【摘要】目的：探讨PCR检测人乳头瘤病毒的方法及注意事项。方法：对38例宫颈分泌物进行检测分析。结果：38例受检宫颈分泌物检测，其中检测出HPV阳性34例，其中低危亚型10株，高危亚型24株。其中高危亚型HPV16型16例，HPV18型2例，HPV33型2例，HPV58型2例，HPV52型1例，HPV66型1例。低危亚型主要以HPV6和HPV11型为主。结论：PCR技术操作简便、出结果快、灵敏度高及特异性强，已广泛用于生命科学的各个领域，在卫生检验中主要用于病原体的快速检验或不易培养的微生物的检测。
【关键词】PCR检测；人乳头瘤病毒；注意事项
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）12-0229-02
人乳头瘤病毒有多种型别，可感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，诱发细胞增生，产生乳头瘤样病变，其中生殖道感染较为常见，除可能与口腔和生殖道癌症有关外，它所引起的尖锐湿疣是一种常见的性传播疾病，近年来发病率有明显增高，仅次于淋病，因此对该类病毒的早期诊断既有利于性病的预防又有助于某些癌症的发生[1]。现应用聚合酶链反应（PCR）对人人乳头瘤病毒（HPV）感染的方法及检测注意事项进行分析。
1.材料与方法
1.1 病列来源
对2015年在我所体检的颖有HPV感染的子宫颈分泌物38例进行检测。年龄16～71岁，平均年龄42岁。
1.2 标本采集
使用扩阴器，先用棉拭子将多余宫颈分泌物擦去，再用一支棉拭子拭擦宫颈糜烂处，取出时不应碰阴道壁，放入盛1ml无菌生理盐水的洁净试管中，加盖送检。
1.3 方法
1.3.1模板的制备 用无菌生理盐水润湿的棉签取阴道或宫颈部位的分泌物，将标本洗入生理盐水后，10000r/min离心5min，沉淀用30μl适当裂解液重悬，保温后细胞裂解释放出DNA，离心取上清液5μl作为模板。
1.3.2 PCR反应体系与反应参数 常用通用引物PL11-PL12扩增出450bp的特异性片段，可检出40多种人乳头瘤病毒。PL11：5′-CGTC-CAAGAGGAAACTGATC-3′。PL12：5′-GCACAGGGA-CATAATAATGG-3′。在反应体系中，除模板、引物、dNTPs和TaqD- NA聚合酶外，还需加入0.01%明胶和0.1%TritonX-100，以提高反应的特异性和产量。经94℃ 3min预变性后，94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min；循环35次后，最后72℃延长7min，得到PCR产物。
1.3.3 PCR产物的检测 使用1.5%琼脂糖或5%～8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙啶染色后，紫外灯下观察结果，出现450bp的扩增产物为检出阳性；如有必要，可用标记的寡核苷酸探针作Southern迹，以对该病毒进行分型。11亚型病毒常诱发生殖道湿疣和宫颈发育不良，而16，18，33型可能与口腔生殖道癌症有关。
2.结果
38例受检宫颈分泌物检测，其中检测出HPV阳性34例，其中低危亚型10株，高危亚型24株。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆其中高危亚型HPV16型16例，HPV18型2例，HPV33型2例，HPV58型2例，HPV52型1例，HPV66型1例。低危亚型主要以HPV6和HPV11型为主。
3.讨论
人生殖道HPV感染较为常见，不同型HPV引起的感染具有不同的临床表现。其中低危组(HPV6.11)多诱发良性湿疣，高危组(HPV16.18)病毒通常整合到宿至基因组中，可启动癌基因，从而导致恶性肿瘤。因此，检测组织损害部位中是否存在HPV显得非常重要。迄今HPV难于病毒培养及血清学检测，实验诊断主要靠核酸探针分子杂交。近年发展起来的实时荧光PCR技术，已结合了探针杂交的特异性，又具有较高的灵敏性，且可快速分型，为HPV的检测提供新的方法。临床常用于区分良性与恶性皮损，并可早期诊断亚临床感染。
PCR反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性，酶的质量及PCR循环条件等。只有兼顾各因素，才能确保稳定的结果。在实验中通过设置阳性对照以兼控实验各因素，如阳性对照正常，应考虑模板中是否含有较多杂蛋白或者有酚等Taq酶抑制剂，或靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合[2]。如阳性对照带不清楚或未出现，则应考虑：①是否因酶的活性丧失或不够；②两条引物设计是否合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等；③是否因多次冻融或长期存放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④是否因引物的浓度不对称造成低效率的不对称扩增；⑤是否因Mg2+浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带；⑥变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；⑦退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；⑧应及时检测PCR产物，一般于48h以内，有些最好于当日电泳检测；⑨是否忘加Taq酶或溴化乙啶。
在PCR中常常出现非特异性扩增带，即扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。其原因是：①引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体，故应考虑引物设计的改进或降低引物量；②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多，可考虑适当提高退火温度、减少循环次数及优化Mg2+离子浓度；③酶的质和量，常因某厂的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增，故应注意减低酶量或调换另一来源的酶；④靶序列或扩增产物的交叉污染。
注意污染的监测应设有PCR阳性对照。它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志；而且每次PCR实验务必做阴性对照，它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照，被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照，②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。防止污染的做到：①合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及 PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开[3]。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。②分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及 PER产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。③防加样枪引起污染：加样枪污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因此加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢并尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。④选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管时动作要轻，以防管内液体溅出。总之由于PCR技术的高灵敏性，对于污染的控制显得尤为重要。
【参考文献】
[1]刘欣，刘国炳，庞战军，邢福祺，郭遂群.PCR直接测序法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒DNA[J].南方医科大学学报.2005. 25(2):201-203.
[2]余剑敏，沈智君.第二代杂交捕获法与多重荧光PCR在检测高危型人乳头瘤病毒中的应用比较[J].检验医学.2008. 23(5):484-487.
[3]胥文.实时荧光PCR在人乳头瘤病毒临床检测中的应用[J].中国当代医药.2013. 20(7):76-77.
论文作者:任启智
论文发表刊物:《心理医生》2016年12期
论文发表时间:2016/9/16
标签：引物论文; 特异性论文; 病毒论文; 产物论文; 阳性论文; 模板论文; 分泌物论文; 《心理医生》2016年12期论文;