏是人体内最大的器官，是物质代谢的中枢，在葡萄糖代谢、脂质代谢、蛋白合成以及解毒方面都发挥着重要的作用。当前肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病正严重威胁着人类健康，全世界由肝疾病引发的死亡率达到2.5%，其中最严重的是肝功能衰竭。我国是世界上病毒性肝炎和肝癌发病人数最多的国家，每年因肝病死亡的人数近50万，每年用于治疗肝炎和肝病的医疗、保健费用高达1000多亿元。急性肝功能衰竭预后不良，死亡率高达70%～80%。目前，针对急、慢性肝衰竭患者，肝移植是最有效的治疗方法，但由于可供移植的肝脏严重短缺，大多数患者在等待供体肝脏的过程中死亡。因此，寻找新的疗法或肝脏功能替代品已成为临床上亟需解决的问题，采用肝脏组织工程技术体外再造肝脏，有望为肝衰竭提供新的治疗手段。组织工程是将工程学、材料学与生命科学的原则应用到开发生物代替物的前沿交叉学科领域，其核心内容是建立叁维复合体，即体外构建具有生物学功能的工程化组织。肝脏组织工程研究始终是组织工程研究的热点领域之一，在近叁十年的发展过程中，已取得了诸多突破性进展。研究表明，体外再造肝脏具有一定的肝衰竭等肝脏疾病治疗作用，系列核心技术在生物人工肝效能提升与更新换代方面发挥了重要作用。尽管如此，由于肝脏结构与功能的复杂性，体外构建组织工程化肝脏器官仍面临着一系列挑战，如支架材料相容性差，且支架材料中缺乏类似于在体的脉管结构，导致再造肝脏体积受限；此外，现有的支架材料结构和组分相对单一，尚不能为肝细胞提供与体内环境类似的微环境。正因如此，近年来，基于脱细胞基质生物材料的肝脏组织工程研究受到了越来越多的关注，发展异常迅速，并取得了一批阶段性研究成果。脱细胞基质是指利用化学法、物理法或酶解法来破坏组织/器官中的细胞结构，并将细胞碎片从细胞外基质（extracellular matrix, ECM）中清除而获得的生物支架材料。利用不同洗脱条件处理后的脱细胞基质不仅可以保留组织或器官中的主要细胞外基质成分，而且可以使其中的血管系统及超微结构的完整性得到一定保存，因此是一种适应细胞生长和组织再生的优良材料。脱细胞技术的迅猛发展掀起了脱细胞基质的研究热潮。自从2008年Ott等人首次成功制备出心脏全器官脱细胞基质以来，研究人员已成功获得了多种脏器的全器官脱细胞基质，如肝脏、肾脏、肺脏等。肝脏作为机体最大的脏器，基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究已成为组织工程研究领域的焦点之一。目前，用于肝脏组织工程研究的脱细胞基质支架材料主要包括两类：非肝脏来源的脱细胞基质材料和肝脏来源的全器官脱细胞基质材料。在基于非肝脏脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，为了拓宽支架材料的来源，国内外研究人员致力于探索其他组织来源的非肝脏脱细胞基质材料应用于肝脏组织工程的可行性。例如，研究人员已成功利用空肠脱细胞基质材料构建了工程化类肝组织，研究发现空肠脱细胞基质材料能够支持肝细胞正常的形态及其代谢活性，表明非肝脏来源的脱细胞基质材料能够应用于肝脏组织工程研究。目前，研究其他组织来源的脱细胞基质材料对肝细胞的支持作用或构建工程化肝脏组织已为成本领域的研究热点之一。大网膜（greater omentum）是连接胃大弯至横结肠的腹膜，富有极强的弹性和灵活性，同时具有高度血管化的结构，这些特点使其成为组织工程和再生医学领域中优良的天然材料。目前，大网膜在临床上主要用于外科重建手术中对炎性或者缺损组织的修复，促进组织的再生；在组织工程研究领域，大网膜可作为体外移植构建物的天然生物反应器，促进构建物血管化的形成，增强移植构建物的功能，已成功应用于心肌组织工程、软骨组织工程、神经组织工程等领域。近年来，随着脱细胞技术的迅猛发展，研究人员在大网膜脱细胞基质研究中开展了大量研究工作，并成功获得了大网膜脱细胞基质支架材料，然而，目前尚未见将大网膜脱细胞基质应用于肝脏组织工程的研究报道。在基于肝脏全器官脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，研究人员已经应用胎儿肝细胞、原代肝细胞、肝细胞系等多种来源的细胞接种到肝脏脱细胞基质中，成功在体外构建了具有一定功能的工程化肝脏组织或类器官。研究发现，与以往的支架材料相比，肝脏脱细胞基质能够为细胞提供更接近于天然肝脏的微环境。此外，由于细胞外基质成分在不同的物种之间具有高度保守性，脱细胞技术得到的细胞外基质支架同时具有低免疫原性的优点，因而可以作为工程化肝脏组织构建中优良的生物支架材料。获得结构及组成均优良的肝脏脱细胞基质材料是开展基于脱细胞基质肝脏组织工程研究的基础与前提。目前，肝脏脱细胞基质制备方法主要包括物理法、化学法、酶学消化法以及上述方法的组合使用等。然而，虽然脱细胞技术的发展日新月异，涌现了许多脱细胞方法，但现有脱细胞洗脱方法均存在一定的不足，比如洗脱时间长、ECM成分破坏严重、生长因子大量丢失等。理想的制备肝脏全器官脱细胞基质的方法尚有待进一步优化。基于上述分析，本论文主要从以下叁个方面开展研究工作：第一部分：基于大网膜脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究目的：研究大网膜脱细胞基质支架材料的成分组成、生物相容性及其应用于肝脏组织工程的可行性。方法：利用免疫组织化学染色检测四种大网膜脱细胞基质（No.1、2、3、4）的组成，通过扫描电镜检测其形态与孔径大小；在此基础上，分别接种大鼠原代分离的肝细胞构建工程化肝脏组织片层，并进行肝脏组织工程研究，不同时间点取材，通过Live/Dead染色检测细胞活性，利用HE染色、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测工程化组织中肝细胞形态及生物学功能。结果：四种大网膜脱细胞基质均含有天然ECM中主要蛋白组分并具有典型的网状结构，其中No.1、3基质孔径较小，No.2、4基质孔径较大；肝脏组织工程研究发现，与小孔径支架材料相比，大孔径大网膜脱细胞基质支架可以更好的支持肝细胞的粘附、生长及支持其糖原储存、白蛋白分泌等生物学功能的发挥。结论：大网膜脱细胞基质作为一种优良的生物支架材料，能够维持肝细胞的形态并支持其生物学功能，在肝脏组织工程中具有良好的应用前景。第二部分：肝脏全器官脱细胞支架材料的制备及条件优化目的：对两种肝脏全器官脱细胞基质制备方法进行比较，以期筛选出更为有效的肝脏脱细胞基质制备方法。方法：采用两种不同方案（分别以十二烷基硫酸钠（SDS）和Triton X-100+SDS（Tx+SDS）为主要洗涤剂）制备肝脏全器官脱细胞基质，通过组织学、分子生物学等方法检测基质中细胞和核酸成分的去除情况、ECM蛋白组成及生长因子含量。结果：两种方法均能达到去细胞化要求；SDS方案得到的脱细胞基质脉管网络遭到破坏，纤维网络结构松散；Tx+SDS方案得到的脱细胞基质脉管结构完整，ECM蛋白和生长因子含量均高于SDS方案。结论：利用Tx+SDS为主要洗涤的脱细胞方法可成功制备出优良的肝脏全器官脱细胞基质，为工程化肝脏组织构建奠定了基础。第叁部分：基于肝脏全器官脱细胞支架材料的肝脏组织工程研究目的：探索以本研究中制备的肝脏全器官脱细胞基质为支架材料，构建工程化肝脏组织的可行性。方法：以Tx+SDS方案制备肝脏脱细胞基质，接种HepG2细胞系构建工程化肝组织片层，体外培养7天后取材，利用HE染色、免疫组织化学染色、PAS染色研究工程化肝组织的形态及其生物学功能。结果：组织学染色结果表明，肝脏脱细胞基质支架可以支持细胞的粘附、生长，维持细胞形态和增殖能力；PAS染色结果显示此支架材料能够支持细胞糖原储存生物学功能的发挥。结论：Tx+SDS方法制备的肝脏全器官脱细胞支架材料具有良好的生物相容性，可维持细胞形态并支持其生物学功能，能够作为工程化肝脏组织构建的优良支架材料。综上所述，本论文在基于非肝脏来源脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，系统比较了四种具有大小两类不同孔径的大网膜脱细胞基质的成分组成，发现四种大网膜脱细胞基质均良好的保留有天然ECM主要蛋白成分且具有良好的生物相容性；与小孔径支架材料相比，大孔径大网膜脱细胞基质能够更好的维持肝细胞形态并支持其糖原储存、白蛋白分泌等生物学功能的发挥，证实了大网膜脱细胞基质应用于肝脏组织工程的可行性，拓展了肝脏组织工程中脱细胞基质支架材料的来源。在基于肝脏全器官脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，本论文首先比较研究了两种制备肝脏全器官脱细胞基质的洗脱方案，研究发现与SDS方案相比，Tx+SDS洗脱方案制备的肝脏脱细胞基质可以保留天然肝脏的叁维网络结构、脉管结构完整性，并能更好的保留ECM基本组分。其次，以Tx+SDS洗脱方案制备的肝脏脱细胞基质为支架材料构建工程化肝脏组织，发现工程化组织中细胞能够维持良好的形态并能够发挥生物学功能，表明以Tx+SDS洗脱方案制备的肝脏脱细胞基质具有良好的生物学性能，能够作为工程化肝脏组织构建优良的支架材料。上述基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究有望为肝衰竭未来的临床治疗提供新的策略与手段。
邢玉洁[10]2010年在《骨髓间充质干细胞诱导分化心肌细胞体内构建工程化心肌组织》文中认为研究背景缺血性心脏病(Ischemia heart disease, IHD)导致的心力衰竭(Heart failure, HF)呈逐年递增趋势,如果没有得到及时有效的治疗,则会出现大量心肌细胞的变性和坏死,导致严重的后果和各种并发症的发生,严重威胁着人类的生存及生活质量。成年心肌细胞是高度分化的终末细胞,损伤后不能再生。一旦大部分心肌组织受损,目前的治疗药物只能延缓其病情的发展但无法根治和修复终末期心衰,心脏移植是目前有效的治疗方法但因供体来源有限及费用昂贵而不能广泛应用于临床,因此探索新的治疗手段成为研究人员追寻的目标。心肌细胞移植是近年来治疗缺血性心脏病的热点,发展迅速。此后,心肌组织工程的诞生与兴起,为治疗缺血性心脏病带来曙光,使再造有功能的心肌组织有了希望,也成为心肌组织工程领域最富有挑战性的目标。目前,心肌组织工程的研究已取得了很大的进展,国内外有关此方面的报道也日益增多,必将为治愈这一心脏顽疾奠定坚实的基础。研究目的1.观测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞的作用及分化率。2.探索聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)共聚物支架和BMMSCs诱导分化的心肌样细胞体内构建工程化心肌组织的可行性及效果。研究方法1. AngⅡ联合5-aza体外诱导BMMSCs分化为心肌样细胞:采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第3代BMMSCs进行分组诱导: AngⅡ联合5-aza组(0.1μmol/L与10μmol/L)、AngⅡ组(0.1μmol/L)、5-aza组(10μmol/L)、空白对照组。诱导24 h后更换常规培养液继续培养4 w。倒置相差显微镜下观察细胞的形态学变化,MTT法检测细胞增殖能力,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I (cTnI)的表达,流式细胞计数法检测心肌样细胞诱导率,透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。2.PLGA共聚物与BMMSCs诱导分化的心肌样细胞体内构建工程化心肌组织:PLGA共聚物剪成方片形状,经60Co照射消毒、PBS及DMEM水化后备用。将诱导成功后的心肌样细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的PLGA共聚物上,形成细胞-支架复合物,置于细胞培养箱中培养3 d,然后移植到大鼠腹腔囊袋中。4 w后,采用HE染色、免疫组织化学染色、扫描电镜及透射电镜观察体内构建的工程化心肌组织的形态和结构。研究结果1.原代培养的BMMSCs14 d形成集落,传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形均匀一致生长,并出现肌岛样结构。MTT法显示:AngⅡ联合5-aza组、AngⅡ组、5-aza组、对照组在第5 d的光吸收值分别为0.209±0.044,0.148±0.009、0.129±0.012、0.103±0.008,第7 d分别为0.284±0.014、0.224±0.010、0.220±0.009、0.169±0.019,AngⅡ联合5-aza组细胞增殖能力优于AngⅡ组或5-aza组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达心肌特异性蛋白cTnI。流式细胞计数法显示:AngⅡ联合5-aza组、AngⅡ组、5-aza组及对照组的心肌样细胞诱导率分别为(30.0±1.7) %、(25.3±2.2) %、(24.6±1.9) %、(0.8±0.2)%,AngⅡ联合5-aza组心肌样细胞诱导率高于AngⅡ组或5-aza组(P<0.05)。透射电镜可见肌丝、Z线样物质。2.HE染色显示心肌样细胞在工程化心肌组织中均匀分布,细胞核呈长梭形。免疫组织化学染色示体内构建的工程化心肌组织cTnI阳性。扫描电镜可见接种的细胞与PLGA粘附良好,且细胞在构建物中呈叁维化生长。透射电镜显示,构建的工程化心肌组织含有排列整齐的肌原纤维,沿细胞长轴平行分布,细胞富含线粒体和内质网,还可见到桥粒结构、缝隙连接及Z线样物质。研究结论1. AngⅡ联合5-aza可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高于单纯5-aza诱导(P<0.05)。2.以PLGA共聚物为支架、BMMSCs诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,于体内可构建出形态结构类似于天然心肌组织的工程化心肌组织。
参考文献：
[1]. 采用组织工程技术体外再造心肌组织的初步研究[D]. 刘霞. 西北农林科技大学. 2003
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[4]. 基于胶原/Matrigel支架材料的工程化心肌组织构建及体内移植的实验研究[D]. 周瑾. 中国人民解放军军事医学科学院. 2010
[5]. 基于液态胶原的组织工程化肾脏片层体外再造的实验研究[D]. 高群. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[6]. 重构胚来源的胚胎干细胞作为种子细胞构建工程化心肌组织的实验研究[D]. 何文俊. 中国人民解放军军事医学科学院. 2007
[7]. 基于胶原/Matrigel的肺脏组织工程实验研究[D]. 张文君. 中国人民解放军军事医学科学院. 2010
[8]. 复合心肌组织工程联合大网膜移植术治疗心肌梗死的实验研究[D]. 隋润钤. 中南大学. 2011
[9]. 基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究[D]. 王立曼. 中国人民解放军军事医学科学院. 2014
[10]. 骨髓间充质干细胞诱导分化心肌细胞体内构建工程化心肌组织[D]. 邢玉洁. 第四军医大学. 2010