1.泰山医学院在读硕士研究生山东省泰安市 271000；2.泰安市中心医院消化内一科山东省泰安市 271000
【摘 要】1.UC患者肠道中发生了菌群结构改变，共生细菌中条件致病菌及有害菌群数量增加，益生菌群数量下降；2.根据血清因子的检测发现UC感染患者存在免疫系统激活；3.UC患者肠道菌群的改变可能与炎性因子有关。
【关键词】溃疡性结肠炎；肠道菌群结构；炎性细胞因子；rt-PCR；ELISA实验
前言
大量实验数据及病理组织学检测已明确UC患者的血清中存在炎性因子IL-6、IL-10等的改变。有研究人员认为UC患者肠道中菌群结构的改变可能与炎性细胞因子水平的变化具有一定同步性，两者共同参与了肠道免疫防护，在机体抗菌、抑炎及机械性肠道粘膜免疫防御中产生了重要作用[2]。但是溃疡性结肠炎、肠道菌群和血清炎性细胞因子之间存在怎样的关系目前研究尚不清楚。本实验通过初步研究UC患者肠道中菌群结构变化与血清炎性因子水平探讨UC可能的发病机制，从而为UC的临床治疗提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1病例及标本采集：病例取自泰安市中心医院消化内一科经电子结肠镜和病理组织学检测确诊的UC志愿患者30例，符合中华医学会定制的最新诊断标准。健康对照组为泰安市中心医院健康查体志愿人员20例。标本为两组人群新鲜清洁晨便及空腹6小时以上的外周静脉血。
1.2 主要实验试剂及实验器材
1.21 主要实验试剂：粪便基因组DNA提取试剂盒，人白细胞介素（IL-1、IL-13、IL-23）酶联免疫检测试剂盒，快速琼脂凝胶DNA回收试剂盒，零背景ZTOPO-TA克隆试剂盒，高纯度质粒小提试剂盒，核酸电泳染料，胰化蛋白胨，酵母提取物，100bp lader，6×DNA Loading Buffer：型号D1010，感受态细胞、dNTP Mixture，LA Taq，10×LA PCR Buffer II，氨苄青霉素（Ampicillin），琼脂粉（Agar Powder），LightCtcler 480 SYBR Green I Master、50×TAE缓冲液、待测肠道细菌PCR引物等。
1.22 主要实验器材：3K30高速冰冻离心机、恒温水浴锅、PCR基因扩增仪、紫外投射切胶台、全波长酶标仪、Roche罗氏LightCycler? 480II 实时荧光定量PCR系统、美国伯乐凝胶成像仪、高压灭菌器、恒温摇床、电热恒温培养箱、电泳仪、精准分光光度计等。
1.3 实验方法
1.31 粪便及外周静脉血采集及保存：采集目前人群晨便约5mg放入一次性使用容器，半小时内将粪便标本放于-80℃超低温冰箱中保存备用；采集目前人群空腹6小时以上的外周静脉血约5ml，以3000rpm/min转速快速离心，取上清液放于-80℃超低温冰箱保存备用。
1.32 根据粪便基因组DNA提取试剂盒说明提取采集粪便标本中的核酸。
1.33 重组质粒的构建：以10ul反应体系（dNTP Mixture2.0，引物1.0，模板1.0，LA Taq0.5，10×LA PCR Buffer II5.0，Final Volume50.5ul）和94℃预变性5min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、72℃终末延伸4min、延伸30cycles的扩增条件扩增目标基因。将扩增后DNA片段行琼脂糖凝胶电泳检测，UV3L紫外投射仪下切取目标DNA条带称重，纯化切除的DNA条带后再次行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.34 质粒DNA重组和转化：配制LB液体及LB固体培养基，紫外灯照射无菌操作台约半小时；取4ul纯化后带“A”末端的DNA、0.5ulZTOPO-T Vector、0.5ul10×TOPO Buffer共5ul体系于1.5ml离心管中，混匀后集中液滴至离心管底部，室温连接5min；取50ul感受态加入连接后的液滴中，混匀置于冰上30min；然后放置在42℃水浴锅中热激1min，再将其放于冰上3min；短暂冰浴后向离心管中加入500ulLB液体培养基，以180rpm在37℃恒温摇床上震荡培养60min；将所得液体以12000rpm短暂离心20s，弃上清保留约100-200ul，移液器吹打混匀加入无菌LB固体培养皿中用无菌玻璃棒涂板。放置37℃温箱中培养约12小时。
1.35 质粒DNA提取、扩增及鉴定：按照质粒DNA提取试剂盒详细步骤提取质粒DNA。以同条件12ul体系（dNTP Mixture，6.0ul，V3 primer F-GC 0.5ul，V3 primer R 0.5ul，Template2.0ul，DDW 3.0ul）扩增，再次行琼脂糖凝胶电泳检测检测质粒DNA完整性。测序重组后的的质粒。
1.36 建立标准曲线：按照以下体系加入每个标准板孔并设立副孔，引物0.25ul，SYBR Green I Master 5ul，模板1ul，对照组孔及体系以外液体以双蒸水填充，混匀，以最优化的反应条件进行实时荧光定量基因扩增得到相应拷贝数值。
1.37 SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增：以最优化的反应条件及反应体系进行实时荧光定量肠道细菌基因扩增得到对应菌群拷贝数值。
1.38 血清各炎性因子浓度检测：以酶联免疫吸附试验（ELISA）原理两检测组人外周静脉血血清中IL-1、Il-6和IL-23的浓度，根据相应试剂盒说明书进行3.11 标准品稀释：本实验试剂盒中标准品原液浓度为640ng/L，稀释浓度梯度如下按照说明书进行标准品稀释、加样、配液、洗涤、显色、终止等。
1.4 统计学分析：运用spss20.0、GraphPad Prism 5.0统计软件对得到的数据进行TTEST检验分析，P＜0.05表示有统计学差异。
2 实验结果
2.1 重组质粒构建成功，并将其作为定量参考检测到了总肠道菌群、分节丝状菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌、枸橼酸杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌的拷贝数量。
2.2 与健康对照组比较UC患者总肠道菌群数量下降，分节丝状菌、大肠杆菌、产气荚膜杆菌的平均拷贝数量明显增加（P＜0.01）；双歧杆菌、乳酸杆菌（P＜0.01）；枸橼酸杆菌平均拷贝数量升高，但P＞0.05。
3 讨论
实验结果显示与健康对照组粪便基因提取物检测相比较，UC患者总肠道菌群数量下降，肠道细菌的种类及分布虽然有个体差异，可能随着人体的生长发育、时间和空间等因素的改变而发生变化，但是通过统计学t-test检验发现，两组总肠道菌群的改变是有统计学差异的，说明UC患者的发病可能与肠道菌群数量变化有关。分节丝状菌群（Segmented filamentous bacteria，SFB）是肠道中正常存在的菌群，胃肠道上皮细胞中定殖的SFB参与诱导炎症性免疫反应，并能够增加肠道TH17细胞的产生并影响入侵机体其他部位病原菌的易感性。本实验研究结果发现，在UC患者粪便基因检测中，益生菌（双歧杆菌、乳酸杆菌）数量下降，且在统计学上有一定意义，而条件致病菌（大肠杆菌、枸橼酸杆菌）数量下降，有害细菌产气荚膜杆菌数量增加，促炎因子IL-1、IL-23浓度增加，抑炎因子IL-13浓度下降，也具有统计学差硬性，提示在UC患者肠道中存在肠道菌群结构的改变，且有肠道免疫反应的激活，消化道细菌类别与肠道炎症强度、肠道内分泌活动、物质代谢等均有密切关系。消化道细菌菌群受胃肠动力、肠道免疫系统、消化吸收代谢、炎症因子作用等的影响，并与肠道免疫屏障共同作用维持肠道微生态的平衡。肠道细菌的改变是否影响了炎症因子？两者有无相关性又存在着怎样的相关性，我们通过SPSS20.0软件将两组数据输入行相关性分析发现，随着大肠杆菌数量的增加，促炎因子IL-1、IL-23的浓度不断升高，而抑炎因子IL-13浓度在一定程度上是下降的，两者具有明显的相关性（R＞0.997）。同样，炎性因子的浓度也随着分节丝状菌、产气荚膜杆菌的拷贝数量增加和双歧杆菌、乳酸杆菌拷贝数量的减少呈现规律性改变。UC患者肠道中枸橼酸杆菌数量增加，但是与正常对照组相比较并无统计学差异，与炎性因子的改变也无明显的相关性。因此我们认为，UC患者肠道中细菌菌群结构的改变可以诱发炎症，导致免疫细胞增殖异常和分化障碍，增加免疫屏障结构破损的风险。根据以上实验结论，我们认为UC患者肠道中菌群结构的改变与炎性细胞因子浓度的改变具有一定同步性，两者存在相关关系，这在今后的临床治疗中具有跨越性指导意义，选择性肠道细菌菌群移植可能成为不就得将来UC治疗的主要途径。
参考文献：
[1] Odamaki T，Kato K et al.Effect of probiotic yoghurt on animal-based diet-induced change in gut microbiota：an open，randomised，parallel-group study.Benef Microbes. 2016 Sep；7（4）：473-84.
[2] Glenn JD，Mowry EM.Emerging Concepts on the Gut Microbiome and Multiple Sclerosis.J Interferon Cytokine Res. 2016 Jun；36（6）：347-57.
论文作者:董灵芝1,孟攀1,王庆才2
论文发表刊物:《航空军医》2017年第4期
论文发表时间:2017/4/19
标签：肠道论文; 杆菌论文; 质粒论文; 因子论文; 患者论文; 数量论文; 浓度论文; 《航空军医》2017年第4期论文;