一、肝细胞原代培养研究综述（论文文献综述）
徐悦[1]（2021）在《瓦氏雅罗鱼鳃、肠组织及原代细胞在碱胁迫下的钙调蛋白表达机制研究》文中提出本研究以耐高碱自然优势种瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）作为研究对象,建立鱼体鳃、肠细胞的原代及传代培养体系,探究碱胁迫对瓦氏雅罗鱼原代鳃、肠细胞的增殖能力及功能的影响,同时分析了钙调蛋白（Calmodulin,CAM）在鳃、肠组织及细胞中的表达情况,从而在瓦氏雅罗鱼碱耐受机制角度达到对钙调蛋白作用机理的初步分析。基于此,本研究主要评估了瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞对急、慢性碱耐受性及鳃、肠组织的生长发育状态,观察了碱胁迫下瓦氏雅罗鱼血清中Ca2+含量,从而对钙调蛋白的基因表达量变化进行生理到组织再到细胞的多层次解读,其主要结果如下:1.瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞分离及原代培养方法的建立通过筛选培养条件,对瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞的最佳原代培养条件进行确定,并以此建立了稳定、可靠的鳃、肠原代细胞模型。本研究采用胰蛋白酶消化法和密度梯度离心法对鳃、肠细胞进行分离、纯化后,将细胞悬液均分置于DMEM（Dulbecco’s Modified Eagles Medium）、MEM（Minimum Essential Medium）和L-15（Leibovitz Medium）三种培养基中进行细胞培养实验。在该过程中,分时段分别采用血细胞计数板测定细胞增殖数,用细胞计数法测定细胞增殖率;同时,对其进行细胞来源和活性鉴定,分析原代鳃、肠细胞的生长状态。通过对两细胞系进行长期培养和形态学观察后发现:瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞原代培养时采用DMEM培养基可获得稳定、良好的培养效果,细胞生长状态显着优于L-15和MEM;启动原代培养的36-72 h,鳃、肠细胞生长代谢旺盛,其增殖规律符合经典“S”生长曲线;利用钙调蛋白camk2g2基因（Locus Tag Prefixes:J5810）可在全身表达的特点进行细胞来源鉴定后证实:两细胞确系分离自瓦氏雅罗鱼。2.碱胁迫对瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞活性及功能的影响为探讨碱胁迫对瓦氏雅罗鱼原代鳃、肠细胞活性及功能的影响,本研究建立瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞体外培养模型,采用NaHCO3作为主要耐受因素。实验过程如下:加入10 mmol/L NaHCO3的新鲜DMEM培养基于CO2培养箱中孵育1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后收集在660 nm（双波长法）处检测其吸光值,制作标准曲线确定波动范围以方便后续碱梯度实验指标测定。随后根据上述实验结果:设置NaHCO3浓度梯度分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、25、50和75 mmol/L对鳃、肠细胞系进行耐受,然后将其放入CO2培养箱中孵育3 h后,采用CCK-8法检测两细胞活性和存活率;DNA Ladder法测定鳃、肠细胞细胞凋亡及坏死情况,从而分析细胞生长代谢状态。结果显示:瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞的最佳耐受时长为3h,耐受NaHCO3的最佳浓度为25～50 mmol/L;该条件下孵育的鳃、肠细胞均出现细胞凋亡特征。上述实验表明:瓦氏雅罗鱼体外培养鳃、肠细胞可耐受25～50 mmol/L NaHCO3高浓度碱生境,且该生存条件对两细胞系的功能及活性皆可造成不同程度的细胞凋亡现象。3.钙调蛋白对瓦氏雅罗鱼鳃、肠组织及细胞功能的影响本部分实验分为组织学及细胞学两个层次。（1）体内实验:以瓦式雅罗鱼为研究材料,利用实验室前期转录组数据克隆camk2g2基因,并对实验鱼鳃、肠组织中的camk2g2基因进行RT-QPCR检测和序列比对,结果显示:在50 mmol/L碱胁迫条件下瓦式雅罗鱼碱水种（Alkali-water,AW）、淡水种（Freshwater,FW）的血钙含量未见显着差异（P>0.05）,两者的cDNA比对结果出现部分碱基不互补及缺失;克隆获得的瓦氏雅罗鱼camk2g2基因的ORF全长为684 bp,编码228个氨基酸（Locus Tag Prefixes:J5810）;RT-qPCR分析后发现:在鳃、肠组织中,camk2g2表达量在7 d时出现短暂下降,30 d时达到相对稳定且与对照组相比,各实验组均未见显着性差异（P>0.05）;与内质网应激反应关键基因xbp1u与氧化应激反应关键基因gsr的表达量对比后发现:在鳃、肠组织中的3个基因均有所表达且表达量随耐受时间的变化趋势与两者相似,均未见显着性差异（P>0.05）。（2）体外实验:以瓦氏雅罗鱼原代鳃、肠细胞为实验对象,选取3个NaHCO3浓度（0、25和50 mmol/L）进行梯度耐受,经3 h孵育后通过测定原代细胞胞内Ca2+含量、camk2g2基因、内质网应激反应关键基因xbp1u与氧化应激反应关键基因gsr表达量,来探讨离体条件下碱胁迫对瓦氏雅罗鱼钙调蛋白camk2g2的影响,并在细胞层面上探究该作用机制与非生物胁迫因子应激响应机制之间的潜在关联。结果显示:3 h碱耐受条件下,camk2g2在25 mmol/L NaHCO3耐受的鳃细胞中出现极显着表达（<0.01）,50 mmol/L NaHCO3耐受的鳃细胞中则出现显着性上升（<0.05）,但camk2g2在肠细胞中的表达量虽然随着碱度的增加而增加,但未见显着差异（>0.05）。上述结果表明:钙调蛋白camk2g2基因表达在鳃、肠细胞中普遍受到碱因素干扰,但鳃细胞对其更为敏感。加之,通过对内质网应激反应关键基因xbp1u与氧化应激反应关键基因gsr的基因表达量变化趋势分析后发现:细胞层面上,camk2g2表达量变化趋势与xbp1u和gsr相似且三基因均未见显着差异（>0.05）,这表明:camk2g2在瓦式雅罗鱼碱耐受方面发挥的作用与应激响应机制之间可能存在相关关系。
马雪莲[2]（2020）在《不同铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性及其基因表达的影响》文中进行了进一步梳理本论文通过3个试验,研究了不同铁源及铁水平对体外原代培养肉鸡鸡胚肝细胞铁含量、含铁关键酶活性及其基因表达以及铁蛋白基因表达的影响,从细胞及分子水平探讨了不同铁源在肉鸡肝细胞中代谢利用的机制。试验一旨在成功构建稳定、可靠的肉鸡胚肝细胞原代培养模型,为下一步不同水平铁和不同形态铁的试验奠定基础。选用健康的14胚龄爱拔益加（AA）肉鸡鸡胚为本试验的细胞供体,Leibovitz’s L-15培养液为基础培养液进行体外培养。结果表明:分离的肝细胞纯度较高、分化完全、功能健全,细胞活力好;细胞形态学、培养液乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）活性及MTT细胞持续活力结果基本相一致,即肝细胞原代培养细胞活力保持最佳的时间范围是在细胞培养的第3至6天。本试验成功建立了肉鸡鸡胚肝细胞原代培养模型,可用于后续的试验。试验二是在试验一的基础上,研究探讨了不同水平无机铁在不同孵育时间下对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞铁含量、含铁关键酶活性及其基因表达以及铁蛋白基因表达影响,确定了鸡胚肝细胞培养最适的铁添加水平和铁作用时间,为下一步不同形态铁源的试验奠定基础。本试验采用5×3两因子完全随机设计,以硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）为无机铁源,设置5个铁添加水平分别为0（对照）、0.25、0.5、0.75、1.00 mmol/L,以及3个细胞孵育时间分别为24、48和72 h,共组成共15个处理组,每个处理6个重复。结果表明:（1）孵育24、48和72 h时,肝细胞铁含量随着添加铁水平的升高而呈线性或二次曲线趋势升高（P<0.05）,过氧化氢酶（catalase,CAT）活性呈现二次曲线形式升高（P<0.05）,细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase,COX）活性呈现线性变化（P<0.05）,琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）活性则随孵育液中铁添加水平的升高而呈线性或二次曲线形式下降（P<0.01）;在铁添加水平为0.25或0.50 mmol/L、孵育时间为24 h时,肝细胞铁含量、CAT、SDH及COX活性均显着高于其他处理组（P<0.05）。（2）随着添加铁水平的升高,肝细胞SDH及FTH1 mRNA表达呈线性升高（P<0.05）,而CAT及COX7A2L mRNA表达呈线性或二次曲线形式升高（P<0.05）;孵育24、48及72 h时,与不添加铁组相比,添加0.50、0.75及1.00 mmol/L铁显着提高了COX1的mRNA水平（P<0.05）。（3）随着铁添加水平的升高,肝细胞CAT、SDH及COX1的蛋白表达均呈线性升高（P<0.05）;孵育24与72 h后的肝细胞SDH蛋白表达显着高于48 h（P<0.05）;孵育24、48及72 h,添加铁均显着提高了FTH1的蛋白表达（P<0.05）。综合以上结果,在提高肝细胞铁含量、以上含铁酶活性及其基因表达以及FTH1基因表达方面,较适宜的铁添加水平为0.25或0.5 mmol/L,孵育时间为24 h。试验三是研究不同形态铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞的铁含量、含铁关键酶活性及其基因表达以及铁蛋白基因表达的影响,进一步探讨了不同形态铁在鸡胚肝细胞中代谢利用的差异及其机制。本试验采用4?2+1两因子完全随机设计,设置4种铁源,分别为硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、弱络合强度的蛋氨酸铁（Fe-Met W;Qf=1.37）、中等络合强度的蛋白铁（Fe-Prot M;Qf=43.6）和极强螯合强度蛋白铁（Fe-Prot ES;Qf=8.59?103）;两个铁添加水平分别为0.25和0.50 mmol/L,另设一个不添加铁的对照组,共组成9个处理组,每个处理6个重复。结果表明:（1）与对照组相比,添加铁显着提高了肝细胞铁含量（P<0.05）;添加FeSO4·7H2O、Fe-Met W及Fe-Prot M组的肝细胞铁含量显着高于Fe-Prot ES组（P<0.05）,但FeSO4·7H2O、Fe-Met W及Fe-Prot M组间差异不显着（P>0.05）;与添加0.25 mmol/L铁组相比,添加0.5 mmol/L铁显着提高了肝细胞铁含量（P<0.05）。（2）与对照组相比,添加铁对肝细胞SDH、CAT及COX活性无显着影响（P>0.05）;添加铁源、铁水平及铁源与水平间的互作也未对肝细胞SDH、CAT及COX活性产生影响（P>0.05）。（3）与对照组相比,添加铁显着提高了肝细胞CAT、SDH及FTH1的mRNA表达水平（P<0.05）;添加0.50 mmol/L铁组肝细胞的CAT mRNA水平显着低于添加0.25 mmol/L铁组（P<0.05）,但其FTH1mRNA水平却显着高于添加0.25 mmol/L铁组（P<0.05）;添加Fe-Prot M和Fe-Met W组肝细胞的SDH mRNA表达水平显着高于添加Fe-Prot ES和FeSO4·7H2O组（P<0.05）,而添加Fe-Met W与Fe-Prot M组间及FeSO4·7H2O与Fe-prot ES组间均无显着差异（P>0.05）。（4）与对照组相比,添加铁显着降低了肝细胞CAT和SDH的蛋白表达（P<0.05）,显着提高了COX1和FTH1的蛋白表达（P<0.05）,且添加0.25 mmol/L铁组的FTH1蛋白表达显着高于添加0.50 mmol/L铁组（P<0.05）。但添加铁源、铁水平及两者的互作对肝细胞CAT、SDH、COX1的蛋白表达均未产生显着影响（P>0.05）。综上所述,添加无机铁可在转录和翻译水平上直接正调控肉鸡鸡胚肝细胞中CAT、COX1和FTH1的基因表达;在提高肝细胞铁含量方面,中等和弱络合强度有机铁及无机硫酸亚铁优于极强螯合强度有机铁,而在提高肝细胞的SDH mRNA水平方面,中等和弱络合强度有机铁优于极强螯合强度有机铁和无机硫酸亚铁,提示极强螯合强度有机铁可能因其螯合键太强而不易释放利用,故其在肉鸡鸡胚肝细胞中的代谢利用性不如弱和中等络合强度有机铁。以上研究新成果可为阐明不同形态铁在肉鸡肝细胞内的代谢利用及其分子机制提供科学试验依据。
郁浓[3]（2020）在《大豆水提物、豆粕水提物对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）原代培养肝细胞氧化损伤作用的研究》文中指出为了探讨豆粕、大豆对肝细胞是否具有损伤作用及其作用机制,以大豆水提物（Soybean aqueous extract,SAE）、豆粕水提物（Soybean meal aqueous extract,SMAE）为实验材料,以草鱼离体培养的原代肝细胞为试验对象,将SMAE、SAE分别以终浓度为0、0.5、5.0、10.0 mg/mL加入到细胞培养液中培养24h后进行取样分析,研究其对肝细胞的氧化损伤、调控和代谢机制。本文的主要内容如下:第一部分:SAE、SMAE对草鱼原代肝细胞氧化损伤的影响采用CCK-8法检测细胞活力,透射电子显微镜观察肝细胞的超微结构,对细胞核进行Hoechst 33285荧光染色观察,检测细胞抗氧化相关酶活力,此外,检测细胞凋亡率、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的变化及细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的含量。结果表明,随着水提物浓度的升高,肝细胞相对活力下降,细胞活力与浓度呈正相关关系。低浓度（0.5 mg/mL、2.5 mg/mL）下的SAE、SMAE组细胞活力与对照组相比无显着性差异。SAE组（5.0 mg/mL、10.0 mg/mL）剂量下相对细胞相对活力分别为78.10±8.57%、65.97±7.35%,与对照组相比具有极显着差异（P<0.01）,同浓度下的SMAE组细胞相对活力分别为86.35±7.17%、80.26±7.08%,与对照组相比有极显着差异（P<0.01）。肝细胞超微结构可见染色质沿核膜的环状凝结、稀疏的光密度、线粒体肿胀和数量的减少、脂滴堆积等。Hoechst 33285染色观察到10.0 mg/mL浓度下的SAE和SMAE组荧光强度明显减弱,染色不均匀（染色质凝集）,核破碎,少数凋亡小体出现。在低剂量组（0.5 mg/mL、2.5 mg/mL）细胞上清液中的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放量与对照组相比无差异,高剂量组（5.0 mg/mL、10.0mg/mL）中,培养液中的LDH含量与对照组相比,差异极显着（P<0.01）。培养液中的丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量趋势呈现上升状态（P<0.01）,SAE和SMAE高剂量（5.0 mg/mL、10.0 mg/mL）组细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性和还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）活性与对照组相比有显着性差异（P<0.05）。通过流式细胞术检测细胞MMP和ROS水平,SAE和SMAE能够显着降低MMP,增加细胞内ROS含量（P<0.05）。经SAE、SMAE处理后,凋亡细胞比例明显升高（P<0.05）。凋亡细胞数量呈剂量依赖性增加。0.5 mg/mL和2.5 mg/mL剂量组与对照组的凋亡比相比没有显着性差异,5.0 mg/mL 和 10.0 mg/mL 浓度 SAE 组凋亡比为 22.55±4.35%、55.03±2.76%,SMAE组的凋亡比分别为32.67±5.79%、37.11±8.57%,均与对照组相比有极显着差异（P<0.01）。以上结果表明,SAE和SMAE对肝细胞的损伤程度与添加量呈正相关,且SAE与SMAE表现出相同的损伤作用,当添加量超过5.0 mg/mL时,与对照组相比有显着性差异。SAE和SMAE会导致细胞超微结构改变,细胞内ROS水平升高,细胞抗氧化系统的紊乱和线粒体结构和功能的异常,最终影响细胞活力,触发细胞死亡途径。第二部分:SAE、SMAE引起草鱼原代肝细胞损伤的转录组分析为了阐明水提物在整体水平上是如何影响肝细胞正常生命活动,通过采用RNA-seq的转录组学在整体水平上分别分析正常组、SAE（5.0 mg/mL）组和SMAE（5.0 mg/mL）组肝细胞转录本,根据统计学差异标准,默认参数:p-adjust<0.05和|log2FC|>=1,筛选差异表达基因,将差异表达基因进行GO功能注释、GO富集分析,KEGG pathway信号通路富集分析（Corrected P-Value<0.05）对其进行系统研究。本研究中SAE组肝细胞获得了 869个差异表达基因,上调337个,下调532个。结果显示,SAE组差异富集最显着的基因群主要涉及“蛋白质水解的调控”、“水解酶活性的负调控”、“细胞脂质代谢过程”、“类异戊二烯代谢过程”等生物学过程;“酶活性抑制剂”、“肽酶抑制剂活性”、“肽链内切酶抑制剂活性”、“氧化还原酶活性”等分子功能,位于“细胞外空隙”及“细胞外区域部分”等细胞组分。显着富集的KEGG调控通路也多集中在“类固醇生物合成”、“补体和凝血级联”、“PPAR信号通路”、“细胞因子-受体相互作用”以及营养物质的代谢合成通路等。SMAE组获得了 1451个差异表达基因,上调440个基因,下调101 1个基因。将注释基因进一步差异表达分析,SMAE组差异富集最显着的基因群主要涉及“氧化还原过程”、“催化活性的负调节”、“小分子代谢过程”以及蛋白质水解代谢相关调控等生物学过程;“氧化还原酶活性”、“肽酶调节”、“肽酶抑制剂活性”等相关分子功能,位于“细胞外空隙”及“细胞外区域部分”等细胞组分。显着富集的KEGG调控通路也多为集中在“补体和凝血级联”、“细胞因子-受体相互作用”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“甘油三酯代谢”以及“NFκB信号通路”等。上述结果表明,富集到的通路多与炎症反应,蛋白质、氨基酸和脂类代谢有关,说明肝细胞的营养代谢发生紊乱,细胞膜受体介导信号转导功能受到调控,引起机体能量代谢发生变化。且SAE组肝细胞富集到“类固醇生物合成”、“PPAR信号通路”、“花生四烯酸代谢”、脂肪酸代谢等多个脂肪酸代谢途径,通过“类固醇生物合成通路”调控肝细胞脂肪沉积。第三部分:代谢组学对SAE、SMAE调控草鱼原代肝细胞代谢的研究采用UPLC/MS技术获取对照组和5.0 mg/mL浓度下SAE组、SMAE肝细胞的代谢物轮廓信息,包括胞内代谢物和胞外代谢物,利用多元统计分析方法如主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析法（OPLS-DA）,通过变量重要性投影（VIP>1）选取潜在的生物标志物,结合质谱碎片信息和数据库检索对潜在生物标志物进行结构鉴定。结果显示结果表明大多数样品都落在95%置信区间的椭圆形内,无离群点,且SAE组和SMAE组肝细胞代谢物表型的聚类分布均偏离对照组。细胞内液中对照组分别与SAE、SMAE共筛选出的1 1个内源性小分子代谢物被视为水提物对肝细胞内源性代谢产生扰动的潜在生物标记物,分别是UDP-D-半乳糖（UDP-D-galactose）、1-羟基-3-壬酮（1-Hydroxy-3-nonanone）、7-羟基甲氨蝶呤（7-hydroxymethotrexate）、磺基转移酶家族成员（{[（3E）-4-（5-hydroxy-1-oxo-1H-isochromen-3-y1）but-3-en-1-y1]oxy}sulfonic acid）和精氨酰-脯氨酸（Arginyl-Proline）表现为上调趋势,谷胱甘肽（Glutathione）、L-精氨酸（L-Arginine）、吲味（Indole）、磷脂酰丝氨酸（PS（14:0/16:1（9Z）））、直链淀粉（Amylose）和吲哚乙醛（Indoleacetaldehyde）表现为下调趋势。将鉴定到的差异代谢物输入MetaboAnalyst的MetPA平台构建关联代谢通路,主要集中在谷胱甘肽代谢、精氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢通路。在细胞外液代谢组中筛选出 30个显着差异代谢物,分别是N-酰基-L-苯基丙氨酸（N-Acetyl-L-phenylalanine）、N-酰基-D-苯基丙氨酸（N-Acetyl-D-phenylalanine）、N-乙酰鸟氨酸（N-Acetylornithine）、胆碱（Choline）、L-组氨酸（L-Histidine）、5,6-对甲苯胺（5,6-DHET）、香草醛（Vanillin）、直链淀粉、鸟苷（Guanosine）、鸟嘌呤（Guanine）、吡啶衍生物（5-（3-Pyridyl）-2-hydroxytetrahydrofuran）等,集中在组氨酸代谢和嘌呤代谢两条通路上。上述结果表明,内源性产物在整个代谢轨迹中产生了强烈的扰动而且与造成肝细胞损伤密切相关,组氨酸代谢和嘌呤代谢通路对细胞TCA循环、核苷酸代谢、氨基酸代谢紊乱进而引起肝脏的炎症,导致肝内脂类聚集并影响细胞膜完整性。
骆东梅[4]（2020）在《山羊乳腺上皮长链脂肪酸跨膜转运特征研究》文中进行了进一步梳理本试验以山羊乳腺上皮细胞为研究对象,研究了四种长链脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸）在山羊乳腺上皮细胞中的跨膜转运特征。试验一:选用乳汁分离法进行山羊乳腺上皮细胞分离培养,通过角蛋白-18荧光染色和β-酪蛋白基因表达的RT-PCR分析,对山羊乳腺上皮细胞进行鉴定。试验二:配制终浓度为60 μM 13C标记与未标记的长链脂肪酸混合液分别处理山羊乳腺上皮细胞0、1、2、4、6、12、24h,测定细胞δ13C值计算出山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸摄取最快的时间点。试验三:在试验二的基础上,分别配制终浓度为0,25,50,100,200,400,600,800 μM 13C标记与未标记的长链脂肪酸混合液处理细胞2 h,测定细胞δ13C值计算出山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸摄取的最佳浓度。试验四:在试验二和试验三的基础上选取处理时间2 h和终浓度50μM用于后续试验,研究不同抑制剂（β-环糊精、甲基-β-环糊精、二异硫氰酸二磺酸DIDS、硫基琥珀酰亚胺马来酰亚胺油酸酯SSO和根皮素）对山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸跨膜转运的影响。结果表明:1山羊乳腺上皮细胞原代分离及鉴定从乳汁中可以获得较少数量的乳腺上皮细胞供原代培养,该方法分离的细胞纯度高,获取细胞的周期较长但不易污染。角蛋白-18荧光染色显示细胞的红色荧光明显;细胞在诱导培养基中培养48 h后检测到β-酪蛋白的基因表达,证明所获得的细胞为正常生长且具有一定泌乳功能的山羊乳腺上皮细胞。2山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸跨膜转运的时间依赖性研究山羊乳腺上皮细胞对棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的摄取呈现时间依赖的饱和性,在处理2h时乳腺上皮细胞对棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的摄取速率最快。因此,选择2h作为后续试验的时间点。3山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸跨膜转运的浓度依赖性研究乳腺上皮细胞对棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的摄取呈现浓度依赖的饱和性。棕榈酸吸收的米氏常数（Km）为88.72μM,最大吸收速度（Vmax）为75.19 μmol h-1 million cells-1;硬脂酸吸收的 Km 值为 61.61μM,Vmax 值为 12.00 μmol h-1 million cells-1;油酸吸收的 Km 值为 50.82μM,Vmax值为 20.58 μmol h-1 million cells-1;亚油酸吸收的 Km 值为 48.29μM,Vmax 值为 21.60μmol h-1 million cells-1。以上四种长链脂肪酸的平均Km值为62.36μM,在测试的浓度中,50μM浓度与平均Km值最接近,因此选择终浓度50μM用于后续试验。4不同膜蛋白抑制剂对山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸跨膜转运的影响试验结果显示,山羊乳腺上皮细胞对四种长链脂肪酸的摄取受到膜蛋白抑制剂的影响,不同抑制剂对山羊乳腺上皮细胞摄取长链脂肪酸的抑制效果存在差异。β-环糊精对油酸的最高抑制作用为31.2%（P<0.01）,甲基-β-环糊精对硬脂酸的最高抑制作用为31.7%（P<0.01）,而SSO对亚油酸有最高抑制作用为17.3%（P<0.01）。综上所述,乳汁分离法所获得的细胞为正常生长并具有一定生物学功能的山羊乳腺上皮细胞。山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸的跨膜转运存在时间和浓度依赖性,其对长链脂肪酸吸收最佳的时间为2 h,终浓度为50μM。而膜蛋白抑制剂抑制细胞中长链脂肪酸跨膜转运的结果表明,蛋白介导方式在山羊乳腺上皮细胞中长链脂肪酸的跨膜转运具有重要作用。
滑晓莉[5]（2020）在《基于AMPK/PGC-1α通路探讨亚甲蓝对脓毒症脑能量代谢调控作用》文中研究说明目的:本研究的目的是在观察脓毒症相关性脑病（Sepsis-associated Encephalopathy,SAE）线粒体损伤的基础上,探讨亚甲蓝（Methylene Blue,MB）通过AMPK/PGC-1α通路对SAE脑能量代谢的调控作用。主要研究包括:1)制备脓毒症相关性脑病的细胞实验模型,观察线粒体损伤,三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）水平、细胞凋亡等;2)探讨MB在SAE细胞模型中对AMPK/PGC-1α通路的激活以及能量调控;3)建立Wistar大鼠脓毒症模型,探讨亚甲蓝在SAE动物模型中对SAE Wistar大鼠的AMPK/PGC-1α通路的激活以及能量调控。方法:1)应用细胞原代培养技术分离纯化Wistar大鼠乳鼠（出生3天以内）的大脑皮质星形胶质细胞,进行纯度鉴定后,以不同浓度的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和20 ng/mL的干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）联合孵育,依照孵育时间（6h,12h,24h,48h）以及脂多糖的浓度（50 ng/mL,100 ng/mL,200 ng/mL）制备脓毒症相关性脑病的细胞实验模型,通过对比细胞活力,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白介素-6（IL-6）,一氧化氮（NO）,活性氧（ROS）,星形胶质细胞形态的改变,确认模型成功制备。通过观察细胞凋亡比、线粒体网格形态、线粒体膜电位观察SAE细胞模型下的星形胶质细胞的线粒体损伤。通过Western blot实验观察线粒体生物发生以及线粒体动力学相关指标的变化,包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A,TFAM）、核呼吸因子-1（nuclear respiratory factor-1,NRF1）、视神经萎缩l基因蛋白（optic atrophy l gene protein,OPA1）、动力相关蛋白1（dynamin-related protein,DRP1）,测定能量指标ATP,观察细胞凋亡;2)在第一部分研究基础之上,以100ng/mL的LPS联合20 ng/mL的IFN-γ分别孵育原代培养的星形胶质细胞6h和48h,模拟SAE细胞模型的早期和晚期SAE疾病环境。对上述SAE细胞模型均分别给予MB（0.01 nmol/mL）和MB（0.01nmol/mL）+Compound C（10nmol/mL）6h干预。分别探讨MB在SAE细胞模型的早期和晚期对AMPK/PGC-1α通路激活的分子机制,以及在细胞研究水平上观察MB对线粒体生物发生相关指标,包括PGC-1α,TFAM,NRF1,能量指标ATP、细胞凋亡、ROS的影响;3)选用成年雌性,体重180-200g左右的Wistar大鼠,行盲肠结扎穿孔（Cecal ligation and puncture,CLP）术制备脓毒症动物实验模型。CLP术后24h后根据脑电图出现广泛而较为持久的θ波以及神经行为学评分确认为SAE模型。对SAE组动物随机给予亚甲蓝（0.15mg/100g）腹腔注射,6h后处理各组动物,采集血清,提取大鼠大脑皮质蛋白。通过Western blot实验观察SAE大鼠大脑皮质组织的线粒体生物发生相关蛋白水平,凋亡指标,ATP的变化;探讨亚甲蓝腹腔注射对SAE大鼠的大脑皮质组织AMPK/PGC-1α通路的调控、对大脑皮质组织ATP含量及凋亡的影响。结果:1)用LPS和IFN-γ联合孵育原代培养的星形胶质细胞,制备SAE的体外实验模型,和control对比,SAE细胞活力下降,IL-6、TNF-α、ROS和NO增高,SAE模型的星形胶质细胞胞体变大,突起变粗,确认成功制备模型;2)观察SAE细胞实验模型,发现星形胶质细胞的线粒体生物发生相关蛋白水平（PGC-1α,TFAM,NRF1）,线粒体融合及分裂相关蛋白水平（OPA1和DRP1）在LPS和IFN-γ联合孵育6h,随着LPS浓度的增加,表达逐渐上升,联合孵育12h,上述指标随着LPS浓度的增加表现为先上升后下降,在联合孵育24h及48h,上述指标随着LPS的浓度的增加,表现下降趋势,细胞内ATP含量呈现较为接近的变化趋势;3)在SAE细胞实验模型里,和对照组对比,MB在6h及48h组都增加了p-AMPK表达,增强了细胞线粒体生物发生,增加了细胞内ATP含量,在6h组,凋亡比下降,在48h组,未见凋亡比下降;4)在SAE动物实验模型,发现CLP术后24h,和sham组及CLP组对比,SAE组和SAE+MB组的神经行为学评分下降,血清S100β、GFAP、NSE升高,MB增加了SAE大鼠大脑皮质组织p-AMPK表达,增强了线粒体生物发生蛋白表达,增加细胞内ATP含量,改善凋亡。结论:原代培养的星形胶质细胞的线粒体生物发生以及细胞ATP水平在SAE体外实验模型早期增强,晚期减弱;在细胞水平和组织水平的研究,均发现MB可以通过激活AMPK/PGC-1α通路增强线粒体生物发生,改善SAE细胞能量水平及细胞凋亡。
王忠彦[6]（2019）在《IL-33诱导自噬缓解小鼠实验性肠炎的机制研究甘草甜素促进IL-25表达缓解刀豆蛋白A所致小鼠急性肾损伤的作用与机制研究》文中提出背景:白细胞介素-33（Interleukin-33,IL-33）是新近发现的IL-1细胞因子家族成员,广泛表达于内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞等多种细胞类型,参与感染性疾病、炎症性疾病、自身免疫病等多种疾病的发病机制和病理过程。IL-33是一种双功能分子,既可作为核转录因子参与基因表达调控,也可作为细胞因子释放到细胞外空间,通过IL-33/ST2信号通路促进Th2型免疫反应。与常规细胞因子不同,IL-33可作为一种内源性危险信号（DAMP）或“警报素（Alarmin）”在细胞损伤后主动迅速释放,在感染和组织损伤初期激活免疫系统、放大炎症反应。近年来发现,IL-33/ST2在炎症性肠病状态下,尤其是在溃疡性结肠炎患者肠黏膜内的表达明显增加,提示IL-33在炎症性肠病中起着重要作用。然而迄今为止,IL-33在炎症性肠病中所扮演的角色仍然存在争议,其在肠道炎症环境中的确切作用和机制仍知之甚少。自噬（Autophagy）是一种进化保守的细胞生存机制,通过溶酶体途径降解受损细胞器或毒性蛋白而维持细胞稳态。自噬也被认为是炎症反应的重要效应器和调节器,在调控适度炎症反应、维持细胞和组织内平衡中起着至关重要的作用。多种细胞因子可调节自噬,自噬也可影响多种细胞因子的生成和分泌,而IL-33与自噬之间的关系有待阐明。TLR4是经典的炎症信号通路,又是自噬启动传感器,有报道显示IL-33与TLR4通路之间存在作用。本课题组在先前的研究中证实,IL-33通过促进Th2/Foxp3+调节性T细胞反应改善小鼠实验性肠炎。然而,在小鼠实验性肠炎环境中IL-33对自噬的影响,以及自噬在小鼠实验性肠炎中的作用和机制尚不清楚。目的:探讨警报素IL-33在小鼠实验性肠炎中对细胞自噬的影响,以及IL-33与自噬在肠道急性炎症反应中的作用与机制,为探究细胞因子与自噬之间的相互作用关系及其在炎症性疾病发病机制和病理进程中的调节作用与治疗意义提供实验依据,为治疗炎症性肠病寻找新的潜在生物学靶标。方法:一、体内实验1.实验动物分组:将小鼠随机分为正常对照组（单用PBS）、TNBS肠炎组、乙醇对照组、PBS对照组（TNBS+PBS）、IL-33治疗组（TNBS+IL-33）、3-MA干预组（TNBS+IL-33+3-MA）。2.模型建立及药物处理:用2.5%TNBS（100μL/只）诱导建立小鼠急性肠炎模型,乙醇对照组给予同体积50%无水乙醇作为建模对照,正常对照组给予同体积无菌PBS作为正常对照。其他各组在TNBS造模后给予相应试剂或药物处理（每天1次）:IL-33治疗组小鼠腹腔注射IL-33（2μg/只）;PBS对照组小鼠腹腔注射无菌PBS（与IL-33同体积）;3-MA组小鼠腹腔注射IL-33后,立即腹腔注射3-MA（24mg/kg）。3.TNBS造模和药物处理后,分别在第0、1、2、3、4天相同时间观察各组小鼠的体重变化、大便隐血、疾病活动指数等急性肠炎相关指标,并于第4天观察结肠大体病理变化、结肠组织病理学变化等指标,评估小鼠肠炎发病情况及治疗效果。4.TNBS造模和药物处理第4天,用Western Blot法检测结肠组织中自噬标志蛋白LC3II/I和自噬相关蛋白P62的表达,评估IL-33对结肠组织细胞自噬状态的影响。5.用Beclin-1和F4/80免疫荧光抗体共染小鼠结肠组织,激光共聚焦显微镜检测结肠组织中Beclin-1表达和定位,评估IL-33对结肠组织中巨噬细胞自噬的影响。6.用ELISA法检测结肠组织及血清中促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ和抑炎性细胞因子IL-5、IL-13的水平,观察IL-33诱导自噬对细胞因子水平的影响。7.用TLR4基因敲除小鼠建立TNBS肠炎模型并用IL-33治疗,用Western Blot检测小鼠结肠组织LC3II/I和P62含量,观察TLR4在IL-33诱导结肠组织巨噬细胞自噬中的作用。二、体外实验体外原代培养野生型、TLR4敲除和IL-33敲除小鼠骨髓源性巨噬细胞,分为空白对照组、PBS对照组、IL-33刺激组和EBSS饥饿组,分别进行以下实验:1.体外实验一:野生型巨噬细胞原代培养第6天,用GFP-LC3质粒转染巨噬细胞,IL-33刺激组用IL-33（100ng/m L）刺激24h,其他各组分别加入相应试剂或药物作为对照,激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞中自噬体形成情况,观察IL-33在巨噬细胞自噬中的作用。2.体外实验二:野生型巨噬细胞原代培养第7天,IL-33刺激组用IL-33（100ng/m L）刺激,其他各组分别加入相应试剂或药物作为对照,Western Blot检测巨噬细胞中自噬标志蛋白LC3II/I和P62的含量,观察IL-33在巨噬细胞自噬中的作用。3.体外实验三:原代培养野生型和TLR4基因敲除小鼠巨噬细胞,IL-33处理组用IL-33（100ng/m L）刺激,其他各组分别加入相应试剂或药物作为对照,Western Blot检测巨噬细胞中自噬标志蛋白LC3II/I和P62的含量,观察TLR4在IL-33诱导巨噬细胞自噬中的作用。4.体外实验四:原代培养野生型和IL-33基因敲除小鼠巨噬细胞,用自噬激活剂雷帕霉素刺激（500ng/m L）24h,Western Blot检测巨噬细胞中自噬标志蛋白Beclin-1的表达,观察IL-33基因敲除对巨噬细胞自噬的影响。结果:1.与正常对照组和乙醇对照组小鼠相比,TNBS肠炎组小鼠体重明显下降,疾病活动指数、结肠大体病理评分和结肠组织病理学评分均显着增高,差异有统计学意义（P<0.001）,表明TNBS灌肠后小鼠出现明显的急性肠炎症状,TNBS诱导的小鼠急性肠炎模型建立成功。2.与TNBS肠炎组和PBS对照组小鼠相比,IL-33治疗组小鼠体重较快回升,疾病活动指数、结肠大体病理和组织病理损伤显着改善,相关评分显着降低,差异有统计学意义（P<0.01、P<0.05）,表明IL-33治疗可显着改善小鼠急性肠炎症状。3.Western Blot检测结果显示,与正常对照组相比,IL-33治疗组小鼠结肠组织中LC3Ⅱ表达增加,P62表达减少,LC3Ⅱ/β-actin比值显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）,表明IL-33可诱导小鼠结肠组织细胞自噬。4.阻断自噬后结肠大体病理和组织病理观察显示,与IL-33治疗组小鼠相比,3-MA干预组小鼠急性肠炎症状明显加重,结肠大体病理评分和组织病理评分显着增高,差异有统计学意义（P<0.01、P<0.05）,表明阻断IL-33-autophagy途径能够消减IL-33对急性肠炎的缓解作用,提示IL-33至少部分通过诱导自噬而缓解急性肠炎。5.结肠组织切片免疫荧光染色显示,与TNBS肠炎组相比,IL-33治疗组小鼠结肠组织中F4/80阳性细胞内Beclin-1表达明显增加,表明IL-33治疗能够显着增强结肠组织内巨噬细胞的自噬活性。6.激光共聚焦显微镜观察原代培养巨噬细胞中GFP-LC3表达,结果显示与空白对照组和PBS对照组相比,IL-33处理组巨噬细胞内可见多个明亮的绿色荧光斑点,表明IL-33处理后巨噬细胞自噬活性显着升高。7.Western Blot检测原代培养巨噬细胞中LC3II/I表达,结果显示与空白对照组和PBS对照组相比,IL-33刺激组巨噬细胞LC3Ⅱ表达增加,LC3II/β-actin比值显着升高,差异有统计学意义（P<0.001）。本结果与结果6共同提示IL-33可在原代培养的巨噬细胞中诱导自噬。8.Western Blot检测原代培养的IL-33-/-巨噬细胞Beclin-1表达,结果显示与野生型巨噬细胞相比,IL-33-/-巨噬细胞中Beclin-1表达明显减少,Beclin-1/β-actin比值显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,表明IL-33敲除后巨噬细胞对雷帕霉素诱导自噬的敏感性显着降低,提示IL-33是巨噬细胞自噬的关键调节因子。9.Western Blot检测野生型和TLR4敲除小鼠结肠组织LC3II/I表达,结果显示与野生型小鼠相比,TLR4-/-小鼠结肠组织LC3Ⅱ表达减少,LC3Ⅱ/β-actin比值显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）,表明TLR4敲除后小鼠结肠组织对IL-33诱导自噬的敏感性显着降低,提示TLR4信号通路是IL-33诱导巨噬细胞自噬的必要途径。10.Western Blot检测野生型和TLR4敲除小鼠原代培养巨噬细胞LC3II/I表达,结果显示与野生型小鼠相比,TLR4-/-巨噬细胞LC3Ⅱ表达减少,LC3Ⅱ/β-actin比值显着降低,差异有统计学意义（P<0.001）,本结果与结果9从体内和体外两方面证明IL-33可能通过TLR4信号通路诱导巨噬细胞自噬。11.ELISA法检测IL-33治疗对结肠组织和血清中相关细胞因子水平的影响,结果显示与PBS对照组相比,IL-33治疗组小鼠的血清中促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ水平均显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,而抑炎性细胞因子IL-5、IL-13水平均显着增加,差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）,表明IL-33可在急性肠炎环境下促进促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子的平衡。12.ELISA法检测阻断自噬对相关细胞因子水平的影响,结果显示与IL-33治疗组相比,3-MA干预组小鼠结肠组织和血清中促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ水平均显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）,而抑炎性细胞因子IL-5、IL-13水平均显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,表明阻断自噬能够消减IL-33对促炎性和抑炎性细胞因子的平衡效应,提示IL-33通过诱导自噬促进细胞因子平衡。结论:1.IL-33通过增强自噬缓解TNBS诱导的小鼠实验性急性肠炎。2.IL-33是巨噬细胞自噬的关键调节因子。3.IL-33通过TLR4信号通路诱导巨噬细胞自噬。4.IL-33通过诱导自噬调节促炎性和抑炎性细胞因子平衡。5.IL-33-TLR4-Autophagy是IL-33调控小鼠肠道急性炎症反应的重要机制。背景:急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）在发展中国家和发达国家的发病率均不断升高,且目前尚缺乏有效的治疗药物。尤其值得关注的是,AKI在急性肝衰竭（Acute Liver Failure,ALF）背景下具有较高的发生率,且与不良的预后和较高的死亡率相关。因此,在ALF背景下开展AKI研究已经成为一个迫切而有意义的研究领域,包括建立肝肾共损伤的实验动物模型,在模拟“ALF+AKI”的实验动物模型中探讨AKI的发病机制,以及筛选对ALF和AKI均有治疗作用的药物。甘草甜素（Glycyrrhizin,GL）在急性肝损伤和慢性肝炎中的治疗作用已经被大量研究所证实。由于GL对肝脏功能的显着保护作用,以及初步显现出来的对于肾脏疾病的治疗效果,提示GL可能成为肝肾共损伤疾病的候选药物。但是,GL在急性肾损伤中的作用与机制还有待进一步研究。单核/巨噬细胞系统在肾脏组织内稳态和免疫炎症反应中起着重要作用,促炎性M1和抗炎性M2巨噬细胞的不同极化方向决定着肾组织的损伤、修复以及肾间质纤维化的进程,因此,以促进M2型巨噬细胞极化为基础的治疗是一种很有前景的肾脏疾病治疗策略。白细胞介素-25（Interleukin-25,IL-25）可靶向巨噬细胞并向巨噬细胞传递负调节信号,并抑制促炎细胞因子的产生,然而IL-25在肾脏疾病中的作用与机制仍有待阐明。目的:探讨甘草甜素对Con A所致急性肾损伤的治疗作用以及细胞和分子机制,为临床应用甘草甜素治疗急性肾损伤提供实验依据。方法:第一部分:甘草甜素在Con A所致小鼠急性肾损伤中的作用1.模型建立及药物处理:将同批次C57BL/6小鼠随机分成4组:PBS对照组、Con A模型组、GL对照组、GL治疗组。Con A模型组小鼠尾静脉注射Con A（15mg/kg）;PBS对照组小鼠尾静脉注射同体积PBS;GL对照组腹腔注射GL（200mg/kg）;GL治疗组腹腔注射GL（200mg/kg）预处理后再注射Con A。2.药物处理10h后,观察小鼠肝脏和肾脏大体病理变化,称量并计算肝脏和肾脏指数,同时采集各组小鼠血清、尿液以及肝脏和肾脏组织样本,用于相关生化指标检测和组织病理学观察。3.对肝脏和肾脏组织切片进行HE染色和PAS染色,观察肝脏和肾脏组织病理学变化情况,评估Con A对肝脏和肾脏损伤的影响。4.用全自动生化分析仪测定小鼠肝脏功能相关生化指标血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平,评估肝脏损伤程度和药物作用效果。5.ELISA法测定小鼠肾脏功能相关生化指标血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）和尿肌酐（UCr）水平,评估肾脏损伤程度和药物作用效果。6.分别用ELISA法和免疫组化法检测肾脏组织中IL-25的表达水平,观察GL治疗对肾脏组织中IL-25表达的影响。第二部分:甘草甜素促进IL-25表达诱导M2型巨噬细胞极化缓解小鼠急性肾损伤1.动物分组及药物处理:将同批次C57BL/6小鼠随机分成4组:PBS对照组、Con A模型组、IL-25对照组和IL-25治疗组。其中IL-25治疗组腹腔注射IL-25（100μg/只）预处理小鼠后再注射Con A（15mg/kg）,IL-25对照组腹腔注射同体积IL-25。2.末次给药10h后观察小鼠肾脏大体病理变化、肝脏和肾脏指数,同时采集小鼠血清、尿液以及肾脏组织样本,用于相关生化指标检测和组织病理学观察。3.对肾脏组织切片进行PAS染色,观察肾脏组织病理学变化情况,评估IL-25在急性肾损伤中的作用效果。4.ELISA法测定小鼠肾脏功能相关生化指标血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）和尿肌酐（UCr）水平,评估IL-25对AKI小鼠肾脏功能的影响。5.免疫荧光染色检测肾脏组织中CD206的表达,观察IL-25对肾脏组织中巨噬细胞极化的影响。6.原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,分别用Con A或IL-25连续刺激10小时,ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β和IL-10水平,观察IL-25对巨噬细胞分泌促炎性（IL-1β）和抑炎性（IL-10）细胞因子的影响。7.原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,分别用Con A或IL-25连续刺激10小时,免疫荧光法检测CD206表达,流式细胞术检测巨噬细胞TLR4表达,观察IL-25对巨噬细胞CD206和TLR4表达的影响。8.原代培养TLR4-/-小鼠和TLR2-/-小鼠腹腔巨噬细胞,并分别用IL-25和Con A刺激10h,免疫荧光法检测巨噬细胞CD206的表达,分析IL-25诱导巨噬细胞极化的可能信号通路。结果:1.成功建立肝肾共损伤小鼠模型:大体标本病理观察显示,与PBS对照组相比,Con A模型组小鼠肝脏和肾脏均有明显炎症表现;肝脏和肾脏指数均显着升高（P<0.05）;肝脏和肾脏组织病理学损伤评分显着增加（P<0.001）;血清ALT和AST水平显着升高（P<0.01）,血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平显着升高（P<0.01）,尿肌酐（UCr）水平显着降低（P<0.01）,表明Con A尾静脉注射可同时造成小鼠肝脏和肾脏急性损伤。2.与Con A模型组小鼠相比,GL治疗组小鼠肾脏指数显着降低（P<0.05）;肾脏组织病理学损伤评分显着降低（P<0.05）;血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平显着降低（P<0.05）,尿肌酐（UCr）显着回升（P<0.05）,表明GL能够显着改善小鼠急性肾损伤的病理损伤程度。3.与Con A模型组小鼠相比,GL治疗组小鼠肾脏组织匀浆和组织切片中IL-25表达显着增加（P<0.01）;并且与Con A模型组相比,GL治疗还明显逆转了由Con A引起的IL-25下降（P<0.01）,提示甘草甜素对小鼠急性肾损伤的治疗作用可能与促进IL-25表达有关。4.与Con A模型组小鼠相比,IL-25治疗组小鼠肾脏组织病理学损伤评分显着降低（P<0.01）;血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平显着降低（P<0.05）;尿肌酐（UCr）水平显着升高（P<0.01）,表明IL-25对小鼠急性肾损伤具有保护作用。5.分别用Con A和IL-25刺激原代培养的腹腔巨噬细胞,与PBS对照组相比,IL-25处理组细胞培养液中IL-10水平显着升高（P<0.01）、IL-1β水平无明显变化（P>0.05）。与单用Con A组相比,Con A+IL-25组细胞培养液中IL-10水平显着升高（P<0.01）,IL-1β水平显着降低（P<0.05）,表明IL-25处理可促进巨噬细胞分泌抑制性细胞因子IL-10,而抑制巨噬细胞分泌炎症性细胞因子IL-1β,提示IL-25在急性肾损伤中至少部分地通过调节细胞因子平衡而发挥抗炎作用。6.小鼠肾脏组织免疫荧光染色显示,与PBS对照组相比,单用IL-25治疗显着增强肾脏组织中CD206的表达（P<0.01）;与Con A模型组相比,Con A+IL-25治疗显着增强了肾脏组织中CD206的表达（P<0.01）。在原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞中,IL-25处理也显着增加了CD206的表达（P<0.01）,表明IL-25在小鼠肾脏组织和原代培养巨噬细胞中都可促进M2型巨噬细胞的极化。7.分别用Con A和IL-25刺激原代培养的腹腔巨噬细胞,与PBS对照组和IL-25对照组相比,Con A组巨噬细胞表面TLR4表达显着增加（P<0.01）;而与Con A组相比,IL-25可显着逆转Con A诱导的巨噬细胞TLR4表达增加趋势（P<0.01）,表明IL-25通过下调巨噬细胞表面TLR4促进M2型巨噬细胞极化。8.与野生型和TLR2-/-小鼠相比,TLR4-/-小鼠M2型巨噬细胞显着增加,表明TLR4（而非TLR2）信号调节M2型巨噬细胞的极化。此外,IL-25可诱导TLR2-/-小鼠巨噬细胞向M2型极化,而不能诱导TLR4-/-小鼠巨噬细胞向M2型极化,表明IL-25诱导的M2巨噬细胞上调是一种TLR4依赖性方式,IL-25通过下调TLR4促进M2型巨噬细胞的极化。结论:1.甘草甜素对Con A诱发的急性肾损伤具有显着的改善作用,是一种治疗急性肾损伤、改善肾脏功能的潜在候选药物。2.甘草甜素可促进小鼠肾组织中IL-25表达,并可逆转由Con A引起的IL-25下调趋势。3.ConA可上调巨噬细胞TLR4表达,而IL-25可下调ConA诱导的巨噬细胞TLR4表达,在Con A所致AKI中表现为对Con A致炎性的拮抗效应。4.TLR4是M2型巨噬细胞极化的关键信号分子,IL-25通过下调TLR4表达以TLR4（而非TLR2）依赖性方式诱导巨噬细胞向M2型极化。5.IL-25促进巨噬细胞源性促炎性（IL-1β）和抑炎性（IL-10）细胞因子平衡。6.GL/IL-25/M2轴是急性肾损伤期间炎症反应的重要调控机制,可能成为治疗急性肾损伤的候选靶点。
张宏祥[7]（2019）在《斑石鲷细胞系的建立与鉴定》文中研究指明鱼类细胞培养已经广泛应用于病毒学、毒理学、生理学、内分泌学以及遗传学等方面的研究,是一种重要的研究手段。鱼类细胞培养研究始于1962年,Wolf和Quimby[1]建立的虹鳟（Oncorhynchus mykiss）性腺细胞系RTG-2是世界上第一个鱼类细胞系,之后鱼类细胞系研究发展迅速。至2010年上半年,全球范围内已经建立的鱼类细胞系有275株[2],建立的鱼类细胞系所用的材料来自于鱼的各种组织,包括胚胎、脑、眼睛、鳃、骨、肌肉、表皮、鳍条、肿瘤及内脏组织等。鱼类细胞系已应用于鱼类病毒学、病理学、生理学、转基因、肿瘤发生、细胞骨架及DNA损伤修复等方面的研究。斑石鲷（Oplegnathus punctatus）,属鲈形目（Perciformes）石鲷科（Oplegnathidae）石鲷属（Oplegnathus）,俗称斑鲷、黑金鼓,主要分布于中国、朝鲜和日本的温热带海域。斑石鲷作为一种优良的海水养殖鱼类,在水产养殖产业中备受青睐。然而,近年来虹彩病毒和其它病毒性疾病的爆发使得斑石鲷的工厂化养殖遭受很大的经济损失。鱼类细胞系作为一种体外培养系统,因其成本低、试验重复性好、条件可精确控制的优点而成为该鱼种相关研究的重要工具。本研究通过组织块法,以斑石鲷肝脏组织为材料,建立了斑石鲷肝脏细胞系（O.punctatus liver cell line,OPL）;以斑石鲷脑组织为材料,建立了斑石鲷脑细胞系（O.punctatus brain cell line,OPB）。所用的培养基是在L-15基本培养基中添加了胎牛血清（FBS）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、青链霉素和β-巯基乙醇（2-ME）所配成的完全培养基。OPL细胞由成纤维样细胞构成,生长分裂旺盛,成功传至30多代;OPB细胞由成纤维样细胞和上皮样细胞构成,生长分裂旺盛,也成功传至30多代。比较不同培养基L-15、DMEM/F12、DMEM、MEM对OPL细胞和OPB细胞生长的影响,结果表明,L-15培养基最适用OPL和OPB细胞的培养。另外,检测了温度、FBS浓度、bFGF浓度对OPL和OPB细胞生长的影响,实验结果表明,OPL细胞和OPB细胞能在1830℃正常生长,24℃是最适生长温度;OPL细胞和OPB细胞在0%20%FBS浓度范围内,其生长速度随血清浓度的升高而增快;在培养基中添加bFGF对两种细胞系的生长都有促进作用。对OPL和OPB进行染色体核型分析,结果显示,OPL细胞和OPB细胞的染色体条数都发生了改变,但正常二倍体数目仍占大多数,正常二倍体核型（2n=2sm+46t）分别占68%和64%。通过脂质体转染法将pEGFP-N3质粒转入OPL细胞和OPB细胞中,可表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。用斑石鲷的线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因对两种细胞系的来源进行检测,鉴定结果显示,OPL细胞系和OPB细胞系均来源于斑石鲷。OPL和OPB细胞系的建立将为斑石鲷致病性病毒的感染机制、基因功能分析等研究提供基础的实验材料。本实验还用组织块培养法,以斑石鲷的脾脏、肾脏、心脏组织为材料研究了其组织细胞的分离与培养。培养细胞所用培养基是L-15完全培养基,各组织原代培养细胞形态多样,肾脏培养至第7代,脾脏和心脏培养至10代。对斑石鲷脾脏、肾脏、心脏组织的离体培养研究为今后脾脏、肾脏、心脏细胞系的建立和功能研究奠定了基础。综上,本文通过组织块培养法的原代培养方法,建立了斑石鲷的肝脏细胞系和脑细胞系,研究了细胞的生长特性,即培养基、温度、血清浓度、bFGF浓度对细胞系生长速度的影响,对其染色体进行了初步分析,采用脂质体转染法对两个细胞系进行转染,成功的将外源基因转入两个细胞系并在细胞内得到表达,为将来在斑石鲷细胞系建立基础上开展的相关研究奠定了基础。同时,针对斑石鲷脾脏、肾脏、心脏细胞离体培养的初步研究为脾脏、肾脏、心脏细胞系的建立提供了依据。
刘得辰[8]（2018）在《Ets-1介导非酒精性脂肪性肝炎发展过程的机制研究》文中研究说明非酒精性脂肪性肝病是一种肝脏中堆积的脂肪大于5%并排除包含酒精等可以对肝脏造成损伤因素的慢性肝脏疾病。根据病程的进展主要分为,单纯性脂肪肝,非酒精性脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化。非酒精性脂肪性肝炎是肝硬化,肝坏死,肝癌的重要诱因之一,严重影响人类的健康。既往研究发现,明显升高的肝细胞凋亡水平是促进单纯性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎发展的一个重要因素。其中,转化生长因子β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）的作用尤其受到关注。TGF-β通过磷酸化果蝇母系斩首蛋白3（Drosophila mothers against decapentaplegic protein,Smad3）调控凋亡相关蛋白的表达,促进了肝细胞的凋亡。而转录因子成红细胞病毒E26癌基因同源蛋白1（v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homologue 1,Ets-1）被报道,可以同Smad3蛋白形成转录复合物,调节其转录活性。此外,本课题组前期研究发现,Ets-1的表达与胰岛β细胞的凋亡有着密切关系且在非酒精性脂肪性肝炎病人肝组织中显着上调。因此,研究Ets-1与肝细胞凋亡之间的关系,或许有助于找到一种抑制非酒精性脂肪性肝炎发展的机制。本研究首先明确,在非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝脏组织中Ets-1的表达显着升高。进一步的研究发现,在原代培养的小鼠肝细胞中,TGF-β可以计量时间依赖性的上调Ets-1的表达,可能部分介导了 Ets-1在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝组织表达水平的升高。其中的机制是TGF-β通过TGF-β 受体 I（transforming growth factor-β specific receptor,TβRI）磷酸化 Smad2/3,激活后的Smad2/3转移入核并结合到Ets-1的启动子区上,促进Ets-1的转录。此外,在肝细胞的细胞核内,Ets-1能与磷酸化的Smad3（phosphorylated Smad3,p-Smad3）直接结合,抑制其泛素化降解,放大TGF-β/Samd3信号通路,促进Smad3下游蛋白Bcl-2相互作用的细胞死亡介导蛋白（Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim）的表达。因此,肝细胞内过表达Ets-1可以有效增强TGF-β诱导的细胞凋亡,表现为凋亡标志蛋白剪切型的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteine-aspartic proteases 3,cleaved-caspase 3）蛋白水平的的显着升高。动物水平上,给予小鼠尾静脉注射含有Ets-1小发卡RNA（small hair RNA,shRNA）的腺相关病毒能够有效逆转胆碱和蛋氨酸缺乏饮食（methionine and choline-deficient diet,MCD diet）所导致的肝细胞凋亡,从而下调肝损伤,炎症和纤维化水平。综上所述,TGF-β信号通路持续激活并上调Ets-1表达,最终诱导肝细胞的凋亡。而抑制Ets-1能够拮抗TGF-β诱导的非酒精性脂肪性肝炎的发展。因此,深入研究Ets-1在非酒精性脂肪性肝炎中的调控机制能够为非酒精性脂肪性肝炎的防治提供新的思路。
王杰钦,游辅宇,彭青,高毅[9]（2018）在《人原代肝癌细胞培养方法现状及展望》文中研究指明人肝癌细胞的原代培养技术是肝癌细胞建系与体外药敏试验的关键,对肝癌的基础及临床研究意义重大,但目前国内外尚无系统的方法总结。本文就人原代肝癌细胞的取材、分离、纯化、鉴定、培养基的选择及培养模型进行了综述,尤其是对当前最常用的两种分离方法进行了详细介绍,并重点突出了培养模型在人肝癌细胞原代培养中潜在的重要性,同时也指出了人肝癌细胞原代培养普遍存在的问题,为从事肝癌研究的同行提供参考和借鉴。
骆源[10]（2016）在《斜带石斑鱼肝细胞原代培养及皮质醇对其代谢的影响》文中提出1.斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法的建立通过不同的分离方法和培养条件探索斜带石斑鱼肝细胞的原代培养,以建立稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞原代培养模型,同时观察长期培养过程中肝细胞的形态变化。采用组织块分离法和胰蛋白酶（含EDTA）消化法分离肝细胞,并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞,细胞悬液于DMEM/F-12、M199和L-15培养液中培养;细胞活力及数量采用血球计数板计数,并通过MTT法测定细胞增殖率;同时,测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、白蛋白（ALB）和尿素氮（BUN）水平,分析原代培养肝细胞生长状态。结果表明,斜带石斑鱼肝细胞原代培养不适合采用组织块方法,而胰蛋白酶消化法则获得良好稳定的培养效果,细胞产量达到1.6×108 cells/g肝重,活细胞数达到95%;L-15培养基细胞生长明显优于DMEM/F-12和M199两种培养基;启动原代培养的48-72 h阶段肝细胞生长代谢旺盛,培养上清中LDH活性显着降低（P<0.05）,ALB和BUN含量显着升高（P<0.05）。结果显示,0.25%的胰蛋白酶常温消化法适合斜带石斑鱼肝细胞的分离,斜带石斑鱼肝细胞原代培养的最适培养基为L-15培养基,肝细胞在启动原代培养的48-72h生长代谢旺盛。2.皮质醇对斜带石斑鱼原代培养肝细胞活性及功能的影响本研究利用肝细胞体外培养模型,旨在探讨皮质醇对斜带石斑鱼原代培养肝细胞活性及功能的影响。选取5个皮质醇浓度（0、1、10、100、1000 nmol/L）孵育斜带石斑鱼原代肝细胞24 h,采用MTT法检测肝细胞活性,并测定肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）活性以及尿素氮（BUN）和白蛋白（ALB）水平的变化,分析细胞生长代谢状态。结果显示,高浓度皮质醇（100、1000 nmol/L）组作用24 h即可导致肝细胞ALT、AST、LDH释放量显着增加（P<0.05）,BUN分泌量也显着升高（P<0.05）;当皮质醇浓度为1000 nmol/L时,显着降低了肝细胞的活性（P<0.05）。结果表明:高浓度的皮质醇对体外培养肝细胞的功能及活性产生不利影响。3.皮质醇对原代培养肝细胞糖和脂肪代谢的影响以斜带石斑鱼原代培养肝细胞为模型,选取3个皮质醇浓度（0、100 nmol/L和1000nmol/L）和2个孵育时间（24 h和36 h）,通过测定培养上清液中葡萄糖含量,肝细胞糖原、丙酮酸和甘油三酯含量,肝细胞糖和脂肪代谢关键酶的活性和基因表达量,以及脂肪代谢相关的转录因子基因表达,探讨离体条件下皮质醇对斜带石斑鱼肝细胞糖和脂肪代谢的影响。研究结果表明,在孵育24 h和36 h时,皮质醇显着提高肝细胞葡萄糖的释放量,而显着降低肝细胞丙酮酸和甘油三酯含量（P<0.05）;皮质醇作用时间对肝细胞葡萄糖释放量、肝细胞丙酮酸和甘油三酯含量均无显着性影响（P>0.05）。在肝细胞孵育24 h时,皮质醇对肝细胞糖原含量无显着影响（P>0.05）,而孵育36 h时,肝细胞糖原含量则随着皮质醇水平的升高而显着降低（P<0.05）。随着皮质醇作用时间的延长,肝细胞糖原含量显着下降（P<0.05）。在孵育24 h和36 h时,皮质醇显着提高了磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的活性,显着降低了苹果酸脱氢酶（MDH）和异柠檬酸脱氢酶（ICD）的活性（P<0.05）,但对糖原合成酶（GSase）活性则无显着影响（P>0.05）;在孵育24 h时,皮质醇对丙酮酸激酶（PK）活性无显着影响（P>0.05）,但在孵育36 h时,皮质醇则显着提高丙酮酸激酶（PK）活性（P>0.05）。随着孵育时间的延长,葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）活性显着下降,丙酮酸激酶（PK）活性显着升高（P<0.05）,而苹果酸脱氢酶（MDH）和异柠檬酸脱氢酶（ICD）活性均无显着影响（P>0.05）。在孵育24 h和36 h时,皮质醇显着上调了PEPCK和G6Pase基因表达量（P<0.05）;孵育24 h时,皮质醇显着上调PK基因表达量（P<0.05）,但孵育36 h时则对PK基因表达量无显着影响（P>0.05）。随着皮质醇孵育时间的延长,G6Pase和PK基因表达量显着升高（P<0.05）。皮质醇对MDH基因表达量无显着影响（P>0.05）。皮质醇显着下调了脂肪酸合成酶（FAS）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARα）基因表达量（P<0.05）,孵育时间对FAS和PPARα基因表达量无显着影响（P>0.05）。皮质醇显着上调了脂蛋白脂肪酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）基因表达量（P<0.05）,然而孵育时间对HSL基因表达无显着影响（P>0.05）,但LPL基因表达则随着孵育时间的延长而显着增加（P<0.05）。结果显示:皮质醇提高原代培养肝细胞的糖异生能力,抑制脂肪合成,促进脂肪分解。
二、肝细胞原代培养研究综述（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞原代培养研究综述（论文提纲范文）
（1）瓦氏雅罗鱼鳃、肠组织及原代细胞在碱胁迫下的钙调蛋白表达机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 国内外研究进展 |
| 1.1.1 国内、外碱水及渔业资源利用 |
| 1.1.2 碱胁迫的理论依据 |
| 1.1.3 瓦氏雅罗鱼碱耐受性研究与渗透压调节的理论基础 |
| 1.1.4 钙调蛋白与鱼类氧化应激调节的理论基础 |
| 1.1.5 鱼类原代细胞培养在耐高碱机制研究中的意义 |
| 1.2 课题来源 |
| 1.3 研究内容与意义 |
| 第二章 瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞分离及原代培养方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 瓦氏雅罗鱼鳃细胞的分离培养 |
| 2.1.3 瓦氏雅罗鱼肠细胞的分离培养 |
| 2.1.4 细胞消化 |
| 2.1.5 细胞传代 |
| 2.1.6 瓦氏雅罗鱼细胞最佳培养基的确定 |
| 2.1.7 细胞存活率及活性鉴定 |
| 2.1.8 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 瓦氏雅罗鱼鳃细胞的原代培养 |
| 2.2.2 瓦氏雅罗鱼肠细胞的原代培养 |
| 2.2.3 最佳培养基的确定 |
| 2.2.4 细胞活性鉴定 |
| 2.2.5 细胞来源鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 碱胁迫对雅罗鱼鳃、肠细胞活性及功能的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞分离及原代培养 |
| 3.1.3 瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞碱耐受条件的确定 |
| 3.1.4 不同碱度下瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞增殖规律 |
| 3.1.5 碱耐受对瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞的功能影响 |
| 3.1.6 数据分析与统计 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 碱耐受条件的基本确定 |
| 3.2.2 不同碱度下雅罗鱼鳃、肠细胞增殖规律 |
| 3.2.3 碱耐受对细胞功能的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 碱胁迫下钙调蛋白在鳃、肠组织中的表达情况及其对细胞功能的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验鱼的准备 |
| 4.1.2 实验主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 细胞孵育 |
| 4.1.4 碱胁迫实验所需血清、组织和细胞的获取 |
| 4.1.5 Ca~(2+)含量的测定 |
| 4.1.6 鳃、肠组织的RNA提取及c DNA合成 |
| 4.1.7 鳃、肠细胞的RNA提取及c DNA合成 |
| 4.1.8 引物设计与合成 |
| 4.1.9 序列分析 |
| 4.1.10 荧光定量PCR分析 |
| 4.1.11 数据分析与统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 碱胁迫对瓦氏雅罗鱼Ca~(2+)浓度的影响 |
| 4.2.2 瓦氏雅罗鱼camk2g2 基因序列分析 |
| 4.2.3 氨基酸同源性分析与系统进化树的构建 |
| 4.2.4 瓦氏雅罗鱼camk2g2 基因同源对比分析 |
| 4.2.5 碱胁迫对瓦氏雅罗鱼钙调蛋白表达量的影响 |
| 4.2.6 碱胁迫对瓦氏雅罗鱼钙调蛋白的影响与应激反应的相互关系 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 瓦氏雅罗鱼CaMK2g2 蛋白结构及机体内分布情况 |
| 4.3.2 瓦氏雅罗鱼碱胁迫对组织及细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 4.3.3 碱胁迫对瓦氏雅罗鱼钙调蛋白表达量的影响 |
| 4.3.4 碱胁迫对瓦氏雅罗鱼渗透压调节及氧化应激反应的影响 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 硕士阶段研究成果 |
| 致谢 |
（2）不同铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性及其基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 铁在动物机体中的贮存和利用 |
| 1.2 铁的生物学功能 |
| 1.2.1 参与载体组成、转运和贮存营养素的功能 |
| 1.2.2 抗氧化功能 |
| 1.2.3 参与机体免疫 |
| 1.2.4 参与电子传递 |
| 1.3 机体中含铁关键酶及功能蛋白 |
| 1.4 有机铁的结构与特性 |
| 1.5 有机铁的生物学活性研究进展 |
| 1.5.1 研究现状 |
| 1.5.2 研究方法 |
| 1.5.2.1 自然饲喂法 |
| 1.5.2.2 静脉注射法 |
| 1.5.2.3 细胞培养法 |
| 1.5.3 评价指标 |
| 1.6 动物肝细胞分离与其体外原代培养研究进展 |
| 1.6.1 肝细胞分离 |
| 1.6.2 肝细胞体外培养 |
| 1.6.3 肝细胞供体的年龄 |
| 1.7 立题依据与试验目的 |
| 1.8 试验内容 |
| 第二章 原代培养肉鸡鸡胚肝细胞模型构建(试验一) |
| 2.1 试验目的 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验设计与处理 |
| 2.2.2 试验仪器与材料 |
| 2.2.3 试剂的配制 |
| 2.2.4 鸡胚肝细胞消化分离 |
| 2.2.5 肝细胞纯化 |
| 2.2.6 细胞计数及细胞活力检测 |
| 2.2.7 肝细胞原代培养 |
| 2.2.8 形态学鉴定 |
| 2.2.9 肝细胞染色鉴定 |
| 2.2.10 样品采集与制备 |
| 2.2.11 样品分析 |
| 2.2.12 数据统计与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 形态学观察结果 |
| 2.3.2 PAS糖原染色结果 |
| 2.3.3 细胞培养液中LDH活性 |
| 2.3.4 MTT细胞持续活力测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 不同铁水平及孵育时间对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性及其基因表达的影响(试验二) |
| 3.1 试验目的 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验设计与处理 |
| 3.2.2 试验试剂 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 鸡胚肝细胞铁孵育液处理 |
| 3.2.5 样品采集与制备 |
| 3.2.6 样品分析 |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 添加铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞铁含量的影响 |
| 3.3.2 添加铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性的影响 |
| 3.3.3 添加铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中含铁关键酶及铁蛋白的mRNA表达水平的影响 |
| 3.3.4 添加铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶及铁蛋白的蛋白表达水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 不同形态铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性及基因表达的影响(试验三) |
| 4.1 试验目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验设计与处理 |
| 4.2.2 试验试剂 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.2.4 原代鸡胚肝细胞的分离、培养及处理 |
| 4.2.5 样品采集与制备 |
| 4.2.6 样品分析 |
| 4.2.7 数据统计与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 添加铁源和铁水平对肉鸡鸡胚肝细胞铁含量的影响 |
| 4.3.2 添加铁源和铁水平对肉鸡鸡胚肝细胞含铁酶活性的影响 |
| 4.3.3 添加铁源和铁水平对肉鸡鸡胚肝细胞含铁酶及铁蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 4.3.4 添加铁源和铁水平对肉鸡鸡胚肝细胞含铁酶及铁蛋白的蛋白表达水平的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论及有待进一步研究的问题 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）大豆水提物、豆粕水提物对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）原代培养肝细胞氧化损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大豆和豆粕研究进展 |
| 1.1 主要的营养成分和活性成分 |
| 1.2 鱼类利用大豆蛋白的研究现状 |
| 1.3 引起鱼类利用大豆蛋白的限制因素 |
| 2 大豆、豆粕对鱼类肝脏组织的负面影响 |
| 2.1 大豆、豆粕对鱼体健康的影响 |
| 2.2 对鱼类肝脏形态学的影响 |
| 2.3 对肝脏抗氧化系统的影响 |
| 3 草鱼原代肝细胞培养与应用 |
| 3.1 肝脏的功能 |
| 3.2 肝细胞体外培养研究进展 |
| 4 转录组学在营养学的研究 |
| 5 代谢组学在营养学的研究 |
| 5.1 细胞代谢组学 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.3 在营养学的应用 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 SAE、SMAE对草鱼原代肝细胞氧化损伤的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 SAE、SMAE的制备和成分分析 |
| 1.4 实验鱼的管理 |
| 1.5 草鱼原代肝细胞的分离和培养 |
| 1.6 不同浓度水提物对草鱼原代肝细胞活力的影响 |
| 1.7 透射电子显微镜检测细胞超微结构变化 |
| 1.8 Hoechst 33285染色 |
| 1.9 肝细胞相关抗氧化酶的检测 |
| 1.10 AV/PI双染检测细胞凋亡 |
| 1.11 线粒体膜电位检测 |
| 1.12 活性氧检测 |
| 1.13 数据处理和分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 水提物成分分析 |
| 2.2 SAE、SMAE对草鱼原代肝细胞活力的影响 |
| 2.3 肝细胞超微结构变化 |
| 2.4 Hoechst 333258染色 |
| 2.5 SAE和SMAE诱导肝细胞线粒体损伤 |
| 2.6 SAE和SMAE诱导肝细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SAE、SMAE诱导原代肝细胞线粒体路径凋亡 |
| 3.2 SAE、SMAE引起原代肝细胞氧化损伤 |
| 3.3 豆粕中对肝细胞损伤的物质来自于大豆 |
| 4 小结 |
| 第三章 SAE、SMAE引起草鱼原代肝细胞损伤的转录组分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 肝细胞总RNA提取和检测 |
| 1.4 转录组测序和生物学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA质量检测 |
| 2.2 测序数据质控 |
| 2.3 测序比对与注释 |
| 2.4 草鱼原代肝细胞转录组中差异基因表达量的计算和筛选 |
| 2.5 差异表达基因GO分析 |
| 2.6 差异表达基因KEGG分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 水提物对草鱼原代肝细胞相关基因的影响 |
| 3.2 水提物对草鱼原代肝细胞信号通路KEGG富集分析 |
| 4 小结 |
| 第四章 SAE、SMAE调控草鱼原代肝细胞代谢组学的研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 代谢组样品收集与处理 |
| 1.4 UHPLC-QTOF/MS分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 主成分分析 |
| 2.2 正交偏最小二乘法判别分析和置换检验 |
| 2.3 差异代谢物筛选 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SAE、SMAE对原代肝细胞糖代谢的影响 |
| 3.2 SAE、SMAE对原代肝细胞脂类代谢的影响 |
| 3.3 SAE、SMAE对原代肝细胞氨基酸代谢的影响 |
| 3.4 SAE、SMAE对原代肝细胞核苷酸代谢的影响 |
| 3.5 SAE、SMAE对原代肝细胞胆碱类代谢的影响 |
| 3.6 细胞外源性代谢物 |
| 4 小结 |
| 第五章 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）山羊乳腺上皮长链脂肪酸跨膜转运特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1 反刍动物乳腺脂肪酸的来源 |
| 1.1 脂肪酸从头合成 |
| 1.2 外源脂肪酸的摄取 |
| 2 长链脂肪酸跨膜转运研究进展 |
| 2.1 膜相关蛋白介导细胞LCFAs摄取 |
| 2.2 调控脂肪酸摄取和利用的因素 |
| 3 乳腺细胞培养及其应用 |
| 3.1 乳腺的结构和功能特征 |
| 3.2 乳腺细胞原代培养方法的研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 4.1 研究目的与意义 |
| 4.2 研究内容 |
| 4.3 技术路线 |
| 第2章 山羊乳腺上皮细胞原代分离及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞材料 |
| 1.2 主要仪器和材料 |
| 1.3 试剂及配制 |
| 1.4 乳汁中乳腺上皮细胞的分离 |
| 1.5 乳腺上皮细胞的角蛋白-18荧光染色鉴定 |
| 1.6 乳腺上皮细胞β-酪蛋白基因表达检测(RT-PCR法鉴定) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊乳腺上皮细胞原代培养 |
| 2.2 山羊乳腺上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化培养 |
| 2.3 乳腺上皮细胞的角蛋白-18荧光染色鉴定 |
| 2.4 RT-PCR法鉴定上皮细胞酪蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸跨膜转运的时间依赖性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞材料 |
| 1.2 主要仪器和材料 |
| 1.3 试剂及配制 |
| 1.4 棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的时间依赖性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 棕榈酸摄取的时间依赖性结果 |
| 2.2 硬脂酸摄取的时间依赖性结果 |
| 2.3 油酸摄取的时间依赖性结果 |
| 2.4 亚油酸摄取的时间依赖性结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第4章 山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸跨膜转运的浓度依赖性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂及配制 |
| 1.4 棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸浓度依赖性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 棕榈酸摄取的浓度依赖性结果 |
| 2.2 硬脂酸摄取的浓度依赖性结果 |
| 2.3 油酸摄取的浓度依赖性结果 |
| 2.4 亚油酸摄取的浓度依赖性结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第5章 抑制剂对山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸跨膜转运的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂及配制 |
| 1.4 抑制剂对山羊乳腺上皮脂肪酸跨膜转运的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同抑制剂对山羊乳腺上皮细胞棕榈酸转运的影响 |
| 2.2 不同抑制剂对山羊乳腺上皮细胞硬脂酸转运的影响 |
| 2.3 不同抑制剂对山羊乳腺上皮细胞油酸转运的影响 |
| 2.4 不同抑制剂对山羊乳腺上皮细胞亚油酸转运的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表文章 |
（5）基于AMPK/PGC-1α通路探讨亚甲蓝对脓毒症脑能量代谢调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 脓毒症相关性脑病细胞模型的制备以及对线粒体损伤的观察 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 亚甲蓝对脓毒症相关性脑病细胞模型的AMPK/PGC-1α通路的调控研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 亚甲蓝通过调控AMPK/PGC-1α通路影响脓毒症相关性脑病大鼠的脑能量代谢的研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）IL-33诱导自噬缓解小鼠实验性肠炎的机制研究甘草甜素促进IL-25表达缓解刀豆蛋白A所致小鼠急性肾损伤的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 主要中英文缩略词表 |
| 研究课题一:IL-33诱导自噬缓解小鼠实验性肠炎的机制研究 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 体内实验 |
| 体外实验 |
| 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 研究课题二:甘草甜素促进IL-25表达缓解刀豆蛋白A所致小鼠急性肾损伤的作用与机制研究 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:甘草甜素在Con A所致小鼠急性肾损伤中的作用 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分:甘草甜素促进IL-25表达诱导M2型巨噬细胞极化缓解小鼠急性肾损伤 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述: 自噬与炎症 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间科研情况 |
| 致谢 |
（7）斑石鲷细胞系的建立与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鱼类细胞培养发展历史 |
| 1.2 鱼类细胞培养技术简介 |
| 1.3 鱼类细胞系在各领域的应用 |
| 1.3.1 病毒学 |
| 1.3.2 毒理学 |
| 1.3.3 肿瘤学 |
| 1.3.4 免疫学 |
| 1.3.5 遗传学 |
| 1.3.6 内分泌学 |
| 1.3.7 生理学 |
| 1.3.8 资源保护 |
| 第二章 斑石鲷肝脏细胞系的建立与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2.3 原代培养 |
| 2.2.4 传代培养 |
| 2.2.5 细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.6 不同培养基对细胞的影响 |
| 2.2.7 不同温度对细胞生长的影响 |
| 2.2.8 不同浓度FBS和 bFGF对细胞生长的影响 |
| 2.2.9 染色体核型分析 |
| 2.2.10 细胞转染 |
| 2.2.11 线粒体基因组DNA COⅠ基因测序和对比分析 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 原代培养和传代培养 |
| 2.3.2 不同培养基对细胞生长的影响 |
| 2.3.3 不同温度对细胞生长的影响 |
| 2.3.4 不同浓度的FBS和 bFGF对细胞生长的影响 |
| 2.3.5 核型分析 |
| 2.3.6 细胞转染 |
| 2.3.7 线粒体基因组DNA COⅠ基因测序和对比分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 斑石鲷脑细胞系的建立与鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.3 原代培养 |
| 3.2.4 传代培养 |
| 3.2.5 细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.6 不同培养基对细胞的影响 |
| 3.2.7 不同温度对细胞生长的影响 |
| 3.2.8 不同浓度FBS和 bFGF对细胞生长的影响 |
| 3.2.9 染色体核型分析 |
| 3.2.10 细胞转染 |
| 3.2.11 线粒体基因组DNA COⅠ基因测序和对比分析 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 原代培养和传代培养 |
| 3.3.2 不同培养基对细胞生长的影响 |
| 3.3.3 不同温度对细胞生长的影响 |
| 3.3.4 不同浓度的FBS和 bFGF对细胞生长的影响 |
| 3.3.5 核型分析 |
| 3.3.6 细胞转染 |
| 3.3.7 线粒体基因组DNA COⅠ基因测序和对比分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 斑石鲷脾脏、肾脏、心脏体外培养的初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.3 原代培养 |
| 4.2.4 传代培养 |
| 4.2.5 细胞的冻存与复苏 |
| 4.3 结果和分析 |
| 4.3.1 斑石鲷脾脏的原代培养和传代培养 |
| 4.3.2 斑石鲷肾脏的原代培养和传代培养 |
| 4.3.3 斑石鲷心脏的原代培养和传代培养 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）Ets-1介导非酒精性脂肪性肝炎发展过程的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 试剂与抗体 |
| 1.3 其他 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 原代培养的小鼠肝细胞的提取 |
| 2.3 细胞的培养和处理 |
| 2.4 总RNA的提取和相对定量分析 |
| 2.5 总蛋白的提取与分析 |
| 2.6 蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)和泛素化分析 |
| 2.7 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.8 腺病毒构建 |
| 2.9 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端(TUNEL)染色 |
| 2.10 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 Ets-1的表达水平与非酒精性脂肪性肝炎发展关系密切 |
| 2 在肝细胞中TGF-β-Smad2/3信号通路介导Ets-1表达水平升高 |
| 3 Ets-1调控TGF-β信号通路激活所导致的凋亡 |
| 4 Ets-1抑制p-Smad3的降解,导致TGF-β/Smad3持续激活 |
| 5 Ets-1直接结合p-Smad3抑制其泛素化降解 |
| 6 抑制肝脏中Ets-1升高能够明显缓解小鼠的非酒精性脂肪性肝炎 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）人原代肝癌细胞培养方法现状及展望（论文提纲范文）
| 1 取材及预处理 |
| 2 分离方法 |
| 2.1 机械法 |
| 2.2 酶消化法 |
| 3 细胞的纯化 |
| 3.1 低速离心法 |
| 3.2 密度梯度离心法 |
| 3.3 胰蛋白酶消化法 |
| 4 肝癌细胞的鉴定 |
| 5 培养基的选择 |
| 6 培养模型 |
| 7 总结 |
（10）斜带石斑鱼肝细胞原代培养及皮质醇对其代谢的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 海水鱼类细胞培养研究进展 |
| 1.1.2 皮质醇对机体代谢调节的研究进展 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 本实验的研究目的和意义 |
| 第2章 斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验鱼饲养管理 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 肝细胞原代培养方法 |
| 2.1.4 肝细胞活力测定 |
| 2.1.5 斜带石斑鱼肝细胞最佳培养基的确定 |
| 2.1.6 肝细胞增殖率鉴定 |
| 2.1.7 斜带石斑鱼肝细胞功能测定 |
| 2.1.8 数据处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 分离与纯化方法对斜带石斑鱼肝细胞数量和活力的影响 |
| 2.2.2 不同培养基对斜带石斑鱼肝细胞原代培养的影响 |
| 2.2.3 MTT法测定不同培养时间斜带石斑鱼肝细胞增殖率的变化 |
| 2.2.4 不同培养时间斜带石斑鱼肝细胞培养上清液中LDH活性、ALB含量和BUN含量的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 皮质醇对斜带石斑鱼原代培养肝细胞功能的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验鱼饲养管理 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 肝细胞分离及原代培养 |
| 3.1.4 皮质醇孵育实验 |
| 3.1.5 肝细胞增殖率鉴定 |
| 3.1.6 生化分析 |
| 3.1.7 数据处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 皮质醇对肝细胞增值率的影响 |
| 3.2.2 原代培养肝细胞生理功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 皮质醇对原代培养肝细胞糖和脂肪代谢的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验鱼饲养管理 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 肝细胞分离及原代培养 |
| 4.1.4 皮质醇孵育实验 |
| 4.1.5 生化分析 |
| 4.1.6 肝细胞总RNA提取和荧光定量PCR |
| 4.1.7 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 肝细胞葡萄糖释放以及肝细胞内糖原、丙酮酸和甘油三酯含量分析 |
| 4.2.2 肝细胞代谢相关酶活性分析 |
| 4.2.3 肝细胞代谢相关基因表达表达量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果情况 |
四、肝细胞原代培养研究综述（论文参考文献）
- [1]瓦氏雅罗鱼鳃、肠组织及原代细胞在碱胁迫下的钙调蛋白表达机制研究[D]. 徐悦. 上海海洋大学, 2021
- [2]不同铁源对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞含铁关键酶活性及其基因表达的影响[D]. 马雪莲. 中国农业科学院, 2020
- [3]大豆水提物、豆粕水提物对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）原代培养肝细胞氧化损伤作用的研究[D]. 郁浓. 苏州大学, 2020(02)
- [4]山羊乳腺上皮长链脂肪酸跨膜转运特征研究[D]. 骆东梅. 西南大学, 2020
- [5]基于AMPK/PGC-1α通路探讨亚甲蓝对脓毒症脑能量代谢调控作用[D]. 滑晓莉. 新疆医科大学, 2020(07)
- [6]IL-33诱导自噬缓解小鼠实验性肠炎的机制研究甘草甜素促进IL-25表达缓解刀豆蛋白A所致小鼠急性肾损伤的作用与机制研究[D]. 王忠彦. 华中科技大学, 2019(01)
- [7]斑石鲷细胞系的建立与鉴定[D]. 张宏祥. 上海海洋大学, 2019(03)
- [8]Ets-1介导非酒精性脂肪性肝炎发展过程的机制研究[D]. 刘得辰. 南京医科大学, 2018(01)
- [9]人原代肝癌细胞培养方法现状及展望[J]. 王杰钦,游辅宇,彭青,高毅. 实用医学杂志, 2018(02)
- [10]斜带石斑鱼肝细胞原代培养及皮质醇对其代谢的影响[D]. 骆源. 集美大学, 2016(04)