朱中元[1]2004年在《结核DNA疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究》文中指出结核病仍对人类健康构成重要威胁。全球现有TB患者近3000万，每年病死数近300万。结核病唯一可用的免疫预防制剂是BCG。它的免疫保护力介于0-80％之间，WHO的调查研究表明其保护力也仅为50％。成年人及老年人并不能得到BCG的有效保护。BCG对热敏感，在运输、贮存中需要低温保存。因此寻找新型高效，效果稳定的疫苗一直是相关领域研究人员关注的热点。 本研究的目的，是设计和构建真核表达结核菌蛋白的载体即DNA疫苗，并对其免疫功能及保护力进行研究。所设计构建的10种结核DNA疫苗依次为TB-V1，表达结核菌Mtb8.4；TB-V2，表达结核菌Ag85B蛋白；TB-V3，表达Mtb8.4、38kDa的Th表位和CTL表位以及Ag85B的融合蛋白；TB-V4，表达GST和Mtb8.4的融合蛋白；TB-V5，表达GST与Ag85B的融合蛋白；TB-V6，表达含hIL-2信号肽的Mtb8.4；TB-V7，表达含信号肽的Ag85B；TB-V8，表达含信号肽的Mtb8.4、38kDa蛋白的CTL／Th表位以及Ag85B成熟蛋白的融合蛋白；TB-V9，表达信号肽的Mtb8.4与GST的融合蛋白；TB-V10，表达含信号肽的Ag85B与GST的融合蛋白。TB-V6-TB-V10等5种载体，均在表达结核蛋白的N末端插入hIL-2的信号肽。p-hIL2质粒表达hIL-2；p-hIL2s质粒仅表达hIL-2的信号肽，作为对照。 所构建的12种质粒DNA，经PCR、酶谱鉴定后，并对插入表达目的的DNA片段进行了测序分析，表明所构建的12种载体质粒与构建设计准确无误。 p-hIL2、p-IL2s、TB-V6、TB-V7、TB-V8、TB-V9与TB-V10质粒DNA，以0.1M PBS将其分别稀释成1mg／mL溶液，除菌，然后分别在0d、15d和30d，分3次在8-10周龄的雌性C57BL／6小鼠四肢肌肉各注射0.1mL(100 μg／只小鼠)。对照组为等剂量的pVAX1、D-IL2s、PBS溶液。阳性对照组为BCG，以10~5CFU注射小鼠皮内，与其他小鼠初免时一同免疫，该组每只小鼠只免疫1次。疫苗免疫组、对照组共12组，分别是TB-V6～TB-V10等5组，p-IL2质粒注射组，TB-V6+p-hIL22作者:华南热带农业大学博士研究生朱中元，导师:张春发和TB一7+，hILZ联合免疫2组(每种质粒各50 ug免疫)，PBs，BcG，pVAXI和尸LZs共4个对照组。每组10只小鼠。 在最后一次DNA疫苗加强免疫15天后，杀死每组的其中5只小鼠，取脾磨成匀浆，并用10%FCS RPMll64O培养基将脾淋巴细胞配成10VmL浓度，加入到24孔培养板中，200 pl吼，5%Cq条件下培养72h，上清经ELIsA法测定鼠白细胞介素一(mIL一2)、而L-6、而L一10和鼠7干扰素(mIFN斗)。处死小鼠时采血，用于测定hIL一2。 在DNA疫苗最后一次加强免疫的21天，将结核菌H37RLv株培养约20天的细菌磨成悬液，取106/0.llnL菌经尾静脉注射实验感染每组剩下的5只小鼠。感染15天后，杀死所有小鼠，取脾、肝和肺分别称重，制成匀浆，接种0.lmL于改良罗氏培养基(L一)培养瓶，置37C培养20一30天，计数。并根据器官重量和稀释倍数，换算出每种器官培养物的CFUlg。每个小鼠的每种器官各接种3支L一培养，取其均数作为最后结果。 检测各免疫组、对照组的上清中的而L一2，而L一6，而L一10和而FN斗以及血清中hIL一2的含量，显示TB一v6，TB一V7，TB一vs，TB一vg，TB一V10，TB一v6+P扣L2，TB一v7+p扣L2及p一hILZ等8个免疫组的mIFN斗及mIL一显着高于pVAXI，PBs和p一LZs质粒对照组，与BCG免疫组的水平稍低或相当。其中p.hiLZ注射组，TB一v6+p-hiLZ以及犯一7+p一址LZ联合免疫组小鼠血清hIL一2水平显着升高。而这8组的体外淋巴细胞培养上清中的nilL一6及mIL一10的含量不升高或升高不明显。表明犯J6~TB一vlo等5种DNA疫苗及p扣LZ表达载体能够刺激预防结核病所需的几1型免疫应答。 TB一6~TB一V10等5种疫苗免疫的5只小鼠的脾结核菌载量分别为44 1 68、28400、1 8597、34703和22954CFIJ/g。TB一v6+P一LZ和TB一V7+P一L2联合免疫组和p一hILZ注射组的脾结核菌载量分别为12471、34x57和51339 CFU/g。对照组邓S、pVAXI、p一LZs及BCG的脾细胞悬液的结核菌计数结果均数分别是:61012、60716、69395和1 1 164CFU/g。表明本研究中构建的，IB一6~TB一v10等疫苗具有减少免疫鼠经H37Rv攻击后脾脏结核菌载量，且TB一vs疫苗，TB一v6+P一砚联合免疫，产生的保护力与BCG免疫产生的保护力非常接近。为进一步研究这些疫苗防止大动物感染结核菌H37Rv的实验研究奠定了基础。 我们在结核DNA疫苗的构建设计中使用了hIL一2信号肤序列，并采用表达hIL.2的质粒与TB DNA疫苗联合免疫及构建表达融合蛋白(GST)的疫苗，并获得与BCG非常接近的保护力。均为TB DNA疫结核D队疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究」苗研究首次报道。取得了预期的研究结果，对其他疫苗的研究有指导参考价值。 结论:1.所构建的表达结核菌蛋白或融合蛋白的载体:邓一1、TB一2、TB~V3、TB.V4、TB~VS、TB一V6、TB~V7、TB一VS、TB一Vg、TB一V10、表达bIL.2的载体卜拍LZ和表达hiL一2信号肤的载体尸LZs等经抗性筛选、酶谱鉴定及DNA序列分析，结果表明12种DNA疫苗表达载体质粒的构建均与设计要求准确无误。2.TB一6、TB一V7、TB一7、TB一VS、TB一Vg与TB一V105种DNA疫苗单独免疫，或者
吴曼丽[2]2015年在《一种肺泡巨噬细胞靶向的多表位结核粘膜疫苗》文中研究指明结核病(tuberculosis, TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的以肺部慢性肉芽肿炎症病变为主的慢性传染病。结核菌经呼吸道传播,其自然感染率非常高,虽仅有5%的自然感染人群会产生活动性肺结核及后续缓慢发作的肺结核干酪杨坏死和空洞型肺结核,95%的感染人群处于潜伏感染状态,在免疫力下降或空气环境因素等变化,很容易进展为活动性肺结核,同时人群传播极快。肺结核是十九-二十世纪间发病广泛、传染迅速、病程漫长、严重损伤健康与劳动力的感染性疾病。1919年前后,法国细菌学家Calmette和Guerin受牛痘疫苗的启发,将牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)在培养基传代230次,获得一株毒力显着减弱的减毒牛型结核杆菌------卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)是用于预防结核病的疫苗,经人体免疫试验,发现具有良好的预防肺结核功能。卡介苗的发明和全球接种使肺结核不再成为老百姓闻之色变的严重传染病。随后多种抗菌素的发现、利福平、异烟肼等化学抗菌药物的出现,使肺结核的治疗非常有效。然而上世纪80年代起,由于多重耐药结核菌株的出现导致一线抗结核化学药物失效、及卡介苗在控制肺结核疗效的不稳定甚至失效,人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核菌感染等问题的出现,肺结核重新成为再现(re-emerging)的严重传染病,并位居世界叁大传染病之一。世界卫生组织(WHO)((2014年全球结核病报告》显示,2013年全球900万人新染结核病,其中印度和中国分占24%和11%(100万),150万人死亡,其中36万为艾滋病患者。虽然从1990～2013年间肺结核的患病率与死亡率已显着降低了41%和45%,但其发病总数提示肺结核仍未有效控制。由于卡介苗仅能预防儿童原发性结核和肺外结核,对于耐药及多耐药结核菌的控制仍无好的方法,全球人口流动持续增高,因此防控结核病的重心仍旧应当定位于预防性结核疫苗的改良、创新研制和全球接种。研制新型结核疫苗具有重要的意义。结核疫苗研制的最重要基础和最大障碍在于迄今对于天然抗结核免疫保护机制和疫苗抗结核免疫保护评价指标仍有不解和争议。与目前大多数成功抗感染疫苗的保护机制(如乙肝预防性疫苗)所显着不同的是,抗结核免疫保护的中心法则是主要依赖T细胞免疫而不是抗体。在T细胞免疫中,最初认为是分泌IFN-γ的CD4+Th1细胞,通过激活肺泡巨噬细胞吞噬小体成熟酸化及与溶酶体融合、自噬小体形成与有效降解、iNOS杀菌系统等机制充分杀灭结核分枝杆菌。然而关于IFN-γ的抗结核免疫保护功能近年产生很多争议,全血IFN-γ水平甚至是潜伏结核进展为活动性结核的危险因素；BCG人群免疫后评估发现外周血IFN-γ+Th细胞频率与免疫保护/肺结核进展没有相关性；IFN-γ还具有活化Treg和限制免疫应答规模的免疫调控作用。TNF-α被发现与IΦN协同激活巨噬细胞合成NO并可限制肉芽肿病理组织规模减少组织病理损伤,在临床发现具有阻止潜伏结核进展为活动性肺结核的作用。而IL-2是重要的 细胞生长因子。由此近年认为同时分泌IFN-γ、 IL-2、TNF-α的多功能T细胞(multi-functional CD4+Th)才是结核免疫保护的关键。此外,CD8+T (CTL)细胞通过多种杀伤机制诱导感染的巨噬细胞凋亡,可使隐匿的结核菌有效释放结核抗原激活特异性T细胞应答。关于B细胞和抗体应答在抗结核免疫保护的作用迄今争议较大。B细胞分泌抗体IgG经FcR调理、激活巨噬细胞等的吞噬杀伤功能、作为APC提呈结核抗原激活T细胞的功能发挥一定效应。近年随黏膜(局部)免疫与黏膜免疫器官的理论的提出和不断重视,黏膜局部免疫微环境的多种免疫细胞与免疫分子的平衡对于控制感染、疾病进展十分重要,如早期的肺泡局部嗜中粒细胞浸润、巨噬细胞激活、IFN-γ产生；早中期的Th1、Th17、CTL浸润和杀伤功能增强；后期的Treg、IFN-γ、TNF-α等免疫调控应答等。这些应答均有别于全身(脾脏)免疫应答。肺脏组织被认为是一种新的黏膜免疫组织,存在独特的支气管相关淋巴组织(BALT),其中含有结构较为松散的T/B/DC等免疫细胞。Mtb感染肺泡巨噬细胞后,提呈抗原激活BALT中的Th细胞,进而激活特异性B细胞和CD8+T细胞,活化的效应B、T细胞通过趋化因子移动至黏膜效应局部,分泌SIgA,发挥T细胞效应,因此肺泡局部黏膜免疫很可能在抗结核免疫保护中发挥非常关键的作用。SIgA是人体黏膜部位的主要抗体类别,其为双体结构,中和活性显着高于单体IgG,SIgA不仅可中和胞外游离的黏膜体液中的病原体,还可以经pIgR受体主动转运至上皮细胞内,发挥胞内中和作用；胞内IgA病原复合物还可被TRIM21泛素化经由蛋白酶体降解。研究提示呼吸道支气管黏膜局部的SIgA对于中和胞外及胞内Mtb,及调节其他抗结核保护免疫具有重要的意义。肺结核的防治迄今仍面临很多未解的问题,从增强黏膜免疫角度出发,可从早期呼吸道及肺灌洗液SIgA的中和预防、肺黏膜局部多功能T细胞应答的增强,来显着克服常规疫苗不能诱导的肺脏局部抗结核免疫,从黏膜局部免疫的新角度来实现更好的免疫保护效果。综上,我们对于新型结核疫苗的设计理念聚焦于多特异性T细胞免疫和结核特异性黏膜免疫。为了诱导多抗原特异性T细胞免疫,我们将采用多表位核酸疫苗(poly-epitope vaccine)的策略,偶联多个具有免疫原性的结核T细胞表位,包括CD4+和CD8+T细胞表位,试图诱导多个结核抗原特异性的黏膜局部的T细胞应答,通过攻击结核菌多个靶抗原实现更好的免疫保护。为了诱导结核特异黏膜免疫,通过黏膜递送载体制备和组装一种易于通过黏膜、长效释放抗原的黏膜疫苗,并试图发展新的分子策略来增强黏膜的靶向性；在多表位核酸疫苗分子设计上,针对抗原表位免疫原性很弱,我们选择免疫原性非常强的蛋白作为载体支架,在其非功能结构域内插入多个T细胞表位,使T细胞表位获得一种良好的空间折迭与构象,这一设计理念也被称为“多表位蛋白支架疫苗(poly-epitope in protein scaffold, PEPS)"设计。这一设计的优点和创新在于：1)就抗原数目种类而言,偶联了多个蛋白及表位；2)蛋白本身的强免疫原性保留；3)表位由于良好的空间呈现,使得被APC吞噬后的酶类降解更为有效精准；4)多表位嵌合至蛋白中,可能产生很多新的B细胞表位和T细胞表位。蛋白载体的选择上,我们选择了来源于Mtb的热休克蛋白65 (heat-shock protein 65, HSP65)。HSP65是一种原核及真核生物的高度保守蛋白,是胞内分子伴侣,可携带运输抗原、使避免降解并正确,最终促进抗原的MHC提呈；最新研究表明HSP65可与APC如DC表面的TLR2/4作用,从而具有靶向DC并激活DC释放RANTES等细胞因子功能,被认为具有佐剂潜能。同时Mtb来源HSP65本身具有很强免疫原性和免疫保护特性。为此,我们选择结核来源HSP65作为疫苗骨架蛋白,将多个结核T细胞表位插入其非功能结构域,构建以HSP65为骨架的多表位核酸疫苗(poly-epitope in protein scaffold vaccine, PES)在黏膜递送载体选择上,我们首先选择脱乙酰壳聚糖(chitosan)这一具有无毒、缓释、促进黏膜吸附吸收等特性的天然阳离子多糖,其可与DNA共凝集形成纳米颗粒型复合物,不仅使抗原质粒得以在黏膜局部缓释,所形成的100-500nm大小的颗粒更易被黏膜局部的M细胞、巨噬细胞等进行吞噬,提高抗原摄取效率。运用这一载体技术,我们课题组前期曾成功制备了chitosan-DNA结核与病毒性心肌炎黏膜疫苗,均通过增强黏膜免疫提高了免疫保护。诱导肺黏膜特异性T细胞应答及SIgA分泌可能是增强抗结核免疫保护的新思路。为了诱导全面的肺局部黏膜免疫,本课题设计制备了一种以结核优势抗原HSP65为支架、嵌合多个结核抗原T细胞表位的多T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗(pPES);在此基础上,为高效诱导肺泡局部黏膜免疫以发挥更有效抗结核保护,以天然阳离子多糖-脱乙酰壳聚糖(chitosan, CS)为黏膜递载体(佐剂),经滴鼻免疫,诱导多抗原特异性肺黏膜免疫,并以大剂量BCG攻毒评估了其免疫保护效果。为进一步提高该疫苗的黏膜靶向和抗原释放效率,针对结核分枝杆菌感染肺泡巨噬细胞的特性,我们设计使用黏膜靶向分子---甘露糖,以甘露糖修饰的壳聚糖(mannosylated chitosan, MCS)组装DNA疫苗,进一步增强其黏膜免疫效果,以期接近甚至超过BCG的保护能力。本研究的创新性在于以诱导肺黏膜局部特异性免疫为目标的一种新型黏膜疫苗设计平台的建立。第一部分 多表位DNA疫苗的设计、构建、表达与免疫原性鉴定1、以HSP65为骨架的嵌合多T表位核酸疫苗pPES的分子设计根据文献我们选择了5个结核分枝杆菌毒株H37Rv来源的T细胞表位,其中4个CD4+Th1表位ESAT-61-20(BCG缺失)、Ag85B244-255、PPE25241-255、PE194-18,1个CD8+CTL表位,MTB10.43-11,根据相似蛋白二级结构相容的原则,我们在H37Rv株来源的HSP65蛋白的第146、151、157、395位氨基酸后分别插入ESAT-61-20、Ag85B241-255、MTB10.43-11、PPE25241-255-AAY-PE194-18串联表位。首先构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65,通过多次引物重迭延伸PCR,得到插入有5个T细胞表位的HSP65的PES基因片段,而后将其插入pcDNA3.1,得到pPES多表位结核疫苗质粒,经双酶切及DNA测序均证实构建成功。构建好的pPES序列经二级蛋白结构分析,对载体HSP65基本二级结构的影响很小。作为多表位嵌合设计的对照,我们构建了将表位直接串联插入至pcDNA3.1中的质粒p5pep,以及将表位串联后插入HSP65末端的质粒pHSP65-pep。2、HSP65蛋白的纯化表达构建pET32a HSP65质粒,转化BL21,IPTG诱导,并经包涵体纯化HSP65蛋白,纯化蛋白纯度大于90%,Western Blot鉴定和小鼠抗HSP65抗体特异结合。3、pPES质粒的真核表达效率为验证p-PES质粒的真核表达效率,将pPES转染293T细胞,Western Blot转膜并以抗HSP65抗体检测,证实pHSP65、pPES在体外真核细胞能够高效表达HSP65蛋白(65kD)及PES蛋白(75kD)4、pPES疫苗诱导的特异T细胞应答及与其他方式构建疫苗的比较为证实我们构建的嵌合有5个结核T细胞表位的HSP65载体多表位核酸疫苗的免疫原性,并比较这样的蛋白载体嵌合表达与非嵌合式串联表达、及无蛋白载体的表位串联的免疫原性的差异,以pcDNA3.1、pHSP65、pPES、p5pep、 pHSP65-pep DNA疫苗以肌肉注射方式,免疫雌性C57BL/6小鼠股四头肌,4次,间隔10天,每次50μg,总量200μg。末次免疫后10天取小鼠脾脏淋巴细胞,用灭活H37Rv、HSP65蛋白、5种单独表位多肽、5肽混合物分别进行刺激,进行IFN-γ的ELISPOT检测。结果显示：5种表位的简单串联(p5pep)几乎不能有效诱导特异性T细胞应答；pHSP65只能对载体HSP65产生高效T应答；5种表位串联于HSP65羧基端(pHSP65-pep)可产生一定的T细胞免疫,但是5种表位嵌入HSP65的pPES疫苗对5种结核肽及混合肽均有更显着增强的IFN-γ+T细胞免疫,且对BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应,提示我们构建的pPES疫苗确实比表位的其他构建方式具有更好的诱导T细胞应答的优越性。5、pPES疫苗的免疫保护效果以1×107CFU BCG滴鼻攻毒4周,取小鼠肺石蜡切片行H&E染色发现：pcDNA3.1载体组与p5pep组肺部呈现严重的肺结核炎症,提示表位直接串联无保护效果；pHSP65免疫组肺泡间隔增厚程度降低,具一定的免疫保护性；pHSP65-pep组的肺泡结构与炎症较前3组均有显着降低；而pPES疫苗组显示相对最佳的炎症减轻的免疫保护效果。肺、脾脏菌落计数显示：pPES疫苗降低脏器细菌生长的效果最为显着,由106.5和105.5显着降至105.4和104.6,提示我们构建的以HSP65为骨架的多表位核酸疫苗pPES相对其他方式构建的多表位疫苗具有更好的免疫保护特性。第二部分脱乙酰壳聚糖组装的结核DNA疫苗诱导的黏膜免疫与保护效果1、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性体液免疫为明确CS-pPES疫苗滴鼻免疫能否诱导载体蛋白HSP65特异性抗体,以CS-vector阴性对照,CS-pHSP65, CS-pPES分别滴鼻免疫,BCG皮下注射作为阳性对照,每只50μg DNA,隔周免疫4次。血清IgG水平方面：CS-vector对照组不能诱导血清IgG,其余各组均在6周起诱导,第8周达到峰值。CS-pPES滴鼻免疫诱导了显着高于对照组和CS-HSP65组的血清IgG,低于BCG组。提示在HSP65蛋白中插入5个结核表位并未显着影响HSP65载体蛋白诱导抗体应答的能力。为检测CS-pPES滴鼻免疫是否能诱生黏膜SIgA,取末次免疫后两周小鼠肺泡灌洗液(BAL)检测显示：CS-pPES疫苗滴鼻诱导了高水平的肺泡灌洗液SIgA,显着高于各组,与BCG组无显着差异。提示CS-pPES滴鼻免疫不仅可诱导血清IgG抗体,同时显着诱导了HSP65特异性黏膜SIgA。2、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性全身(脾脏)T细胞免疫为了检测CS-pPES滴鼻免疫诱生的特异性T细胞免疫,取末次免疫后2周小鼠脾脏淋巴细胞悬液,体外H37Rv、HSP65蛋白、5种表位多肽及5肽混合物分别刺激培养40h,进行IFN-γ的ELISPOT检测发现：CS-pPES组脾脏淋巴细胞对所有结核抗原刺激均产生了较高水平IFN-γ+T细胞应答,均高于CS-pHSP65和对照组(p<0.05),但略低于BCG组；此外,仅有CS-pPES免疫小鼠脾细胞对Mtb特有而BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应。流式细胞术方法检测了脾脏分泌多种细胞因子的T细胞频率。经灭活H37Rv刺激结果显示：CS-pPES免疫小鼠脾细胞诱导了结核特异性分泌3种细胞因子的CD4+和CD8+T细胞应答,虽总体水平比BCG组略低,但均显着高于对照和CS-pHSP65载体组(p<0.05)。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可显着诱导脾脏CD4+和CD8+多功能T细胞应答。3、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性肺局部黏膜细胞免疫取末次免疫后2周小鼠肺脏淋巴细胞悬液,进行IFN-γ的ELISPOT检测发现：CS-pPES组肺脏淋巴细胞对几乎所有结核抗原(PPE25和PE19多肽较弱)刺激产生了较高水平IFN-γ+T细胞应答,均显着高于CS-pHSP65和对照组(p<0.05)；还对BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应,提示CS-pPES滴鼻免疫诱导了肺脏黏膜局部多抗原特异性IFN-γ+T细胞应答,但略低于BCG效果。流式细胞术结果显示：CS-pPES免疫小鼠肺单核细胞诱导了结核特异性分泌3种细胞因子的CD4+和CD8+T细胞应答,总体水平显着高于BCG、及对照和CS-pHSP65载体组(p<0.05)。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可显着诱导肺脏黏膜局部CD4+和CD8+多功能T细胞应答,且该应答显着高于阳性对照BCG。4、CS-pPES疫苗滴鼻免疫的抗结核免疫保护大剂量BCG滴鼻攻毒后4周,肺脏病理结果显示,BCG皮下免疫组显示了最好的免疫保护效果；而CS-PES滴鼻免疫组肺脏病理显着优于CS-pHSP65疫苗组和对照,虽仍有肺泡细胞壁增厚和少量炎症。攻毒后肺、脾细菌数由105.8、105.1显着降低为104.6、104.4,提示CS-pPES结核黏膜疫苗滴鼻免疫能部分保护小鼠,但总体效果低于BCG疫苗。综上,我们构建的含有5个结核T细胞表位的pPES多表位核酸疫苗,经chitosan组装后,经滴鼻免疫,显着增强了裸露DNA所不能诱导的肺灌洗液SIgA和肺脏IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+T细胞应答,但在脾脏T细胞免疫强度和攻毒炎症保护方面效果略低于BCG疫苗。有待进一步优化和改进这一黏膜疫苗。第叁部分甘露糖化壳聚糖增强DNA疫苗的黏膜免疫与保护效果为进一步增强结核特异性黏膜免疫,我们将黏膜递送载体壳聚糖进行甘露糖化修饰,而后与质粒DNA通过共凝聚法形成MCS-pPES复合物颗粒疫苗,研究其理化特性并在小鼠体内的检测其免疫原性和免疫保护特性。1、CS-DNA和MCS-DNA复合物的理化特性研究以壳聚糖(CS)及甘露糖化壳聚糖(MCS)溶液,分别与质粒pPES复合形成CS-DNA和MCS-DNA复合物颗粒。经扫描电镜证实复合物为均一的球形颗粒,MCS-DNA颗粒约250-400nm,略大于CS-DNA。CS和MCS包装DNA效率将近100%,并可有效保护DNA免受DNA酶的降解。2、MC-pPES疫苗滴鼻免疫诱生的特异性抗体免疫应答以MCS-pPES、CS-pPES、pPES、MC-vector、CS-vector结核黏膜基因疫苗于0、2、4、6周滴鼻免疫小鼠,每次50μg,共4次,BCG皮下注射为阳性对照。MCS-DNA诱导的血清IgG效价近1：4000,显着高于DNA组,高于CS-DNA组(1：2800)。MCS-DNA免疫诱导的肺灌洗液SIgA效价为1：1100,显着高于CS-DNA和BCG诱导SIgA(1：600,p<0.05)；提示对黏膜递送载体壳聚糖进行甘露糖化修饰可显着增强特异性黏膜抗体特别是SIgA应答。3、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的全身(脾脏)特异性T细胞免疫ELISPOT显示,与CS-pPES相比,MCS-pPES滴鼻免疫显着增强了各表位及结核抗原特异性IFN-γ+T应答,且与BCG组相仿；同时对BCG缺失的ESAT-61-20抗原的应答水平显着高于BCG。流式细胞术显示：MCS-pPES滴鼻免疫诱导的H37Rv特异性脾脏叁细胞因子多功能T细胞应答强度(IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD8+T、TNF-α+CD4+T)均比CS-pPES疫苗效果显着增强,略低于BCG。5肽特异性脾脏多功能T应答(IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T)在MCS-pPES均显着性高于CS-pPES (p<0.05) TNF-α,+T显着高于BCG组(p<0.05),提示MCS-pPES滴鼻免疫显着增强H37Rv、5肽特异性脾脏多功能T细胞应答。4、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的肺黏膜局部特异性T细胞免疫ELISPOT显示：MCS-pPES疫苗又显着增强了CS-pPES及裸露DNA诱导的肺脏单核细胞IFN-γ+T应答；且对5肽和HSP65蛋白的应答均显着高于BCG组(p<0.05)流式细胞术显示：MCS-pPES组诱导的H37Rv特异性肺脏多功能T应答(IFN-γ+CD4+/CD8+T、TNF-α+CD4+T)均显着高于CS-pPES组及对照组(p<0.05),与BCG组近似。MC-pPES诱导的5肽特异性肺脏IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、 TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显着高于CS-pPES,且高于BCG组(p<0.05),提示甘露糖化壳聚糖组装的pPES疫苗显着增强5肽特异性肺黏膜多功能T细胞应答,不仅优于CS-pPES,且优于BCG疫苗。5、抗结核免疫保护效果裸露DNA疫苗滴鼻免疫的保护效果有限：MCS-pPES黏膜疫苗的肺结核免疫保护效果与CS-pPES相比显着增强,肺脏炎症浸润灶及炎症程度显着减少,肺脏细菌载量显着降低,与BCG效果相仿。综上,为提高壳聚糖递送的多表位结合疫苗的免疫原性和免疫保护,使用修饰的甘露糖化壳聚糖作为黏膜递送载体,发现在特异性血清IgG、肺灌洗液SIgA、脾脏和肺脏IFN-γ+T细胞应答均显着高于壳聚糖疫苗效果,其中,肺灌洗液SIgA、肺脏单核细胞5肽特异性IFN-γ+T应答、肺脏5肽特异性IFN-γ+CD4+/CD8+T、 IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显着高于CS-pPES及BCG组,提示诱导肺脏黏膜免疫的能力得以显着提高。最终的免疫保护效果也得以显着提高。第四部分甘露糖化壳聚糖特异靶向肺泡巨噬细胞的机制研究为了探讨甘露糖化壳聚糖增强黏膜免疫应答的机制,我们通过几种报告抗原的原位组织染色及免疫组化方法检测了疫苗在肺脏的表达效率,并通过双荧光共聚焦评估了两种黏膜疫苗的肺泡靶向特性。1、原位组化检测MCS-DNA的肺脏表达效率为了在体内验证壳聚糖和甘露糖化壳聚糖对于DNA疫苗的递送与表达效率,β-半乳糖苷酶为报告抗原：以含50ug质粒DNA的CS-pLacZ及MCS-pLacZ滴鼻免疫小鼠。2天后取小鼠肺脏X-gal染色发现：裸露质粒无法在肺脏有效表达；CS-p-LacZ质粒在肺泡间质有少量表达：而MCS-pLacZ滴鼻小鼠肺泡间质及肺泡细胞内LacZ的表达量和表达区域显着高于其余两组,提示壳聚糖与甘露糖化壳聚糖均可增强外源DNA在肺部的原位表达,且甘露糖化壳聚糖增强抗原黏膜表达的能力最强。HSP65为报告抗原,48小时小鼠肺脏冰冻切片经HSP65特异性抗体染色发现：CS-pHSP65显着提高肺脏间质和细胞内HSP65抗原表达,而MCS-pHSP65的增强效果更为广泛和强烈,提示壳聚糖和甘露糖化壳聚糖均可显着增强DNA在肺部的原位表达,以后者的增强效果更为显着。2、FITC示踪MCS-DNA的肺脏巨噬细胞靶向情况为了检测甘露糖化壳聚糖是否可以有效靶向肺泡巨噬细胞,分别以FITC标记壳聚糖和甘露糖化壳聚糖,而后以含50ugDNA的FITC-CS-DNA及FITC-MCS-DNA通过气管灌注小鼠肺脏,取24小时肺脏冰冻切片,以抗小鼠单核+巨噬细胞抗体(MOMA-2)进行特异染色,DAPI衬染,以共聚焦荧光显微镜观察,结果显示：小鼠肺泡巨噬细胞附近有一定的CS-DNA的荧光强度,而经MCS-DNA免疫后,肺泡局部绿色荧光的数目和强度均有显着提高,提示MCS-DNA比CS-DNA更能有效地到达肺泡巨噬细胞,即靶向性显着增强。3、FITC示踪MCS-DNA的巨噬细胞摄取能力为进一步探究甘露糖化壳聚糖递送系统指引下的肺泡巨噬细胞靶向后,对巨噬细胞的抗原摄取能力是否有影响,体外Raw264.7细胞,加入含2μg质粒DNA的FITC标记的CS-pPES及MCS-pPES,孵育0.5小时后共聚焦激光显微镜检显示：巨噬细胞细胞对于CS-pPES的摄取能力有限,而MCS-pPES对抗原的摄取能力显着增强,提示经甘露糖修饰的壳聚糖递送系统可增强巨噬细胞对疫苗复合物的摄取能力。综上,我们创新性设计并构建了多结核T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗pPES,并证实该表位嵌合构建方式的免疫效果显着优于表位简单串联、表位串联后与HSP65串联。为诱导结核特异性黏膜免疫,增强早期肺黏膜局部的SIgA(?)黏膜T细胞免疫,以壳聚糖作为黏膜递送载体对多表位DNA疫苗予以组装。CS-pPES疫苗经滴鼻免疫,显着增强了裸露DNA所不能诱导的肺灌洗液SIgA和肺单核细胞IFN-γ+T细胞应答：而整体T细胞应答强度和抗结核保护效果仍低于BCG。为进一步增强黏膜免疫,对壳聚糖进行甘露糖化修饰而后制备MCS-pPES黏膜结核疫苗。证实其滴鼻免疫诱导的各项全身免疫和黏膜免疫显着高于CS-pPES疫苗：不仅如此,在肺灌洗液SIgA、肺脏单核细胞5肽特异性IFN-γ+T应答、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显着高于BCG组,提示诱导肺脏黏膜免疫的能力得以显着提高。最终的免疫保护效果也得以显着提高。经体外机制的探讨,证实对递送载体甘露糖化的设计的确显着增强了肺泡巨噬细胞靶向、肺泡抗原表达和巨噬细胞摄取。这一黏膜靶向性载体(佐剂)设计策略兼顾了黏膜靶向和黏膜APC功能增强功能,预期在增加我们的结核疫苗的表位种类和组合基础上(目前仅5个表位,偏少),可实现更为有效可观的结核疫苗保护效果。本研究为多表位结核疫苗的分子设计及新型结核黏膜疫苗设计提供了新思路,为肺结核的免疫保护机制提供了有关肺脏黏膜SIgA和黏膜T细胞应答的有益补充。制备的两种结核黏膜疫苗在进一步增加优势抗原表位组合基础上,有望获得更为高效的黏膜免疫与结核保护效果。
余大海[3]2008年在《结核杆菌和布鲁氏杆菌多价DNA疫苗的研究》文中研究表明结核病和布鲁氏病是严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患传染病。疫苗是控制结核病和布鲁氏病的有效方法。目前,BCG是预防结核病的唯一疫苗,但其免疫效力不稳定,且对成年人无保护;S19疫苗是在牛布鲁氏病中使用的疫苗,但血清学反应强,且安全性受到质疑,有感染人的可能。因此,高效的新型疫苗对于控制结核病和布鲁氏病蔓延至关重要。本论文在阐述结核病和布鲁氏病疫苗研究的基础上,着重分析了DNA疫苗的作用机制、发展现状及其改进策略。用分子生物学的方法分别构建了编码结核杆菌叁种抗原(Ag85B,MPT64和MPT83)和布鲁氏杆菌叁种抗原(BCSP31,SOD,和L7/L12)的原核表达载体,诱导表达并纯化后得到抗原蛋白。构建此六种抗原的真核表达载体,进行体外瞬时表达实验,用GFP偶联和RT-PCR等方法确定蛋白表达的部位和表达量。大量提取制备真核质粒作为DNA疫苗,免疫小鼠叁次后8周,用高剂量的结核杆菌或布鲁氏杆菌感染小鼠或大动物牛。本文从体液免疫水平、细胞因子水平、分泌细胞因子细胞的数量、T细胞激活比例、T细胞亚型的变化、杀伤性T细胞的定量、结合动物感染后脏器载菌量等多个指标,对各个组合的疫苗的优势及所诱导免疫反应的进行综合评价,以期对DNA疫苗效力及其佐剂触发免疫反应的机制进行诠释。实验结果表明,多价DNA疫苗能够诱导更强的TH1型免疫反应,扩大保护范围,保护效力显着高于单价DNA疫苗。通过对比联合疫苗与不同矿物质佐剂、基因佐剂共同免疫后所产生的保护效果,证实佐剂基因佐剂IL-2、IL-12、IL-15、和无机佐剂DDA在诱导TH1型细胞反应,增强杀伤性T细胞的功能方面发挥重要作用。尤其是用六种抗原联合DNA疫苗与IL-12共同免疫,产生了“一针治两病”的效果,保护效率显着高于目前使用的BCG和S19传统疫苗。IL-15佐剂显着提高了分泌IFN-γ的CD8+T细胞的数量,从体内、体外实验证实了CD8+T细胞在对抗布鲁氏杆菌过程中的重要作用。多肽佐剂KLKL5KLK提高了APC细胞对抗原的摄取、加工和递呈能力,延长了免疫保护期、增强CD4+T细胞作用和细胞杀伤水平,为临床应用提供了重要证据。用包裹剂PLGA达到DNA缓释和避免核酸酶对DNA降解的效果以减少免疫剂量,结果表明PLGA在提高抗原表达量,延长表达时间上有显着作用,在免疫攻毒试验中,免疫一次PLGA包裹的多价DNA疫苗产生了与免疫叁次不加PLGA的多价DNA疫苗类似的保护效力。BCG疫苗加强策略在大动物牛中的实验表明,加强策略显着提高了免疫牛中CD4+T细胞的比例,诱导了高水平的IFN-γ,且一直持续到攻毒后22周。用结核杆菌强毒株感染小鼠,构建潜伏期感染的动物模型。感染后8周,用异烟肼和吡嗪酰胺治疗3个月。治疗期间,用编码叁种结核杆菌抗原的基因联合治疗,使免疫应答朝TH1型方向进行,产生更多的TH1型的细胞因子如IFN-γ,使吞噬有结核杆菌的巨噬细胞从休眠状态转变为活化型,以杀死结核杆菌,提高治疗效率,降低载菌量,使治疗时间减少一半,克服由于长期使用药物产生耐药性等问题。对开发有实际意义的治疗用核酸疫苗具有重要的启示。
唐权[4]2006年在《基于卡介苗Prime结核杆菌DNA疫苗Boost免疫策略及其效应研究》文中研究说明结核病是由结核杆菌引起的慢性传染病,其中肺结核病最为常见。据WHO官方网站数据显示,全世界约有1/3的人口感染过结核杆菌,每年患结核病的人数约新增800万人,约有200万人死于结核病。而我国卫生部公布2005年全国法定报告传染病疫情显示:无论是报告发病数还是死亡数,肺结核均列第一位。HIV加速了结核杆菌的传播,而不规范的用药使大量结核耐药菌株出现,造成许多结核病人用现有抗结核药难以治愈。再加上传统疫苗卡介苗(Bacille calmette guerin,BCG)免疫效果总体下降,对其保护效率(0-80%)也存在争议,因此急需研制新型疫苗以及对已研制的疫苗制订新的免疫策略增强抗结核病效应。国内外学者在结核DNA疫苗方面进行了一系列的研究,其中Ag85A作为靶抗原取得了一定的效果,但单独以其作为DNA疫苗的靶抗原,仍需要一定的改进。我们实验室在前期的研究中成功构建了结核杆菌Ag85A和细胞因子GM-CSF共表达DNA疫苗,通过动物实验证实共表达DNA疫苗免疫组小鼠的CTL活性明显增强、特异性淋巴细胞明显增殖,NK细胞杀伤活性与对照组相比有一定提高。在此实验基础上,利用双启动子真核表达质粒pRSC,分别设计与构建新型结核杆菌DNA疫苗,为研究新型有效的结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。本实验分为两个部分:一、基于结核杆菌Ag85A的共表达DNA疫苗的设计、构建与鉴定目的:利用双启动子真核表达质粒pRSC,分别构建结核杆菌Ag85A与细胞因子IL21共表达疫苗pRSC-mIL21-Ag85A以及结核杆菌Ag85A与细胞因子GM-CSF共表达疫苗pRSC-mGMCSF-Ag85A ,为研究新型结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:(1)pRSC-mIL21-Ag85A的构建,先用PCR方法从本室保存的重组质粒pcDNA3.1-mIL21中扩增出小鼠IL21基因序列并插入到质粒pRSC上成为pRSC-IL21,再用PCR方法从pIRES-Ag85A重组质粒中扩增出Ag85A基因,构建于pRSC-IL21重组质粒上,成为共表达DNA疫苗pRSC-mIL21-Ag85A;(2)pRSC-mGMCSF-Ag85A的构建,用PCR方法从pIRES-Ag85A重组质粒中扩增出Ag85A基因后构建于本室保存的重组质粒pRSC-mGMCSF上,得到共表达DNA疫苗pRSC-mGMCSF-Ag85A。结果:经酶切、基因测序及RT-PCR证实,重组DNA疫苗构建正确并能成功表达目的基因。结论:基于Ag85A与IL21、Ag85A与GM-CSF的共表达DNA疫苗的构建成功,为比较研究不同载体共表达DNA疫苗(pRSC-mGMCSF -Ag85A、pIRES-Ag85A-mGMCSF)以及基于不同细胞因子的共表达DNA疫苗(pRSC-mIL21-Ag85A、pRSC-mGMCSF-Ag85A)的抗结核免疫效应及筛选高效结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。二、基于BCG Prime结核杆菌Ag85A/GM-CSF共表达DNA疫苗Boost免疫策略及其效应
薛玉芹[5]2013年在《结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价》文中认为目的：（1）构建包含密码子优化CFP10基因的结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o。（2）初步评价该疫苗免疫小鼠所诱导的免疫效应。方法：（1）根据小鼠和人的密码子使用偏好，使用Gene Optimizer软件对结核分枝杆菌CFP10蛋白的编码基因进行优化，但不改变其氨基酸的序列。优化后的CFP10基因序列由南京金斯瑞公司进行全基因合成并插入真核表达载体pVAX1，构建包含密码子优化CFP10基因的真核表达质粒pVAX1/CFP10-o。同时，从结核分枝杆菌H37Ra株基因组中，PCR扩增天然密码子CFP10基因，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，纯化后的酶切产物CFP10基因与经同样酶切处理的真核表达载体pVAX1连接，构建包含天然密码子CFP10基因的重组质粒pVAX1/CFP10，用酶切及测序的方法鉴定pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒构建是否正确。（2）以EcoRⅠ和HindⅢ将质粒pVAX1/CFP10进行双酶切获得CFP10基因，亚克隆至原核表达载体pET42a(+)中，构建原核表达质粒pET42a/CFP10，转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达重组蛋白CFP10，获得的蛋白经His亲和层析柱纯化，并采用SDS-PAGE电泳和western blot对表达产物进行分析和鉴定。纯化后的蛋白再通过去细菌去内毒素试剂盒进一步纯化去除内毒素，并以鲎试验检测内毒素去除效果。（3）大量提取经鉴定正确的包含密码子优化CFP10基因的真核表达质粒pVAX1/CFP10-o及包含天然密码子CFP10基因的pVAX1/CFP10重组质粒，经梭华-SofastTM介导体外转染Hela细胞，并通过RT-PCR、间接免疫荧光法检测重组质粒是否能在真核细胞内表达；将pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒以肌肉注射辅以体内电穿孔的方式体内瞬时转染小鼠骨骼肌，免疫组织化学法检测其在骨骼肌细胞内的表达情况。（4）将28只SPF级BALB/c小鼠分为4组，即pVAX1/CFP10-o组，pVAX1/CFP10组，pVAX1空质粒组，NS（生理盐水）组，分别以pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、pVAX1质粒和NS经肌肉注射辅以体内电穿孔途径进行免疫，每2w加强免疫一次，共免疫3次。间接ELISA法检测初次免疫后0、2、4、6w小鼠血清中CFP10特异性抗体IgG的水平；ELISA法检测末次免疫后2w（第6w）小鼠血清中IFN-γ的浓度；ELISPOT法检测末次免疫后2w（第6w）小鼠脾淋巴细胞和重组蛋白CFP10共培养后产生IFN-γ的T淋巴细胞数量；流式细胞仪检测CFSE标记的末次免疫后2w（第6w）小鼠T淋巴细胞经重组蛋白CFP10刺激后的增殖动力学变化，用flowjo软件分析其增殖指数。结果：（1）构建的pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重组质粒，经酶切电泳鉴定均分别于约3000bp和300bp处各见1条带；测序结果显示插入基因序列均分别与设计的CFP10优化基因和结核分枝杆菌H37Rv株CFP10编码基因序列一致。（2）成功构建pET42a/CFP10质粒,经酶切电泳鉴定分别于约5900bp和300bp处各见1条带；测序结果显示插入基因序列与结核杆菌H37Rv株CFP10编码基因序列一致。转化有重组质粒的BL21（DE3）经过0.1mmol/L IPTG、37℃诱导6h，高效表达了占菌体蛋白总量40%的可溶性融合蛋白，经His亲和层析柱纯化后的相对分子量约为37KD的蛋白能与CFP10多克隆抗体发生特异性的结合反应，经ToxinEraserT M去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（3）质粒转染真核Hela细胞后经RT-PCR检测结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒组均得到预期的目的条带；间接免疫荧光结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒转染的Hela细胞均可见特异性绿色荧光，且pVAX1/CFP10-o组荧光强度高于pVAX1/CFP10组，空质粒pVAX1组和NS组未见特异性绿色荧光；质粒转染小鼠骨骼肌细胞后免疫组织化学结果显示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10组小鼠肌肉组织内均有棕黄色阳性颗粒，pVAX1/CFP10-o组多于pVAX1/CFP10组，pVAX1组和NS组未见明显的棕黄色阳性颗粒。（4）pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平检测显示随免疫次数的增多呈上升趋势，在相同的免疫时间内，pVAX1/CFP10-o组高于pVAX1/CFP10组。末次免疫后2w（第6w），两组IgG抗体水平达到最高，且pVAX1/CFP10-o组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平明显高于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p﹤0.05），pVAX1/CFP10组高于pVAX1组及NS组（p﹤0.05），而pVAX1组和NS组小鼠血清CFP10特异性IgG抗体水平差异无统计学意义（p﹥0.05）；pVAX1/CFP10-o组小鼠血清IFN-γ浓度明显高于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p﹤0.01），pVAX1/CFP10组小鼠血清IFN-γ浓度高于pVAX1组及NS组（p﹤0.01），而pVAX1组和NS组小鼠血清IFN-γ浓度差异无统计学意义（p﹥0.05）；ELISPOT结果显示pVAX1/CFP10-o组斑点数明显多于pVAX1/CFP10组和pVAX1组及NS组（p﹤0.01），pVAX1/CFP10组斑点数多于pVAX1组及NS组（p﹤0.01），而pVAX1组及NS组斑点数差异无统计学意义（p﹥0.05）；各组T细胞的增殖指数检测显示pVAX1/CFP10-o组（2.89±0.39%）明显高于pVAX1/CFP10组（2.06±0.16%）（p﹤0.05），pVAX1/CFP10组明显高于pVAX1组和NS组（p﹤0.05），而pVAX1组和NS组之间差异无统计学意义（p﹥0.05）。结论：（1）成功构建了包含CFP10基因密码子优化结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和包含CFP10基因天然密码子的结核DNA疫苗pVAX1/CFP10。（2）成功高效原核表达了可溶性CFP10重组蛋白并获得了无内毒素的纯化蛋白。（3）转染pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10质粒的Hela细胞和小鼠骨骼肌均可有效表达CFP10蛋白，且转染pVAX1/CFP10-o质粒的Hela细胞和小鼠骨骼肌表达CFP10蛋白的效果更佳。（4）结核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10均可诱导BALB/c小鼠产生CFP10特异性的体液免疫和细胞免疫应答，且pVAX1/CFP10-o DNA疫苗诱导产生的CFP10特异性的免疫应答水平更高。
吴小丽[6]2010年在《中试生产防龋DNA疫苗、结核DNA疫苗效力评价试验》文中研究指明DNA疫苗是近年来基因治疗研究中所衍生并发展起来的一个新的研究领域。它是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体免疫机体,使外源基因在活体内表达,从而刺激免疫系统产生特异性的免疫应答。本论文以我所中试生产的防龋DNA疫苗和结核DNA疫苗为基础,对这两种疫苗免疫机体后诱导的免疫效能进行评价。实验一中试生产的防龋DNA疫苗效力评价试验本实验以武汉大学口腔医学院构建的靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX1为基础免疫定菌大鼠,研究靶向融合防龋DNA疫苗pGJA- P/VAX1的免疫防龋效果。将56只大鼠随机分为7组,接种变形链球菌并给予致龋饲料,按3因素(质粒,蛋白,佐剂)2水平(肌肉,粘膜免疫途径)析因设计方案免疫大鼠,分别于第0、2、4、6、8、10周采集大鼠血清和唾液样本。并建立大鼠血清IgG和唾液IgA的间接ELISA检测方法,对建立的方法进行方法学验证。完成了各组血清和唾液样本的检测。实验结束时处死大鼠,参照Keyes经典计分标准进行龋齿计分。SPSS软件分析结果表明:(1)疫苗免疫组特异性抗PAc血清IgG和唾液IgA抗体水平均显着高于空载体免疫组(P<0.0 1),而龋齿记分显着低于空载体免疫组(P<0.01 )。(2)同一免疫途径中,DNA疫苗初免、蛋白加强组特异性抗PAc血清IgG水平显着高于单纯DNA疫苗免疫组(P<0.01),特异性抗PAc唾液IgA抗体水平、龋齿计分无显着差异。(3)同一免疫方案中,黏膜免疫组特异性抗PAc唾液IgA抗体水平高于肌肉免疫组,龋齿计分低于肌肉免疫组(P<0.05),血清抗体水平无显着差异(4)黏膜免疫中,佐剂蛋白加强组的血清IgG和唾液IgA最高,显着高于其他组(P<0.01),龋齿计分单纯DNA不加佐剂组高于其他叁组(P<0.05)。由此得出结论:重组基因质粒pGJA-P能有效的抑制龋病的发生和发展。滴鼻法和肌肉注射法接种防龋DNA疫苗都可有效防龋,而滴鼻法较肌肉注射法能更有效的控制龋损的发生,降低龋坏程度。实验二中试生产的结核DNA疫苗初步效力试验以解放军309医院构建的编码Ag85A抗原的结核DNA疫苗为基础免疫小鼠,研究中试生产的TB DNA疫苗免疫效果。将4-6周龄的Balb/c小鼠20只随机分为2组,一组免疫TB DNA疫苗,另一组免疫PBS作为阴性对照,于免疫前采血,共免疫叁次,在第叁次免疫后3周摘眼球处死小鼠,收集全血,分离血清,进行血清特异性抗体检测和细胞因子(Interferon-γ、IL-4)检测;同时对每只小鼠取脾细胞进行特异性Interferon-γ分泌检测和脾细胞CD4+、CD8+百分率检测。结果统计分析显示:(1)TB DNA疫苗不能刺激小鼠机体产生显着的特异性抗体。(2)疫苗免疫组血清细胞因子IFN-γ水平显著高于PBS对照组,而IL-4水平与PBS对照组之间无显着差异。(3)酶联免疫斑点检测结果表明TB免疫组脾细胞特异性IFN-γ分泌水平高于PBS组(P<0.05)。(4)TB DNA疫苗免疫组CD4+细胞百分率高于PBS对照组有统计学差异(0.025 唐权, 陈峻崧, 窦骏[7]2005年在《结核DNA疫苗免疫策略研究进展》文中进行了进一步梳理近年来,结核DNA疫苗的研制得到飞速发展,在传统结核DNA疫苗的基础上构建新型DNA疫苗以及基于结核DNA疫苗的PrimeBoost免疫策略的研究成为热点,新的接种途径及接种技术有助于提高DNA疫苗在试验动物的免疫保护作用,同时对结核DNA疫苗的安全性也不可忽视。 孔红梅[8]2013年在《新型结核疫苗p846的保护作用及其机制探讨》文中研究指明目的：构建结核新型DNA疫苗pcDNA3.1-Rv3615c-Mtb10.4-Rv2660c (p846)，评价其在抗结核感染中的保护作用，并探讨发挥该保护作用的潜在机制。方法：通过分子生物学的方法构建含有结核杆菌叁抗原融合表达质粒p846及单个抗原表达的重组质粒pcDNA3.1-Rv3615c (pRv3615c)，pcDNA3.1-Mtb10.4(pMtb10.4)和pcDNA3.1-Rv2660c(pRv2660c)，测序鉴定正确后体外转染293T细胞，western blot鉴定其在真核细胞内的表达。同时构建叁个单抗原及融合抗原846的原核表达质粒，并应用GST标签和His标签Ni柱亲和层析技术进行相关蛋白纯化。将成功构建的叁抗原融合基因疫苗和单抗原疫苗以肌肉注射的方式对小鼠进行免疫，具体免疫方式如下：选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分成6组，每组20只：p846组，pRv3615c组，pMtb10.4组，pRv2660c组，空载体pcDNA3.1组及BCG阳性对照组，每只小鼠每次使用50μg的重组质粒于0、2、4、6周进行免疫，其中BCG组在0周以5×106CFU的剂量皮下免疫一次。对免疫小鼠每隔两周进行一次血清中IgG抗体检测。末次免疫后两周，检测相应的细胞免疫应答类型：包括ELISPOT检测产生IFN-γ的T细胞数量、Brdu试剂盒检测T细胞增殖、LDH的释放检测T细胞的杀伤活性、流式细胞仪及ELISA检测相关的细胞因子等。末次免疫后4周，进行BCG攻毒，并于攻毒后的4-6周进行该疫苗的保护性实验检测（组织病理切片和CFU实验等），免疫后未攻毒的各组小鼠再继续饲养用于相关的记忆性T细胞的检测。结果：1.构建了结核杆菌叁抗原融合DNA疫苗p846，和单抗原DNA疫苗pRv3615c， pMtb10.4，pRv2660c及其原核表达质粒；2.细胞免疫应答检测结果如下：1）特异性T淋巴细胞增殖ELISA（Brdu）实验发现，构建的p846融合抗原疫苗可有效促进T细胞的特异性增殖，尤其在灭活的H37Rv和TFP846蛋白的刺激下，其OD值达2.5左右，显着高于单抗原疫苗组和空载体组（p<0.05）；2）IFN-γ的ELISPOT检测结果显示，与单抗原疫苗免疫组相比，叁抗原融合基因疫苗p846可大量促进分泌IFN-γ的T细胞的产生；脾脏培养上清相关细胞因子的检测，发现p846疫苗免疫组显着增加了Th1型细胞因子如IFN-γ和TNF-α的分泌，同时也促进了和Th1型应答密切相关的细胞因子IL-2和IL-17A的产生，与ELISPOT结果相一致；3）通过胞内染色分析了p846疫苗诱生的体内特异性CD4+和CD8+T细胞的产生情况，发现p846疫苗免疫组脾脏CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T细胞比例分别为6.45%和7.61%；CD4+IL-2+和CD8+IL-2+T细胞比例分别为24.1%，20.2%；CD4+TNF-α+和CD8+TNF-α+T细胞比例分别为59.3%，71.3%，相对单抗原疫苗组(尤其是CD4+T细胞)均有显着统计学差异（p<0.05）；3.体液免疫应答检测结果：通过小鼠血清中IgG抗体的检测发现p846疫苗可以诱生大量的高亲和力抗体的产生，OD值达3.25左右，滴度达1:4500，且主要以IgG2a亚型为主；4.组织病理切片HE染色的结果显示，攻毒后6周，p846疫苗免疫的小鼠：大部分肺泡结构清晰，肺泡腔内充血、出血明显减少，肺间质内仅有少量炎性细胞浸润；而单抗原疫苗组及空载体组的小鼠：大部分肺泡结构破坏，肺泡腔内有大量充血、出血且有大量炎性细胞浸润；5.肺脏和脾脏CFU的结果显示，p846疫苗免疫组小鼠肺部结核菌载量即Log10CFU约为3.50，脾脏的Log10CFU约为2.70，相对于单抗原疫苗组（其中肺脏Log10CFU约为5.5，脾脏的Log10CFU约为5.0），有显着性差异(p<0.05)；6.记忆性T细胞检测显示p846疫苗可显着促进效应型记忆性CD4+T（CD25-CD44+CD62L-CCR7-）细胞的产生，其值可达53.6%，相对于单抗原疫苗组pRv3615c的46.1%，pMtb10.4的45.5%，pRv2660c的41.0%和空载组的37.3%，有显着统计学差异（p<0.05）。结论：我们构建的新型结核叁抗原融合DNA疫苗p846免疫小鼠后，不仅能诱生强烈的细胞免疫应答和一定的体液免疫应答，还能有效的发挥抗结核杆菌感染的作用，也可有效促使效应型记忆性CD4+T细胞的产生，且保护效果优于单抗原DNA疫苗，有望成为一种能有效阻止结核杆菌复制和结核病复发的新型疫苗。 李晓倩[9]2017年在《抗耐药结核多效基因工程疫苗的构建及免疫效果分析》文中研究指明目的:构建抗耐药结核重组质粒DNA疫苗p IEMKMAGP,并初步评价其免疫效果,为临床耐药结核病的治疗提供新的选择。方法:(1)利用DNA重组技术,将结核分枝杆菌表面抗原MPT64、Ag85B基因编码区和野生型kat G基因编码区,以及穿孔素PRF1、颗粒溶素GNLY基因编码区插入到真核表达载体p IRES2-EGFP中,构建抗结核多基因真核串联表达载体p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)利用电转化的方法,将质粒p IEMKMAGP转化耻垢分枝杆菌制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;(3)利用脂质体转染技术,将质粒p IEMKMAGP转染293T细胞,应用荧光定量PCR技术检测目的基因表达水平,应用Western blot技术检测目的蛋白表达情况;(4)质粒p IEMKMAGP免疫接种C57BL/6小鼠和SD大鼠,ELISA试剂盒检测IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平。结果:(1)成功构建了抗耐药结核多效基因工程DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)成功制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;(3)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在293T细胞中成功表达,融合蛋白MPT64/Ag85B、融合蛋白GNLY/PRF1成功表达,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;(4)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在C57BL/6小鼠组织器官m RNA水平上有一定表达,但蛋白水平上未检测到目的蛋白的表达;(5)质粒p IEMKMAGP免疫接种SD大鼠中外周血血清中的IL-12和IFN-γ细胞因子表达水平明显升高。结论:(1)抗耐药结核真核表达质粒p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)作为DNA疫苗能够在细胞水平上有效表达,有望为进一步开发新型的抗结核疫苗提供了实验依据。(2)本研究构建的抗耐药结核DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)可以引起IL-12和IFN-γ细胞因子水平的升高。 曹德君[10]2013年在《GM-CSF-Ag85B-Rv3872-CFP10-ESAT6重组卡介苗的构建与鉴定》文中进行了进一步梳理结核病是由结核杆菌复合群引起的一种人畜共患病,具有较高的感染率和死亡数。该病不仅严重影响人类的身体健康,还对畜牧业造成惨重的经济损失。据统计,每年全球约有叁分之一的人口潜伏感染结核,约有940万新发结核病例,170万人死于结核感染。同时,每年有5千万牛感染结核,导致30亿的损失。在人结核防治上,主要采取新生婴儿BCG(Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin)免疫和结核病人的抗生素治疗。BCG免疫只对儿童有保护效果,且不同地区免疫保护效果差异很大。结核病治疗病程长,需6个月以上；药物副作用大；且由于多耐药药和泛耐药菌株的出现,治疗效果越来越差。因此,急需开发新型高效疫苗,增加对儿童的保护力,同时对成年有效。由于结核病的人兽共患特征,动物结核的防控措施是“检疫-扑杀”,不做免疫。但“检疫-扑杀”政策具有很多缺陷,难以实质性实施。首先,检疫-扑杀的成本过高,发展中国家难以承受；其次,动物结核病主要由牛分枝杆菌引起,该菌宿主范围极广,不同宿主间的传播导致“检疫-扑杀”政策效果差；同时,野生动物难以进行检疫和扑杀。因此,动物结核病的防控也急需要有效疫苗。目前医学上结核疫苗的开发主要基于两方面：1)改良传统BCG,向BCG中引入保护性抗原,增强免疫力；2)致弱毒力型结核分枝杆菌。由于BCG来自于牛分枝杆菌,而人结核是主要由结核分枝杆菌引起,因此,人们希望用相当种类的细菌开发新型疫苗,以获得更佳的免疫保护。由于牛结核等动物结核主要是由牛分枝杆菌引起,因此研究改良BCG既可以为人结核防控提供新型疫苗,也可以为动物结核病的防控提供新的手段。与毒力型牛分枝杆菌比较,BCG基因组缺失了多个RD区基因,其中有部分基因具有良好的免疫原性,能诱导免疫保护。向BCG中引入这些基因,可提高BCG的免疫保护作用。能诱导免疫保护作用的结核杆菌蛋白基因主要有：TB10.4, Ag85A, Ag85B, CFP-10, ESAT-6, HSP65和Mtb39A等。其中部分已被引入到BCG中,并证明能增强BCG的免疫保护作用。有一些细胞因子作为分子佐剂也被应用到重组BCG的研发中,常用的有GM-CSF, IL-2, IL-12, IFN-y等。在本研究中将结核分枝杆菌中具有高免疫原性的保护性抗原Ag85B、Rv3872、 CFP10, ESAT6以及细胞因子GM-CSF联合引入BCG,旨在构建一个理想的人和动物结核病候选疫苗菌株。主要研究内容和结果如下：1.相关基因克隆与鉴定以MtbH37Rv基因组为模板,PCR扩增Ag85B (A)、Rv3872 (R)、CFP10 (C)以及ESAT6 (E)基因,将其串联成ARCE,克隆至pET32载体,经酶切和测序鉴定正确,然后转化大肠杆菌BL21感受态中,进行诱导表达,证明串联基因能够表达；用实验室制备的兔抗RCE(Rv3872-CFP10-ESAT6)多抗,Western blot分析重组蛋白,证实这些基因均能表达出具有免疫原性的重组蛋白。生工生物工程(上海)有限公司合成GM-CSF(G)基因,将其与Ag85B、Rv3872、CFP10以及ESAT6基因串联,构成GARCE,克隆至pET32载体,经酶切和测序鉴定正确,然后转化大肠杆菌进行诱导表达,证明串联基因能够表达；用实验室制备的兔抗RCE(Rv3872-CFP10-ESAT6)多抗,Western blot分析重组蛋白,证实这些基因均能表达出具有免疫原性的重组蛋白。2.相关质粒的构建和鉴定将GM-CSF(简称G)、Ag85B (A)、Rv3872 (R)、CFP10 (C)以及ESAT6(E)进行串联,各基因之间以连接序列进行连接,并分别克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261和整合载体pTIC6a中,分别构建含GM-CSF和不含GM-CSF的重组质粒,分别命名为：pMV261-GARCE, pMV261-ARCE; pTIC6a-GARCE, pTIC6a-ARCE。酶切鉴定、PCR扩增和测序等方法证实构建正确。3.重组BCG的构建和鉴定通过电转化方法将四种重组质粒分别转化至BCG,用Western blot方法分析引入基因在重组BCG中的表达及其反应原性,结果显示外源基因在BCG中成功表达。进一步检测重组BCG在体外培养的生物学特性,发现重组BCG与亲本BCG具有相似的生长曲线、菌落形态、染色形态。4.重组BCG的小鼠免疫试验一共120只小鼠(Balb/C),分成六组,每组20只,包括四个重组BCG组、1个PBS空白对照、BCG亲本株组。免疫剂量为106CFU,采取皮下接种的方式。每叁周每组处死3只老鼠,观察重组BCG在体内诱导的免疫反应,从体液免疫和细胞免疫两方面评价重组BCG的免疫性。对小鼠血清中的抗体水平进行检测,进行淋巴细胞增殖实验,进行流式细胞实验,检测脾细胞刺激上清液中细胞因子的分泌表达水平。综上所述,本研究成功构建了含有Ag85B、Rv3872、CFP10、ESAT6和GM-CSF基因的四种重组BCG；应用Western blot方法证实重组BCG能表达引入的外源基因；小鼠免疫试验进一步证实,免疫小鼠能产生针对BCG外源蛋白的特异性体液和细胞免疫。 [1]. 结核DNA疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究[D]. 朱中元. 华南热带农业大学. 2004 [2]. 一种肺泡巨噬细胞靶向的多表位结核粘膜疫苗[D]. 吴曼丽. 苏州大学. 2015 [3]. 结核杆菌和布鲁氏杆菌多价DNA疫苗的研究[D]. 余大海. 北京大学. 2008 [4]. 基于卡介苗Prime结核杆菌DNA疫苗Boost免疫策略及其效应研究[D]. 唐权. 东南大学. 2006 [5]. 结核分枝杆菌CFP10基因密码子优化DNA疫苗的构建及免疫效应的评价[D]. 薛玉芹. 蚌埠医学院. 2013 [6]. 中试生产防龋DNA疫苗、结核DNA疫苗效力评价试验[D]. 吴小丽. 武汉生物制品研究所. 2010 [7]. 结核DNA疫苗免疫策略研究进展[J]. 唐权, 陈峻崧, 窦骏. 微生物学免疫学进展. 2005 [8]. 新型结核疫苗p846的保护作用及其机制探讨[D]. 孔红梅. 苏州大学. 2013 [9]. 抗耐药结核多效基因工程疫苗的构建及免疫效果分析[D]. 李晓倩. 遵义医学院. 2017 [10]. GM-CSF-Ag85B-Rv3872-CFP10-ESAT6重组卡介苗的构建与鉴定[D]. 曹德君. 华中农业大学. 2013 标签：生物学论文; 基础医学论文; 特异性论文; 细胞免疫论文; 抗原表位论文; 抗原抗体反应论文; 免疫策略论文; 肺结核论文; 传染病论文; 结核杆菌论文; 问题疫苗论文; 质粒载体论文; dna提取论文; 壳聚糖论文; 巨噬细胞论文; 参考文献：