（ 1华中科技大学同济医学院博士后流动站；湖北武汉 430022；
2湖北省鄂州市中医医院；湖北鄂州436000；
3华中科技大学同济医学院附属协和医院 ；湖北武汉430022）
摘要：目的：观察补气通络解毒方对胰腺癌小鼠模型HIC1、SIRT1基因的影响。方法：将30只裸鼠随机分为三组，每组10只，采用癌细胞皮下种植法造模，造模成功后，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，治疗组给予补气通络解毒方灌胃，连续14天；治疗结束后，处死裸鼠，取出瘤组织，以免疫组化法检测各组标本的HIC1、SIRT1基因的表达情况。结果：在HIC1基因表达方面；治疗组阳性细胞数及灰度值明显高于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然低于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）；在SIRT1基因表达方面：治疗组阳性细胞数及灰度值明显低于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然高于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论：补气通络解毒方通过上调模型小鼠HIC1基因表达、及下调SIRT1基因表达，从而使HIC1/ SIRT1信号通路恢复平衡，发挥治疗胰腺癌的微观分子生物学效应。
关键词：补气通络解毒方；胰腺癌；HIC1/SIRT1基因
胰腺癌有“癌中之王”的称谓，是恶性程度较高的肿瘤之一,目前缺乏有效治疗手段；笔者师从邱幸凡教授多年，根据邱师关于“脏虚络痹毒结”的肿瘤发病机制[1]，结合临床，自拟补气通络解毒方治疗胰腺癌,取得了良好的临床疗效[2],为了进一步探索该方产生疗效的分子生物学机制,本人应用补气通络解毒方作用于胰腺癌模型小鼠,观察其对HIC1/SIRT1基因表达的影响，为该方治疗胰腺癌提供实验依据。
1.材料与造模
1.1.实验动物
SPF级雄性裸小鼠（BALB/C）30只，6-8周龄，体重20±2g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；按SPF级动物实验要求进行饲养及管理。
1.2.细胞株： 人胰腺癌细胞系SUIT-2，由中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所提供。
1.3.细胞培养及处理 人胰腺癌细胞系SUIT-2复苏后,加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液,置于37℃,5%CO2,饱和湿度的CO2培养箱中培养。
1.4动物模型的建立
实验前观察1周,若裸小鼠生长正常(死亡率不超过10%),即分别于造模组裸小鼠左后腿外侧皮内注射SUIT-2细胞1×106个,建立移植瘤模型,而正常组（10只）则于左后腿外铡皮内注射同体积生理盐水?造模成功后将造模组随机分为模型组和治疗组、每组10只。
1．5. 药物及制备
补气通络解毒方（人参5g、黄芪30g、枳壳10g、川芎15g、地龙10g、柴胡8g、蜈蚣3g、莪术15g、龙葵15g、炙甘草6g等）均按人与实验动物体表面积折算法算得小鼠等效剂量为每公斤体重60g生药。用5倍于药材的冷水浸泡20分钟，然后用武火煎至水沸，改用文火煎煮40分钟，滤出药液加冷水适量，煎至水沸，改用文煎煮30分钟，滤出药渣，将两次煎取药液混匀浓缩成每毫升含生药2g的药液，药液置于冰箱0-4℃保存。
1．6给药剂量与方法
正常组：按3ml/100g体重给予生理盐水灌胃，每日1次，连续14天。
对照组：移植癌细胞后，待移植瘤肉眼可见时，按3ml/100g体重给予生理盐水灌胃，每日1次，连续14天。
治疗组：移植癌细胞后，待移植瘤肉眼可见时，按3ml/100g体重给予补气通络解毒方灌胃，每日1次，连续14天。
1.7 取材
治疗结束后，颈椎脱臼法处死小鼠,并用酒精消毒操作部位皮肤，置于超净工作台（事先以紫外线灯消毒30min），以无菌操作剥取肿瘤结节，剔除纤维包膜和坏死组织（正常组取胰腺组织），-20℃冰箱中保存。
1.8 统计学分析
实验结果均以X±s表示，计量资料多组间差异性比较采用方差分析(one way ANOVA),计数资料采用卡方检验，使用spss10.0软件包进行数据处理，以P＜0.05为显著性标准。
1.9 仪器试剂
切片机 RM2016 上海徕卡仪器有限公司
冻台 JB-L5 武汉俊杰电子有限公司
脱水机 JJ-12J 武汉俊杰电子有限公司
生物显微镜 OLYMPUS CX31 RTSF 日本
医学图象分析系统 AsBImageSys 成都遨生电子有限公司
通用型免疫组化试剂盒（SABC法） 批号K5007 DAKO公司
HIC1、SIRT1一抗 批号 K5007 DAKO公司
DAB显色试剂盒 批号20071223 武汉博士德生物工程有限公司
电子天平 FC204型 上海精科实业有限公司
医用冷藏箱 YC-300L 中科美菱
2．实验方法
2．1标本制备
将各组标本取出部分置于4%多聚甲醛中,固定3h后，依次放入15%、20%、30%蔗糖PBS液中固定,至组织下沉后冻台做冰冻切片。
2．2 HIC1、SIRT1免疫组化
（1）0.1MPBS(PH=7.2,下同)冲洗5min×3次
（2）切片入1%H2O2,室温10 min
（3）0.1MPBS冲洗5min×3次
（4）切片置于0.1M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)中作抗原热修复15-20 min
（5）0.1MPBS冲洗5min×3次
（6）牛血清封闭,37℃30min
（7）0.1MPBS冲洗5min×3次
（8）切片加入β-内啡肽一抗, 37℃24h
（9）0.1MPBS冲洗5min×3次
（10）加入二抗工作液37℃30min
（11）0.1MPBS冲洗5min×3次
（12） DAB显色
（13）自来水充分冲洗
（14）酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片
2．3图像分析
用 AsBImageSys医学图象分析系统进行分析。测量各标本HIC1、SIRT1阳性基因的光密度和颗粒面积。为保证所测结果的准确性，所选待测的切片平面基本一致。每只小鼠取2张切片，每组共测10张切片，每张切片均测3个视野，3个视野所测光密度或面积之和为一个统计样本。为了使其结果更准确，采用图像分析仪对不同组别HIC1、SIRT1阳性基因的光密度和颗粒面积进行定量分析。
3．结果：见下表
4．讨论
HIC1（hypermethylated in cancer 1，肿瘤高甲基化基因1）基因的主要编码产物为714个氨基酸的蛋白质，参与基因的转录调控。一般分为三个功能区域，分别是N末端约120个氨基酸残基的BTB/POZ (Broad complex, Tramtrack andBric à brac/Poxviruses and Zinc finger)域，参与蛋白质之间的寡聚化，同时也是一个自发转录抑制域，可以和SIRT1蛋白结合抑制SIRT1基因的转录[3]。
哺乳动物SIRT1（silenced information regulator，沉默信息调节因子）是酵母菌沉默信息调节因子（silenced information regulator，Sir2）的类似物，属于NAD+ 依赖性III型组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases， HDAC）[5]。SIRT1含有275个氨基酸构成的保守催化结构域，可以对组蛋白或非组蛋白特定部位进行去乙酰化修饰，改变靶蛋白功能活性。
SIRT1在前列腺癌[6]、急性白血病[7]、结肠癌[8]、非黑色素瘤皮肤癌[9]等多种肿瘤中均存在异常高表达。Chen WY 研究显示HIC1可以和SIRT1形成复合物，与SIRT1启动子结合，抑制其转录[4]；故HIC1与SIRT1之间构成了一条信号转导通路，在恶性肿瘤的发病过程中扮演重要角色。
笔者根据导师邱幸凡教授关于恶性肿瘤的“脏虚络痹毒结”的中医病机认识，自拟补气通络解毒方，方中人参味甘、微苦，微温，能大补元气，补脾益肺，为君药。黄芪味甘，性微温，为臣药，能补气生阳、益卫固表，能增强人参的补气功效，为臣药。柴胡及枳壳味辛、性温，有行气之功效；川芎、莪术味辛性温，有活血化瘀之功，故为佐药；地龙及蜈蚣辛温，能搜邪剔络，无血者走气，有血者走血，灵活迅速，《临证指南医案》：“凡虫蚁皆攻。无血者走气，有血者走血，飞者升，地行者降……”。与柴胡、枳壳、川芎、莪术配伍能引药入气络及血络，从而达到宣通络脉的功效，故为使药；龙葵性寒，味苦，微甘，具有小毒，有清热解毒之功，亦为佐药，炙甘草味甘、性微温，有调和诸药之功，故佐使药。全方合用，共奏补气通络、解毒消瘤之功。
研究结果显示：在HIC1基因表达方面，模型组最低，而正常组最高，正常组阳性细胞数及灰度值明显高于模型组，二者之间有极显著性差异，P＜0.01，而治疗组阳性细胞数及灰度值明显高于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然低于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）；说明胰腺癌细胞中HIC1基因表达升高，经补气通络解毒方治疗后，HIC1基因表达下调，但仍没有恢复到正常水平。在SIRT1基因表达方面，模型组最高，而正常组最低，正常组阳性细胞数及灰度值明显低于模型组，二者之间有极显著性差异，P＜0.01，而治疗组阳性细胞数及灰度值明显低于模型组，二者有极显著性差异，P＜0.01，但仍然高于正常组，与正常组比较有显著性差异（P＜0.05）；说明胰腺癌细胞中SIRT1基因表达升高，经补气通络解毒方治疗后，SIRT1基因表达下调，但仍没有恢复到正常水平。综合以上数据分析，我们可以推论出：补气通络解毒方通过上调模型小鼠HIC1基因表达、及下调SIRT1基因表达，从而使HIC1/ SIRT1信号通路恢复平衡，这可能是其治疗胰腺癌的微观分子生物学机制之一。
参考文献
1.倪亚、邱幸凡.补肺通络解毒法治疗肺癌的思路探讨[J].光明中医.2009，24（8）：1459-1460。
2.胡波、周贞迪、邱幸凡等.补气通络解毒方配合GEMOX方案治疗中晚期胰腺癌60例临床观察[J].北京中医药，2010.29(10):770-772。
3.Norman J. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. American Journal of Surgery. 1998;175(1):76–83.
4.Huffman DM, Grizzle WE, Bamman MM, Kim JS, Eltoum IA, Elgavish A, Nagy TR. SIRT1 is significantly elevated in mouse and human prostate cancer. Cancer Res. 2007; 67(14): 6612-8.
5.Bradbury CA, Khanim FL, Hayden R, Bunce CM, White DA, Drayson MT, Craddock C, Turner BM. Histone deacetylases in acute myeloid leukaemia show a distinctive pattern of expression that changes selectively in response to deacetylase inhibitors. Leukemia. 2005; 19(10): 1751-9.
6.Stünkel W, Peh BK, Tan YC, Nayagam VM, Wang X, Salto-Tellez M, Ni B, Entzeroth M, Wood J. Function of the SIRT1 protein deacetylase in cancer. Biotechnol J. 2007; 2(11): 1360-8.
7.Hida Y, Kubo Y, Murao K, Arase S. Strong expression of a longevity- related protein, SIRT1, in Bowen's disease. Arch Dermatol Res. 2007; 299(2): 103-6.
8.Ota H, Tokunaga E, Chang K, Hikasa M, Iijima K, Eto M, Kozaki K, Akishita M, Ouchi Y, Kaneki M. Sirt1 inhibitor, Sirtinol, induces senescence-like growth arrest with attenuated Ras-MAPK signaling in human cancer cells. Oncogene. 2006; 25(2): 176-85.
9.Norman J. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. American Journal of Surgery. 1998;175(1):76–83.
论文作者:胡波1 2 王春友3
论文发表刊物:《医师在线》2016年8月第16期
论文发表时间:2016/10/26
标签：补气论文; 基因论文; 小鼠论文; 模型论文; 阳性论文; 胰腺癌论文; 切片论文; 《医师在线》2016年8月第16期论文;