张家界市疾病预防控制中心 湖南张家界 427000
【摘 要】目的：对甲型HINI流感病毒实时荧光定量PCR快速检测及其临床意义进行探讨分析。方法：选择2017年7月至2018年6月间甲型H1N1流感患者100例作为此次实验检测对象，应用实时荧光定量PCR技术检测患者发病48小时后及恢复期血浆、咽拭子、下呼吸道分泌物中甲型H1N1流感病毒核酸情况。结果：发病后48小时100例患者咽拭子甲型H1N1流感病毒核酸均阳性；40例重症患者中下呼吸道分泌物甲型H1N1流感病毒核酸阳性23例；40例重症患者中血浆甲型H1N1流感病毒核酸阳性15例。结论：实时荧光定量PCR方法能够对甲型H1N1流感病毒感染进行快速检测，作为重症患者的重要标志之一的血浆甲型H1N1流感病毒核酸检测具有一定临床意义。
【关键词】甲型H1N1流感病毒；实时荧光定量PCR；血浆；快速检测
[Abstract] objective：to explore and analyze the rapid detection and clinical significance of real-time fluorescence quantitative PCR for influenza a（HINI）virus. Methods：100 patients with influenza a（H1N1）from July 2017 to June 2018 were selected as the test subjects. Real-time fluorescence quantitative PCR technology was applied to detect the nucleic acid status of influenza a（H1N1）virus in plasma，pharynx swab and lower respiratory tract secretion 48 hours after the onset and recovery period. Results：all the 100 patients with pharyngeal swab a（H1N1）influenza virus nucleic acid were positive 48 hours after onset. In 40 severe cases，there were 23 cases of positive nucleic acid of influenza a（H1N1）virus secretion in the lower respiratory tract. Plasma a（H1N1）virus nucleic acid was positive in 15 severe cases. Conclusion：real-time fluorescence quantitative PCR can be used for rapid detection of influenza a（H1N1）virus infection. As one of the important markers of severe patients，plasma a（H1N1）influenza virus nucleic acid detection has certain clinical significance.
[Key words] a（H1N1）influenza virus；Real-time fluorescence quantitative PCR；Plasma；Rapid detection of
当前实时荧光定量PCR技术广泛应用于甲型H1N1流感病毒核酸检测中，其具有敏感、快速、特异的优势。依据呼吸道病毒侵袭特点，早期病变局部病毒浓度较高，病情进展过程中血液中会侵入病毒，形成毒血症，所以应用实时荧光定量PCR技术对血液中甲型H1N1流感病毒核酸进行检测，有利于病毒血症的临床监测，为医生判断疾病严重程度提供依据[1]。本研究选择甲型H1N1流感患者100例作为检测研究对象，对其开展实时荧光定量PCR检测，现报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选择我市流感监测定点医院2017年7月至2018年6月间收治的甲型H1N1流感患者100例，患者均满足HIN1流感诊断标准，实验室确定咽拭子甲型H1N1流感病毒核酸阳性，其中40例重症患者满足重症与危重病例诊断标准。其中包括女46例、男54例；年龄范围5~43岁，平均（32.2±2.5）岁。
1.2方法
1.2.1采集标准 发病后48小时、恢复期采集患者咽拭子，同时取1ml外周血，加入乙二胺四乙酸二甲抗凝。应用真空吸引术吸取40例重症患者下呼吸道分泌物，同时进行外周血液标本采集。在零下4℃冰箱中保存咽拭子标本，离心血液标本获取血浆，在零下70℃冻存，24小时内检测。
1.2.2实验室检测 选择江苏硕世生物科技股份有限公司提供的双荧光探针、甲型H1N1流感病毒（2009）核酸检测试剂盒。应用磁珠提取法提取下呼吸道分泌物、咽拭子、血浆中核酸。扩增的循环参数：逆转录反应50摄氏度30分钟，预变性95摄氏度5分钟，预扩增1个循环；变性95摄氏度10秒钟，退火、延伸及检测荧光55摄氏度40秒钟，扩增45个循环。FAM和VIC通道为检测通道，前者为H1N1RNA信号，后者为甲型流感病毒RNA信号[2]。
1.3数据处理
应用Microsoft office 2016版Excel软件对本次研究数据进行统计分析，其中计数资料用n或%表示。
2结果
2.1结果判断
Ct>38或无数值样本为阴性，Ct≤35为阳性，35<Ct≦38需重复检测。
2.2发病后48小时甲型H1N1流感病毒RNA阳性率
100例咽拭子标本经实验室确认甲型H1N1流感病毒RNA检测结果全部为阳性，重症患者和轻症患者咽拭子中病毒RNA阳性率对比差异无统计学意义（P>0.05）；下呼吸道分泌物病毒RNA检测结果为阳性的气管插管重症患者23例；100例血浆中结果为阳性15例，全部为重症患者，重症患者阳性率37.5%，与轻症患者血浆病毒RNA阳性率对比差异有统计学意义（P<0.05）。详细数据见下表1。
表1：发病48小时后甲型H1N1流感病毒RNA阳性率[n（%）]
3讨论
甲型H1N1流感为临床常见传染病，对于该型病毒人类缺乏免疫力，在各种因素影响下甲型H1N1流感病毒阳性患者会具有不同的临床表现、预后，对于其病情进行较难预测[3]。实施荧光定量RT-PCR技术当前被广泛应用于基因表达定量检测，其具有敏感度高、程序结束后无需处理等优势[4]。本研究应用该技术检测下呼吸道分泌物、咽拭子、血浆中甲型H1N1流感病毒RNA，并对不同标本病毒RNA检测结构预测病情进行探讨，结果显示甲型H1N1流感重症、病情进展的重要指征之一就是血浆中病毒RNA阳性。
实时荧光定量RT-PCR检测显示，发病后48小时、恢复期轻症患者血浆中病毒RNA均为阴性，而重症患者发病后48小时血浆病毒RNA具有37.5%阳性率，恢复期阳性有2例。通常情况下流感病毒在血浆中很少能检测到，提示甲型H1N1流感的重症及预后差重要标志包括血浆中H1N1病毒RNA阳性[5]。临床研究认为，可通过甲型H1N1流感患者康复后血浆输注对重症甲型H1N1流感感染者进行治疗，但需检测供体血浆H1N1核酸，以保证生物安全[6]。
综上所述，实时荧光定量PCR方法能够对甲型H1N1流感病毒感染进行快速检测，重症患者的重要标志之一就是血浆中甲型H1N1流感病毒核酸阳性。
参考文献：
[1]张烜榕，赵曰水，侯敏.昆明市2009～2010年甲型H1N1流感病毒网络实验室的监测结果分析[J].现代预防医学，2017，39（21）：5529-5531.
[2]卢桂兰，彭晓旻，梁慧洁.儿童甲型H1N1流感和季节性流感患者的病毒载量及相关临床症状研究[J].国际病毒学杂志，2016，18（02）：36-40.
[3]杨成林.荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的对比分析[J].中国保健营养（下旬刊），2016，22（01）：32-33.
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[5]张弘，何永强，张严峻.单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别新甲型H1N1及甲型和乙型流行性感冒病毒[J].中华预防医学杂志，2017，46（03）：273-276.
[6]张洪英，祈贤，杜雪飞.甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测法的建立及其在南京地区甲流防控早期的应用[J].现代预防医学，2015，38（01）：131-134.
论文作者:胡俊忠,陈波,龚育平,张淳轶
论文发表刊物:《兰大学报（医学版）》2018年5期
论文发表时间:2018/9/20
标签：流感论文; 病毒论文; 甲型论文; 血浆论文; 患者论文; 荧光论文; 核酸论文; 《兰大学报（医学版）》2018年5期论文;