（1皖南医学院弋矶山医院；2安徽省芜湖市急救中心；安徽芜湖241000）
摘要：目的：研究依帕司他对腹膜透析腹膜纤维化大鼠腹膜结构、功能的影响及腹膜组织转化生长因子-β1（TNF-β1）表达的影响，探讨其对腹膜纤维化的防治作用及可能机制。方法：采用4.25%的腹膜透析液制备腹膜透析纤维化模型，将大鼠随机分为3组：对照组、模型组、依帕司他组。12周后，测定各组腹膜超滤功能，并取壁层腹膜行HE染色，测定腹膜厚度，免疫组化及免疫荧光法测定TGF-β1的表达。结果：依帕司他组腹膜厚度（20.075±6.492）um，超滤量为（0.93±1.36881）ml，葡萄糖转运量为（12.9712±3.0313）mmol/Kg。与模型组腹膜厚度（33.618±2.861）um，超滤量为（-1.9530±2.33820）ml，葡萄糖转运量为（18.8905±3.0308）mmol/Kg对比，差异有统计学意义（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。模型组腹膜TNF-β1的表达明显高于对照组，依帕司他组表达明显降低。结论：依帕司他能下调TGF-β1的表达，减轻腹膜增厚，延缓腹膜纤维化的进展。
关键词：依帕司他 转化生长因子-β1 腹膜纤维化
Ye yinyin1 Xu haihong1 Wang yuwei1Tao liangfei2
（1.Department of Nephrology,Yijishan hospital of Wanan medical college,Anhui wuhu，241000 2. Emergency Department，WuHu Emergency center，Anhui wuhu，241000 ）
Abstract:[Objective]To Investigate the effects of epalrestat on peritoneal form and function and the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）in rat model of peritoneal dialysis and speculate the mechanism of prevention and treatment peritoneal fibrosis.[Methods] High glucose dialysate(4.25%,Baxter) was used to induce rat model of peritoneal fibrosis,The rats were divided into three groups randomly；Control group,model group，and epalrestat group. Twelve weeks later all rats were sacrificed.The peritoneal membrane function was investigated and the parietal thickness was measured with HE staining.TGF-β1 expression was examined by immunohistochemisty.[Results] The modol group presentd siginificantly increase of peritoneum thickness（33.618±2.861 VS 20.075±6.492,P<0.01）and mass transfer of glucose（18.8905±3.0308 VS12.9712±3.0313,p<0.01）,but decrease of ultrafiltration (-1.9530±2.33820 VS 0.93±1.36881, P<0.01)compared with the epalrestat group,The levels of TGF-β1 in peritoneum was significantly expressed in the rats model(P<0.05),but lower in epalrestat group(P<0.05)[conclusion] Epalrestat could decrease the expression of TGF-β, alleviate peritoneal thickening and delay the progression of peritoneal fibrosis.
Key words: epalrestat transforming growth factor-β1 peritoneal fibrosis
腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是尿毒症患者有效的肾脏替代治疗方式之一，然而，由于腹透液的生物不相容性、反复的腹膜炎症、全身的微炎症状态等导致腹膜超滤衰竭是患者退出腹膜透析的重要原因[1]，其中，TGF-Β诱导的细胞外基质聚集、间皮细胞转分化等发挥着至关重要的作用。依帕司他作为醛糖还原酶抑制剂的代表药物，其应用主要在糖尿病血管病变的防治，基于腹膜血管病变与糖尿病血管病变有着相似的病理生理改变，本研究探讨依帕司他对腹膜纤维化大鼠腹膜组织学变化及转化生长因子β1表达的影响，为临床上防止腹膜纤维化提供依据。
1.材料与方法
1.1实验材料：健康雄性SD大鼠30只，体重180-200g，由皖南医学院弋矶山医院动物中心提供，中心实验室适应性饲养1周，饲养条件：12h光照、室温24℃、45%相对湿度，普通饲料喂养，自由进水。 腹透液：4.25%腹膜透析液Baxter公司生产 主要试剂：Anti-TGF-β 试剂盒（ABCAM上海贸易有限公司） 仪器：IX51生物倒置显微镜（OLYMPUS，Japan），TE2000倒置荧光显微镜(Nikon，Japan)，QL-861涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造)，石蜡超薄切片机（Leica，Germany）由我院中心实验室及病理科提供。
1.2 实验方法
1.2.1造模及分组
取36只健康雄性SD大鼠，随机分配至以下三组中，每组10只：A.对照组：腹腔注射生理盐水，100ml/KG/天，连续12周喂养；B.实验组：腹腔注射4.25%腹膜透析液，100ml/KG/天，连续12周饲料喂养；C.治疗组：腹腔注射4.25%腹膜透析液，100ml/KG/天，同时给予含依帕司他100mg/kg的饲料，连续12周饲料喂养。
1.2.2 标本留取：避开注射部位取左上腹壁壁层腹膜组织面积约5 mm×2 mm×2 mm，利用4％ 的多聚甲醛固定液固定4 h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋。调整切片机以定位组织，待合适后调整切片机至2μm切片，56℃水浴完整摊片，顺序捞取切片，37℃烤片过夜后收纳。
1.2.3 腹膜组织HE染色（病理）
对大鼠壁层腹膜进行HE染色，观察腹膜间皮细胞形态学变化，并测定腹膜厚度。
HE染色：常规脱蜡，苏木精染色，盐酸乙醇分化，双蒸水稍水洗10-30s，伊红染色，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。中性树脂封片。
1.2.4 腹膜超滤功能测定
各组大鼠于造模第12周末行腹膜功能试验，试验前48h停止腹膜透析。用10%水合氯醛3ml/kg麻醉大鼠, 然后腹腔注射20mL 4.25%透析液并立即留取1ml以测定0h的腹膜透析液葡萄糖浓度。4h后沿腹部正中切口打开腹腔, 准确量取腹腔液体积。同时留取约1mL血液和腹透液标本，分别离心后采用全自动生化分析仪测定实验动物葡萄糖浓度。计算每只大鼠的超滤量(UF)及葡萄糖转运量（MGT）。具体计算公式如下：超滤量(UF)=(引流量-20) mL。
葡萄糖转运量（MGT）=(透析液初始葡萄糖浓度×注入透析液体积)－(透析末葡萄糖浓度×终末透析液出量) mmol/kg
1.2.5免疫组化TGF-β表达
2um石蜡切片37℃烤片过夜，常规脱蜡水化，TBS洗5min×3次，抗原修复（高火至沸，转为低火20min），自然冷却，TBS洗3 min×3次，切片放入3%H2O2溶液，室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，TBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封闭20min，去除BSA封闭液，每张切片加入50ul稀释的一抗（TGF-β1）覆盖组织，4℃过夜；TBS洗3次，每次5min，加入二抗，4℃孵育50min；TBS洗3次，每次5min，加新配置DAB显色剂显色，显微镜下控制显色，蒸馏水冲洗，苏米素染色25s，蒸馏水冲洗，酒精梯度各浸泡1min，二甲苯固定，晾干，中性树脂封片。使用Image—ProPlus 6．0图像分析系统对结果进行分析。测定平均积分光密度值（IOD），IOD值越大，说明抗原的表达水平越高。
1.2.6 免疫荧光TGF-β表达
2um石蜡切片37℃烤片过夜，常规脱蜡水化，TBS洗5min×3次，抗原修复（高火至沸，转为低火20min），自然冷却，TBS洗3 min×3次，切片放入3%H2O2溶液，室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，TBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封闭20min，去除BSA液，每张切片加入50μl稀释的一抗（TGF-β1）覆盖组织，4℃过夜；TBS洗3次，每次5min，每张切片加50μl-100μl的荧光二抗，室温避光孵育2h；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每张切片加50-100μl DAPI溶液，室温避光孵育5分钟，用PBS冲洗3遍；90%甘油封片，荧光显微镜下观察。
1.2.7统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件分析，数据用( -x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析.以P<0.05为差异有统计学意义.
2.结果
2.1HE染色： 光镜下，HE染色可见对照组壁层腹膜表面覆盖着一层扁平间皮细胞，细胞排列有序，其下为薄层疏松结缔组织，实验组和治疗组可见腹膜明显增厚，间皮细胞肿胀，变形，伴有脱落。细胞间隙增宽，间皮下基质明显增厚，可见炎症细胞的浸润，实验组明显，治疗组稍轻。实验组腹膜厚度为（33.618±2.861）um与对照组（8.435±1.099）um，P<0.01，治疗组腹膜厚度（20.075±6.492）um与实验组（33.618±2.861）um，P<0.05有统计学意义。见图1 表1
3.讨论
腹膜透析是终末期肾脏病患者的肾脏替代治疗方式之一，其通过弥散和超滤完成对溶质和水分的清除。但由于非生理性腹膜透析液及反复腹膜炎，会促进多种细胞因子产生及失衡进而导致腹膜结构和功能的改变最终形成腹膜纤维化[2]。因此研究防治腹膜透析相关性腹膜纤维化的策略显得尤其重要。很多研究中提示长期腹膜透析中腹膜结构改变包括炎症细胞的浸润、间质纤维化、腹膜新生血管增生与血管硬化等，在功能上则表现为毒素清除和超滤功能下降[3]。该研究中我们发现模型组壁层腹膜明显增厚，纤维结缔组织明显增多伴有排列紊乱，间皮细胞肿胀，变形，伴有脱落，细胞间隙增宽，可见炎症细胞的浸润。同时研究表明腹膜纤维化伴有TGF-β1激活，TGF-β1能诱导血管内皮生长因子表达增加，导致新生血管及通透性增加，导致小分子转运增加[4]。葡萄糖转运增加提示葡萄糖更易在腹膜液与血液中达到平稳，对肌酐清除能力强，但超滤能力下降，提示高转运状态，本研究中模型组超滤量减少，且葡萄糖转运量增加证实其腹膜转运功能受损。
高糖腹膜透析液中的葡萄糖降解产物（glucose degradation product,GDP）及晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）参与了腹膜的损伤过程，是导致腹膜功能衰竭的一个重要原因[5]。葡萄糖降解产物是活性很强的羰基化物，它可改变间皮细胞的功能并伴随着与蛋白质结合、脱氢、脱水、分子重排等过程最终发展为晚期糖基化终产物。醛糖还原酶（aldose reductase,AR）是多元醇通路的限速酶，能将葡萄糖转化为山梨醇，再在山梨醇脱氢酶催化下氧化为果糖，最终异常聚集形成晚期糖基化终产物。既往研究集中在醛糖还原酶抑制剂改善糖尿病血管及神经并发症等[6-7]，其在腹膜纤维化的防治方面的研究甚少。
腹膜纤维化是涉及多因素共同参与和调节的过程，有研究表明高糖腹膜透析液除了产生糖基化产物 影响腹膜超滤功能外，其本身还可使补体系统激活，单核细胞趋蛋白-1、转化生长因子β等炎症介质上调，并通过各种途径激活细胞外基质聚集、肾素-血管紧张素-醛固酮系统高表达[8]. TGF-β直接参与细胞外基质聚集，它不仅可刺激细胞外基质的沉积，还可导致基质金属蛋白酶(MMPs)、基质金属蛋白酶组织抑制剂和纤溶酶原激活物抑制物-1的失平衡来影响细胞外基质的降解[9]。本研究证实依帕司他组腹膜增厚明显减轻，且TGF-β表达减少，提示依帕司他可能通过下调TGF-β1来延缓腹膜纤维化的进展，今后的研究我们将测定AGES表达更直观的阐明醛糖还原酶抑制剂在防治腹膜纤维化中的作用。
综上，高糖等因素参与腹膜组织的损伤及转化。本研究证实醛糖还原酶抑制剂依帕司他可能通过抑制TNF-Β的表达能减少间皮细胞损伤，缓解腹膜纤维化，为临床挽救腹膜透析患者的腹膜功能提供新的思路。
参考文献：
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[9] 杨晶晶,毛志敏,万毅刚.肾康注射液调控ERK1/2/MMPs信号通路促进肾衰竭模型鼠细胞外基质降解的作用和机制[J].中国中药杂志,2016,41(20):3805-3813.
此课题为皖南医学院中青年项目（wk2015F10）；芜湖市科技计划项目（2015hm04）
※通信作者 徐海红（1970.7-） 皖南医学院弋矶山医院副主任医师 副教授 研究方向：慢性肾衰竭的诊治
论文作者:叶寅寅1 徐海红1 汪裕伟1 陶良飞2
论文发表刊物:《医师在线》2018年3月下第6期
论文发表时间:2018/7/2
标签：腹膜论文; 细胞论文; 葡萄糖论文; 超滤论文; 基质论文; 切片论文; 功能论文; 《医师在线》2018年3月下第6期论文;