李慧[1]2006年在《银白杨再生体系建立及rolB-pttGA20ox双价基因遗传转化促进生根和高生长的研究》文中指出银白杨(Populus alba)是我国西北地区重要的速生造林树种,其材质优良,抗逆性强,但扦插繁殖不易生根,生长速度也比其他白杨慢,在很大程度上限制了这一优良树种的推广与应用。本研究的主要目标是通过农杆菌介导的遗传转化方法导入rolB-pttGA20ox双价基因,利用基因工程技术开展改良生根性状的转基因研究,从而培育扦插生根能力强、生长快的银白杨新品种。围绕这一目标,本研究以银白杨当年生枝条的带芽茎段为外植体,首先建立了该树种的离体快繁及植株再生体系,并就培养条件和植物生长调节剂等因素对银白杨叶片直接再生体系的影响进行了详细的研究;然后利用NPTⅡ筛选基因对影响根癌农杆菌介导银白杨遗传转化的条件做了深入探索,通过优化转化条件,建立了银白杨遗传转化体系;最后在此基础上,进行rolB-pttGA20ox双价基因的转化,并由PCR、Southern杂交和形态特征差异检测,以证明是否为转化植株。主要研究结果如下:1.茎段再生不定芽体系的建立。消毒的最佳方法为:70%的酒精浸泡30s+1%NaClO灭菌15min～35min。启动培养基最佳组合为MS + 6-BA0.5mg/L +NAA0.1mg/L ,启动率达到了74.1 %。MS + 6-BA1.0mg/L + NAA0.3mg/L +KT0.2mg/L+IBA0.4mg/L为增殖培养的最佳配方,增殖系数可达8.3以上。生根培养的最适培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖15g/L+琼脂6g/L,生根率达到100%。移栽炼苗以蛭石作为最佳基质,移栽成活率达90.2%以上。2.叶片再生不定芽的研究。叶片不定芽诱导的最适培养基是MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.5%+琼脂0.55%,pH5.8,不定芽再生率达95%以上;叶片不定芽再生能力强的最佳取材位置是自试管苗顶端向下伸展叶的第1~3片叶;生根试管植株叶片的不定芽再生能力强于无根试管植株。3.玻璃苗产生机理的研究。与正常苗相比,玻璃苗的叶片和茎段横切面结构发生了很大变化;玻璃苗组织含水量增加;叶绿素含量、可溶性蛋白含量、相对电导率、MDA和RNA含量降低;SOD、CAT活性和DNA含量变化不大;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质进行分析,发现电泳谱带均出现增加、缺失等异常现象。
郭海[2]2004年在《毛白杨再生体系建立和rolB基因遗传转化技术》文中研究说明为解决毛白杨插条生根难的问题，本文通过组织培养实验，在毛白杨离体培养再生技术体系建立的基础上，采用农杆菌介导法，将对植物生根起促进作用的rolB基因导入毛白杨。主要研究内容及结果如下： 1．对带有3-6片叶的根萌芽外植体在75％酒精浸泡30s后，用1％“84”消毒液进行5min体表灭菌处理，得无菌苗且成活率可达100％。毛白杨根萌芽适合启动培养基为：MS+6-BA(0.5mg／L)+NAA(0.1mg／L)+白砂糖3％+琼脂0.52％，pH值6.0：适宜的继代培养基为：MS+6-BA(0.3mg／L)+NAA(0.1mg／L)+白砂糖3％+琼脂0.52％，pH值6.0；适宜的生根培养基为：MS+白砂糖3％+琼脂0.52％，pH值6.0。 2．适合毛白杨叶片不定芽分化培养基为：MS+6-BA(2.0mg／L)+NAA(0.1mg／L)+白砂糖3％+琼脂0.52％，pH值6.0；MS基本培养基添加6-BA和NAA的比例在2-5：1之间时，可以诱导大量不定根的形成。不同无性系再生频率差别很大，本实验中G2和G3的再生频率高；暗培养2d时对叶片分化不定芽的再生频率略有提高；与培养皿培养相比较，叁角瓶培养不定芽再生率较高。 3．毛白杨对不同抗生素的敏感性不同，通过抗生索敏感性试验，确立了叶片外植体不定芽诱导、茎段增殖和生根Kan的临界耐受浓度分别为30mg／L和50mg／L。毛白杨叶片对Cef的敏感性较差，结合Cef对农杆菌的抑菌效果，在遗传转化和再生、扩繁、生根时都选择200-400mg／L浓度加入为宜。 4．通过对影响农杆菌转化效率的几个主要因素的研究，得出适合毛白杨遗传转化的方法和步骤。选择2d的预培养时间，用OD_(600)=0.4浓度的菌液侵染10min，添加乙酰丁香酮，2d的推迟筛选都可以提高转化频率。 5．转化植株在含抗生素培养基上的筛选和再生分化不定芽成功，以及PCR检测初步显示外源基因已经整合到毛白杨基因组中。最后将组培苗和经过遗传转化的毛白杨试管苗移栽成活。
梁机[3]2004年在《转rolB基因改良毛白杨生根能力的研究》文中进行了进一步梳理毛白杨具有速生丰产、材质优良等优点,是我国北方地区一个重要的建筑、家具用材和纸浆纤维工业原料树种。但与大多数其他杨树不同,毛白杨扦插繁殖不易生根,成苗率极低,育苗成本高,严重阻碍了以无性繁殖技术对这一优良树种进行繁殖与推广应用。因此,改良其生根性状,提高硬枝扦插生根能力已成为毛白杨遗传改良的重要研究课题。本文以普通毛白杨为研究对象,通过对离体叶片再生条件、抗生素筛选条件以及根癌农杆菌介导毛白杨遗传转化条件的优化,建立了高效离体再生系统和遗传转化体系,并将rolB诱根基因导入毛白杨,对转化再生植株进行了分子检测及离体生根能力的初步研究,主要研究内容及结果如下: 1.利用限制性内切酶EcoRⅠ将GH3启动子-rolB基因-nos终止子表达框架从质粒载体pUC-GH3-rolB-nos中切下,克隆到具有卡那霉素抗性基因的双元质粒pBin19中,构建了植物表达载体pBinGH3rolBnos,并通过液氮冻融法将其导入农杆菌LBA4404,用于毛白杨的遗传转化试验。 2.利用正交试验设计进行了叶片外植体高效再生系统建立的研究,筛选出毛白杨叶片分化不定芽的适宜培养基为:MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.3mg/L+NAA0.3mg/L。并以此最佳不定芽诱导培养基为基本培养基配方,比较了六个不同无性系分化能力的差异,研究了同一植株不同叶位的叶片、不同外植体类型对再生能力的影响,结果表明,不同基因型其叶片再生能力差异显着,6个供试无性系中,以L5和L2再生能力最强,叶片再生率分别达98.3%和91.7%。叶片、茎段和根段叁种外植体类型的再生频率大小顺序依次为叶片(95.1%)>茎段(66.3%)>根段(61.5%)。 3.通过卡那霉素敏感性试验,确定了叶片外植体不定芽诱导卡那霉素临界耐受浓度为20mg/L,试管苗不定根再生临界敏感浓度是25mg/L。同时研究了头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Cb)对毛白杨叶片芽诱导及试管苗再生不定根的影响及对农杆菌的抑菌效果,发现两种脱菌剂浓度超过400mg/L时对叶片外植体不定芽和试管苗不定根的诱导有抑制作用,且随着浓度升高抑制程度加大。抑菌试验表明,Cef对LBA4404和C58C1菌株的抑菌效果比Cb好,适宜的脱菌浓度为200～400mg/L。 4.对影响农杆菌转化效率几个主要因素进行的研究发现,毛白杨叶片外植体在农杆菌浸染前预培养2d,感染后共培养2～4d可获得较好的转化效果;在共培养基中附加200μM的乙酰丁香酮,可以使LBA4404和C58C1两个菌株的转化率分别提高3.13和7.5个百分点。胭脂碱型C58菌株介导基因转移能力明显高于章鱼碱型LBA4404株系。 5.分别将含质粒pBinGH3rolBnos的农杆菌LBA4404和含pCMB-B:GUS质粒的农杆菌C58C1与毛白杨叶片共培养,通过在30mg/L和50mg/L卡那霉素的培养基上
苏彦苹[4]2007年在《rolB、rolC基因对转Ri质粒叁倍体毛白杨的转化》文中指出Ri质粒上含有诱根基因即rol基因，将Ri质粒或单个或几个rol基因组合导入植物体内均能提高植物的生根能力，但是某些植物在转入rol基因后往往会使植株表现出一些不良的变异，如出现了植株矮化、叶面皱缩、节间缩短、分支能力增强等性状，对植物的生长发育产生很大的影响。为减少rol基因对植物造成的不良变异，本文以刘兴菊研究的转Ri质粒30148菌株的叁倍体毛白杨3个无性系为研究对象，通过对叶片再生体系和遗传转化条件的优化，建立了高效离体再生系统和遗传转化体系，并将rolB、rolC诱根基因导入转Ri质粒的叁倍体毛白杨，对部分转化再生植株进行了形态鉴定、PCR检测和GUS组织化学染色检测，并对转化植株形态及生长变异和叶片解剖结构进行了初步研究，主要研究内容及结果如下：1．进行了叶片外殖体高效再生系统的研究，筛选出转Ri质粒的叁倍体毛白杨叶片诱导不定芽的适宜培养基为：MS+6-BA1.0mg．L~(-1)+NAA0.05mg．L~(-1)，诱导不定根的适宜培养基为：MS+NAA0.1mg．L~(-1)。并以此种诱导不定芽的适宜培养基，研究了暗培养对诱导叶片不定芽的影响，结果表明，暗培养5d对不定芽诱导是有利的。2．通过卡那霉素(Km)敏感性试验，确定了诱导叶片外殖体不定芽的Km临界耐受浓度为30mg．L~(-1)。同时研究了头孢噻肟钠(CTX)对诱导转Ri质粒的叁倍体毛白杨叶片不定芽的影响和对农杆菌的抑菌效果，结果表明，CTX适宜的抑菌浓度为400mg．L~(-1)。3．对影响农杆菌转化效率的几个主要因素进行研究发现，转Ri质粒的叁倍体毛白杨叶片外殖体适宜的侵菌时间是8min，侵染后共培养2d可获得较好的转化效果。4．分别将含质粒pCMB-B∶GUS和pPCV002-CaMVC的农杆菌与转Ri质粒的叁倍体毛白杨叶片共培养，通过在50mg．L~(-1)Km的培养基上筛选后，获得了Km抗性植株，对部分抗性植株进行了PCR检测，证明rolB、rolC基因已整合到转Ri质粒叁倍体毛白杨的基因组中，对部分PCR检测呈阳性的pCMB-B∶GUS转基因无性系进行组织化学染色分析表明，GUS基因主要在根尖、茎及叶脉维管束组织中特异表达。5．进行了转基因植株形态及生长变异的研究，发现与转Ri质粒叁倍体毛白杨相比，大部分转rolB基因无性系植株矮化，叶面积增加，茎分支能力增强，节间距缩短，生根率及根数量降低，高生长量减少；大部分转rolC基因无性系叶面由原来的皱缩变为平展，茎分支能力增强，节间距缩短明显，生根率、根数量及高生长量增加。6．对转基因植株叶片解剖结构及组织厚度进行了观察，结果表明，转基因无性系叶片解剖结构变化不明显。大部分转rolB基因无性系叶片厚度、叶肉厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异显着，栅栏组织和海绵组织厚度差异不显着，50％的转rolB基因无性系的表皮厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异显着。大部份转rolC基因无性系叶片厚度、叶肉厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异不显着。转Ri质粒不同无性系在转rolC基因后，栅栏组织厚度变异程度不同，75％的转rolC基因无性系海绵组织厚度与其转Ri质粒无性系对照有显着差异。转rolC基因无性系的表皮厚度与其转Ri质粒无性系对照无显着差异。
丁霞[5]2006年在《胡杨再生体系的建立及rolB-pttGA20ox基因的遗传转化研究》文中认为本研究以胡杨当年生枝条的带芽茎段为外植体,首先建立了它的离体快繁及植株再生体系,并就植物生长调节剂等因素对胡杨叶片再生不定芽的影响进行了详细的研究;然后利用NPTⅡ筛选基因对影响根癌农杆菌介导胡杨遗传转化的条件进行了深入探索,通过优化转化条件,建立了胡杨遗传转化系统;最后在此基础上,进行rolB-pttGA20ox双价基因的转化,并由PCR、PCR-Southern杂交分子检测,验证rolB-pttGA20ox基因的插入情况。研究结果摘要如下:1.胡杨组培再生体系的建立消毒的最佳方法为:夏季采集的材料: 70%的酒精浸泡30sec后,以0.1%氯化汞分别灭菌7min、8min;初春水培枝条:试剂同上,茎尖灭菌0.5min,茎段灭菌1.0min。最适宜的启动培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L,MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+糖20 g/L为增殖培养的最佳配方,生根培养的最适培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L+糖25g/L+琼脂6g/L+AC 0.2 g/L,生根率达到81%。移栽炼苗以蛭石:珍珠岩(2:1)或者沙子:土壤(1:1)作为最佳基质。2.在组培中黄化现象产生的规律以及避免的方法在一个继代周期内,随着时间的推移,试管苗的黄化率越来越高,整体呈现线性上升的趋势;经生理生化指标研究发现,当继代时间超过20d后,叶绿素含量尤其以叶绿素a的降幅较大,建议可以接种20d为一个继代周期;ABA为IAA、ZR的拮抗物,它的消长过程大体上与生长过程是相反的;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质进行分析,发现黄化试管苗电泳谱带均出现缺失等异常现象。这说明黄化苗在基因表达调控上出现差异,其内部机制可能已发生变化。研究影响胡杨黄化率的培养条件因子发现:培养基的pH值在6.0～7.0之间、昼夜变温处理、不同波段的光质中以蓝光对降低胡杨黄化率有较好效果。3.胡杨遗传转化体系的建立胡杨叶片再生的最适培养基是MS+BA0.5mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+腺嘌呤40mg/L+水解乳蛋白500mg/L +白砂糖25g/L+琼脂6.0g/L,再生频率达100%;叶片培养的最佳取材位置是自茎尖展叶始第1～3片叶;叶片正面向上或正面向下接种培养,对其
辛蓓[6]2009年在《rolB-pttGA20ox双价基因转化毛白杨及遗传稳定性研究》文中指出毛白杨(Populus tomentosa Carr.)是我国特有的优良白杨派乡土树种,具有材质优良、寿命长、抗性和适应性强等特点,是我国北方地区常用的建筑、家具用材和造纸工业原料树种,对美化环境和保持水土也有重要作用。但毛白杨的插条生根较难、扦插成活率低,在很大程度上阻碍了这一优良树种的推广和产业化进程。本研究通过农杆菌介导的叶盘转化方法,将双价基因rolB-pttGA20ox转入毛白杨优良无性系PT-16和PT-19基因组中,开展利用基因工程育种技术改良生根和高生长性状的研究;并以转rolB-pttGA20ox双价基因烟草为试材,探讨了双价外源基因在转化植株中的表达稳定性和遗传特性。主要研究结果如下:1、优化了农杆菌介导的毛白杨遗传转化体系。首先确定毛白杨PT-16和PT-19叶片外植体不定芽诱导卡那霉素(Kan)临界耐受浓度为25 mg/L,试管苗不定根再生Kan临界敏感浓度为20 mg/L。高效的毛白杨叶盘转化方法为:叶盘预培养2d→含有200μmol/L AS的分化培养基(pH为5.0)接触培养4 h→OD_(600)=0.3～0.4的农杆菌菌液侵染25 min→含200μmol/L AS的共培养培养基(pH为5.0,不含CoCl_2·6H_2O)5 d→延迟选择培养3 d。在此优化的转化体系下,Kan~r芽再生率可达16%。胭脂碱型C58菌株介导基因转化毛白杨的能力明显高于章鱼碱型LBA4404菌株。2、转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨的获得及分子检测。采用优化的农杆菌介导叶盘转化方法再生的Kan~r芽,经含有30 mg/L Kan的生根培养基和叶片分化培养基筛选,获得了29株初步判定已导入外源基因的转化植株。进行PCR检测阳性率为65.52%;Southern杂交证明外源基因已插入毛白杨基因组中,且均为单拷贝形式整合。进一步通过RT-PCR初步证明了外源基因在转化植株各器官中的表达,rolB基因具有特异性,表达强弱顺序为根＞茎＞叶;pttGA20ox基因在各器官中的表达丰度一致。3、鉴定了目的基因在转基因毛白杨中的表达特性。转化植株的组织细胞表现出对生长素的高敏感性,在低浓度生长素条件下表现出明显高于对照的生根能力。外源生长素的短时间诱导即可调控rolB基因的表达丰度;而pttGA20ox未受到外源生长素的诱导。转化植株各部位的GA_3、IAA和ZR叁种内源激素含量与对照差异明显。4、转基因毛白杨的形态表现出rolB和pttGA20ox两个基因所具有的功能特征。移栽温室4个月时,转化植株的生根状况明显优于对照,表现为侧根发达、毛状根众多,茎基部始生根位置上升约4cm,整个根系的根数多到难于统计,主根平均长度为43.3 cm,比对照长12.7 cm;转化植株的平均株高达到对照的2.18倍。5、以转rolB-pttGA20ox双价基因烟草为材料,验证了目的基因的稳定表达。内源激素和生长量测定表明rolB-pttGA20ox双价基因在转化植株体内能够稳定存在和表达,没有受到移栽或其他环境改变的影响而诱发基因沉默等现象。6、证实了rolB-pttGA20ox双价基因在转化植株中的遗传稳定性。随机选取90株播种生长的T_1代转基因烟草,PCR显示其中62株能够扩增出rolB和pttGA20ox两个基因的特异条带,说明外源基因能够在转化植株中稳定遗传;进一步进行x~2检测证明外源基因的分离符合3:1的孟德尔式遗传分离比率,推测其是以单位点插入转化烟草基因组中的。生长指标和内源激素含量的动态测定结果均表明双价基因在T_1代转化植株中得到了表达。
李好先[7]2013年在《核桃遗传转化体系的建立及rolB基因的导入》文中进行了进一步梳理核桃是一种难以生根的木本植物，且不同的品种间生根能力差异很大，这限制了苗木的工厂化生产和标准园种植，是核桃生产中迫切需要解决的关键问题，也是遗传改良的重要目标。本研究首先以“绿波”核桃的离体胚为材料进行无菌苗的培养，再以核桃茎段和叶片为外植体进行不定芽的诱导分化、生长发育及生根成苗试验。在不同的培养阶段采用不同的处理方法以及添加不同种类的不同质量浓度的植物生长调节剂组合，观察统计外植体材料在各个生长阶段和各种不同的培养基中的生长发育情况，筛选出最佳的处理方法和最优的激素配比，从而建立核桃的植株再生体系。在此基础上，在不定芽分化的培养基中添加不同浓度的卡那霉素和头孢噻肟霉素，观察抗生素对外植体生长的影响，以确定其最低致死质量浓度。然后构建植物表达载体，探讨农杆菌介导的rolB基因核桃的遗传转化条件，比较研究各种影响因素，选择合适的预培养时间、侵染时间、共培养时间和抗生素的浓度，建立核桃的遗传转化体系。最后，对筛选得到的转基因植株进行荧光蛋白检测和PCR检测，以验证rolB（root-inducing plasmid TL-DNA of locusB）基因的导入结果。研究结果和创新点如下：1.核桃离体胚培养：经过75%酒精30s+0.1%HgCl2（加0.1%吐温-80）5min消毒处理后，离体胚培养的萌发率最高（68.49%），在DKW基本培养基上获得最高的萌发率（84.56%）；在离体胚培养的第10天-第15天之间萌发率最高，之后不再增加。2.核桃茎段芽分化的最佳培养基组合是DKW+6-BA0.5mg/L+IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，再生率为2.96。3.核桃无菌苗生根培养：采用“两步生根法”，在诱导生根阶段的黑暗处理6-8天之间最好，黑暗处理6天时生根率为65.31%；在生根发育阶段蔗糖含量和氮浓度分别为40g/L、1416mg/L，生根率分别53.26%和45.14%。4.核桃叶片愈伤组织的培养：暗培养时间对叶片愈伤组织的形成影响较大，暗培养2周时叶片愈伤率可达100%，暗培养时间的增加（3周）会抑制叶片愈伤组织的形成；低浓度（2.0mg/L-4.0mg/L）TDZ促进叶片愈伤的形成，高浓度（8.0mg/L-12.0mg/L）的TDZ抑制叶片愈伤的形成，使愈伤组织的结构也变得更加疏松，同时也抑制了叶片和愈伤组织的褐化；生长素2,4-D、IBA和NAA对叶片愈伤组织的形成有积极的促进作用，但表现情况不同：低浓度（1.0mg/L）2,4-D促进叶片愈伤组织的形成，高浓度（2.0mg/L）抑制愈伤组织的形成；低浓度（0.01mg/L-0.5mg/L）的IBA有利于叶片愈伤组织的形成，高浓度（1.0mg/L）IBA不利于愈伤组织的形成；NAA在本试验浓度范围内（0.1mg/L-0.5mg/L）一直促进愈伤组织的形成。5. rolB基因植物表达载体的构建：通过NCBI GenBank查找发根农杆菌Ri质粒上的rolB基因cDNA序列，合成并修饰目的基因片段，限制性内切酶EcoRⅠ和BmaHⅠ进行双酶切质粒DNA，与带有标记基因YFP的表达载体PEZR(K)-LNY相连接，转化大肠杆菌感受态细胞，获得含有启动子CaMv35S的重组质粒。经过对重组质粒进行PCR和EcoRⅠ和BmaHⅠ双酶切鉴定，均获得825bp的目的片段，证明rolB基因的植物表达载体构建成功。6.利用农杆菌介导法转化核桃，结果表明：预培养10和15天后进行侵染，转化率达到3%和1.33%；用kan筛选不定芽，当kan质量浓度为0mg/L时，不定芽的诱导率达到90%，当kan质量浓度为100mg/L时，仅有极少数的不定芽的产生，且茎段逐渐黄化；当kan质量浓度为200mg/L和400mg/L时，外植体全部黄化死亡。因此，可用于转基因植株的筛选。以kan质量浓度为100mg/L作为常用的选择水平。7.转基因植株的鉴定：转化植株经过100mg/L kan和500mg/L cef筛选后，利用激光共聚焦显微镜对转化植株的活体叶片进行照射观察，可以看到细胞内有绿色荧光蛋白表达；经过进一步PCR扩增检测后，结果显示3株转化株系扩增出的特异性条带和阳性对照一致，说明外源基因已经整合到核桃基因组中。
贾香楠[8]2010年在《转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建》文中指出本文以4个转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨株系和1个对照株系PT-16为材料,探讨了rolB-pttGA20ox双价基因对毛白杨生根生理、光合特性、抗逆性以及生长的影响。为进一步提高毛白杨的抗虫性和耐盐碱能力,采用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCrylAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于同一植物表达载体pYL1305上,转化烟草,验证了多基因的表达和功能。主要研究结果如下：1、转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨试管苗生根过程中内源IAA、GA3、ZR和ABA含量变化与对照差异明显,各项生根指标均高于对照。转基因株系不同程度地增大了对光的生态适应范围,其净光合速率与地径显着相关,与苗高相关不显着。盆栽期,各株系间苗高存在极显着差异,RG-1、RG-2和RG-3显着的高于RG-4和对照PT-16,地径差异不显着；移入大田后,各株系间苗高差异不显着,而地径出现显着差异,RG-4的平均苗高最高,达到了231.25cm,转基因株系中RG-4的平均地径最大,为13.91mm。对各株系的SOD活性和MDA含量测定表明,转基因株系RG-4对逆境的抵抗力最强,但与对照PT-16差异不显着。rolB-pttGA20ox双价基因的表达可能改变了毛白杨相关的生理代谢途径,同时,转基因株系在光合特性、生长、抗逆性等方面的差异明显,这也为选择优良的转基因株系提供了材料。2、采用PCR方法,扩增Bt基因,替换植物表达载体pYL1305中的gus基因,得到pYL1305-Bt。扩增CaMV35S-BADH-nos表达盒,并插入到pYL1305-Bt的多克隆位点,得到载体pYL 1305-Bt-BADH。将CaMV35S-GA20ox-nos表达盒、GH3-rolB-nos表达盒分别克隆到供给载体pYL-d1、pYL-d2上,经两轮重组得到多基因单载体pYL1305-Bt-BADH-GA20ox-rolB,并将其转化根癌农杆菌菌株EHA105。3、采用农杆菌介导的叶盘法将多基因转化烟草,对获得的抗性芽在含25mg／LHyg的培养基中进一步选择后进行分子检测,PCR检测和Southern杂交检测证明多基因已插入到烟草基因组中。进一步的RT-PCR检测证明,外源基因均得到表达,多基因表现为串联在一起插入到同一位点,其中转基因株系T2中各基因的表达量最高。4、转多基因烟草植株根部、茎部和叶片中IAA的含量均高于对照,分别是是对照的1.90倍、1.92倍和1.17倍；转化植株各部位的GA3含量均高于对照,转化植株中茎部GA3含量最高,叶片最低；转化植株的根、茎部ABA含量略低于对照,叶片中ABA含量高于对照；转化植株各部位的IAA/ABA比值均高于对照,其中根部的IAA/ABA值最高,是对照的1.82倍。5、转多基因烟草耐盐性试验表明,当NaCl为300mM时,对照生长受到抑制,叶片膨大黄化,不能生根,转基因植株生长正常,叶片保持绿色,并能正常生根。转基因烟草经不同浓度的NaCl长时间胁迫,其SOD活性高于对照,MDA含量变化幅度较小,而对照MDA含量随盐浓度升高而大幅降低。6、转基因烟草植株的茎、叶中均检测到了Bt毒蛋白,T2株系Bt毒蛋白含量最高,叶片中达到了585.53 ng/g.FW,茎中为573.66 ng/g.FW,而对照中没有检测到Bt毒蛋白。抗虫试验结果表明,饲喂一周后,转基因烟草对2龄舞毒蛾的校正死亡率为78.05%,对3龄斜纹夜蛾的死亡率为30.00%,并明显抑制了存活幼虫的生长发育。7、移栽后的转基因烟草植株高生长更加明显,节间伸长,表现出了pttGA20ox基因表达的性状特征,转基因植株地径也显着增大、叶片大而深绿、植株健壮,移栽4 W后转化植株平均苗高为19.28cm,地径为5.34mm,分别是对照的1.61倍和1.37倍。多基因在烟草中均能正常表达,没有出现基因沉默等现象,说明在构建多基因表达载体时,使用一定数目的同源序列的启动子和终止子是可行的,但随着基因的增多应该考虑更换不同启动子或在基因两端添加核基质结合区(MAR)序列以避免转基因沉默。多基因单载体的构建和各基因的正常表达为进一步的毛白杨等林木改良奠定了重要基础。
敖小平[9]2009年在《rolB基因转化大红甜橙的研究》文中研究说明柑桔常规育种开始于19世纪,但是,由于柑桔存在童期长、杂合性高、种子多胚、遗传上不亲和等现象,常规育种受到限制。生物技术(尤其是组织培养及基因工程技术)帮助育种者有效地克服了传统育种中的各种障碍。同时,遗传转化技术因其不受基因型限制,可以保持品种的完整性,同时可以定向地增加或者删除植物的某个特性,已成为提高柑桔及其他物质品质的非常有吸引力的方法。然而,要获得高效的遗传转化系统,必须建立高效的再生体系。本试验品种大红甜橙是湖南省地方品种,品质优良,耐贮藏,是鲜食和榨汁的优良选择。前人多次采用rol基因转化园艺作物,尤其是果树的研究结果表明,rol基因具有使植物节间茎段变短、植株矮化及产生大量斜向生长的毛状根等特性。用rolB基因转化大红甜橙在生产上具有较高的应用价值,在理论上对柑桔及其他作物的品种改良也有借鉴意义。本试验通过农杆菌介导法,成功将rolB基因导入大红甜橙。主要研究结果如下:1、以大红甜橙上胚轴为外植体,研究了影响植株离体再生的主要因素,结果表明:植物生长调节剂对不定芽及不定根的诱导和分化有显着影响。6-BA诱导大红甜橙上胚轴产生不定芽的较佳浓度为1.0 mg·L~(-1),此时不定芽诱导率为96.96%;IBA和NAA均能促进不定根萌发。然而,NAA同时也诱导产生了过量的愈伤组织;综合考虑,IBA效果比NAA好。当IBA浓度为5.0mg·L~(-1)时,不定根诱导率和平均根数均达到最高,分别为95.0%和1.49根;组培苗移栽时,基质采用河沙:草炭:锯木屑(1:1:1)。移栽后,使幼苗逐步适应外界环境,成活率可达100%。2、研究了Kan和农杆菌菌液的浓度对抗性芽诱导的影响,建立了大红甜橙较佳的遗传转化体系:MS+1.0 mg·L~(-1) 6-BA+50 mg·L~(-1) Km+500 mg·L~(-1)Cef。抗性芽分别通过嫁接和生根培养,共获得18株抗性植株;通过PCR鉴定,1号,7号,8号、9号、13号和16号为阳性植株;RT-PCR检测证明7号,8号、9号、13号和16号植株的目的基因成功表达;对部分转基因植株进行Southernblot分析,至少有一个拷贝,整合到9号植株的基因组DNA中。3、对已获得的转rolB基因植株及对照进行了形态特征观测。在嫁接试验中,对照与转基因植株的叶片面积和株高均存在显着差异;对照植株的叶片面积和株高分别是转基因植株的6.14～15.48倍和6.48～9.38倍。生根试验表明,外源激素IBA可促进对照及抗性芽生根,但是,抗性芽对IBA更为敏感,抗性芽远远早于对照开始萌发不定根;无外源激素存在条件下,抗性芽的平均根数(9.0根)远远高于对照平均根数(1.0根),同时,也比外加IBA情况时,抗性芽的平均根数(3.5根)要高得多。大红甜橙转rolB基因嫁接植株显着矮化、节间长度缩短的特性,在果树栽培和生产管理应用上意义深远。
韩会景[10]2007年在《杨树多基因遗传转化及外源基因表达研究》文中研究指明以转抗虫基因741杨为受体，进一步转化了发根农杆菌Ri质粒T—DNA，获得了转多基因741杨株系，通过转多基因植株生根特性、形态变异、叶片Bt毒蛋白含量、激素含量及抗虫性分析，初步筛选出了抗虫易扦插转基因741杨株系；探讨了外源基因(BtCrylAc基因和Ri质粒T—DNA)在转多基因植株中表达的相互影响及环境胁迫对外源基因表达的影响。在此基础上，将由Ri质粒上克隆出的rolB、rolC基因分别转入了普通741杨，用于研究rolC和rolB基因的功能及在转基因植物中的表现，筛选易生根转基因株系。主要研究结果如下：1．以具高抗虫性的转抗虫基因741杨株系pb29及多基因转化的741杨(抗虫基因和Ri质粒T—DNA)株系田间苗为材料，研究了转多基因741杨田间的生长特性，观察741杨叶片形状大小、叶片重、叶柄长短。结果表明，转多基因741杨和未转发根农杆菌的植株叶片相比，叶片形状变的短而宽，但单位重量变化不大，4种内源激素含量均增加2倍以上。2．采用ELISA技术，对转多基因741杨田间植株叶片上的Bt毒蛋白进行测定，并在室温下做了饲虫试验。结果表明，转多基因741杨叶片上Bt毒蛋白含量均小于未转发根农杆菌的双抗虫741杨(Pb29)；死亡率和pb29相比，多基因741杨对杨扇舟蛾的致死率降低，但对幼虫的生长发育仍有明显的滞育作用，影响了杨扇舟蛾生命周期正常的完成，对美国白蛾的致死率仍是100％，这说明外源基因发根农杆菌Ri质粒T-DNA的转入，抑制了Bt基因的表达。3．以转抗虫基因741杨株系pb29及多基因转化的741杨株系组培苗为材料，在NaCl胁迫环境下，研究了不同转基因株系对NaCl胁迫的反应。结果表明，转入Ri质粒T-DNA上的rol基因后，导致苗木根系数量增加，根系长度减小，IAA和GA激素含量显着提高，抗虫BtCrylAc基因的毒蛋白表达量降低；随着NaCl胁迫强度的增加，苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低，而根系的长度提高，Bt毒蛋白表达显着提高，这说明随着环境条件的改变，转基因杨外源基因的表达发生了改变。4．以741杨为受体，利用农杆菌介导法分别转化了rolB、rolC基因，得到转rolB基因的无性系15个，转rolC基因的无性系2个，通过PCR技术，分别检测了rolB、rolC基因和NptⅡ基因，初步证明，rolB、rolC基因已成功整合到741杨基因组中。
参考文献：
[1]. 银白杨再生体系建立及rolB-pttGA20ox双价基因遗传转化促进生根和高生长的研究[D]. 李慧. 北京林业大学. 2006
[2]. 毛白杨再生体系建立和rolB基因遗传转化技术[D]. 郭海. 北京林业大学. 2004
[3]. 转rolB基因改良毛白杨生根能力的研究[D]. 梁机. 北京林业大学. 2004
[4]. rolB、rolC基因对转Ri质粒叁倍体毛白杨的转化[D]. 苏彦苹. 河北农业大学. 2007
[5]. 胡杨再生体系的建立及rolB-pttGA20ox基因的遗传转化研究[D]. 丁霞. 北京林业大学. 2006
[6]. rolB-pttGA20ox双价基因转化毛白杨及遗传稳定性研究[D]. 辛蓓. 北京林业大学. 2009
[7]. 核桃遗传转化体系的建立及rolB基因的导入[D]. 李好先. 中国农业科学院. 2013
[8]. 转基因毛白杨生理生化特性及多基因表达载体构建[D]. 贾香楠. 北京林业大学. 2010
[9]. rolB基因转化大红甜橙的研究[D]. 敖小平. 湖南农业大学. 2009
[10]. 杨树多基因遗传转化及外源基因表达研究[D]. 韩会景. 河北农业大学. 2007
标签：林业论文; 毛白杨论文; 农杆菌论文; 转基因植物论文; 白杨论文; 基因合成论文; 质粒载体论文; 对照实验论文; 基因工程论文;