刘金龙[1]2004年在《人瘦蛋白乳腺表达载体的构建及细胞表达的初步研究》文中研究指明本研究以奶牛β-酪蛋白基因(β-casein,CSN2)5'端和 3'端调控成分作为指导构件，以改造的人瘦蛋白（leptin）cDNA 为表达序列，构建了人瘦蛋白乳腺特异性表达载体。通过表达载体转染体外培养的小鼠乳腺上皮细胞，研究所构建载体的合理性和人瘦蛋白基因的表达效率。相关研究结果如下：1. 利用重组 PCR 和普通 PCR 方法扩增了奶牛β-酪蛋白基因 5'调控区和 3'调控区。前者 长 2 826 bp，包括 1.7 kb 的上游调控序列以及 5'不翻译区的第一外显子和部分第一 内含子。后者长 620 bp，包括最后一个内含子、最后一个不翻译的外显子及 150 bp 的侧翼区。两者均亚克隆在 pMD 18-T Vector 的 T 位点。2. 在 EMBL 和 Genbank 数据库中对所克隆序列进行对比分析，结果表明所克隆片段与奶 牛 CSN2 全基因相应区段同源性分别为 99.0％和 98.0％，证明克隆片段为奶牛β-酪 蛋白基因组分。多种软件分析表明，所克隆的两个调控序列含有多个复合反应元件 和转录、翻译调节因子的作用位点。包括 STAT（MGF）信号转录激活子结合位点、C/EBP 结合位点、乳盒和 polyA 加尾信号等。这些均提示，所克隆的调控成分可指导外源 基因在乳腺细胞中高效表达，并可用于构建乳腺表达载体。3. 采用双酶切后定向克隆的方法，将所克隆的 5'和 3'调控区融合在一起，构建了初级 通用乳腺表达载体。利用 T 载体上的酶切位点和在引物中添加酶切位点，于 5'和 3' 调控区制造了多克隆位点区，便于外源基因的插入。4. 采用双酶切后定向克隆的方法，成功的将人瘦蛋白 cDNA 表达必需序列与初级乳腺表 达载体融合在一起。测序结果显示，两者正确融合，人瘦蛋白 cDNA 读码框正确无误， 没有发生影响表达的突变。5. 采用双酶切后定向克隆的方法，利用真核表达载体 pEGFP-C1 构建了含有抗性基因、 报告基因的人瘦蛋白非融合型乳腺表达载体 pEGFP-BL。用 PCR 方法和酶切方法检测， 表明其中整个人瘦蛋白乳腺表达构件插入位点正确无误。6. 脂质体法将 pEGFP-BL 转染体外培养的乳腺上皮细胞，经过 G418 的初步筛选后，通 过荧光显微镜观察到了报告基因绿色荧光蛋白的表达，并且主要在细胞质中表达。 设计特异性的检测引物，利用 PCR 法检测了报告基因表达的阳性细胞，结果显示表 达构件已经整合到了阳性乳腺细胞的染色体中。
李虎[2]2005年在《人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建》文中研究表明人血清白蛋白Human serum albumin (HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质,在人体内起着维持血液渗透压、运输、营养等作用。转基因动物乳腺生物反应器是基因制药的新方法,其生产药用蛋白具有安全、高效、成本低廉等优点,因此,通过制备动物乳腺生物反应器生产人血清白蛋白将会呈现美好的前景。本试验以奶牛β-酪蛋白基因(β-casein,CSN2)5′端和3′端为调控区序列,人血清白蛋白HSA cDNA 为表达序列,构建了含有新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白报告基因的人血清白蛋白乳腺特异性表达载体,为下一步的转染乳腺细胞和将来通过体细胞核移植法制备乳腺生物反应器生产人血清白蛋白打下坚实的基础。相关的研究结果如下:1.根据Genebank(登陆号V00495)中HSA 的cDNA 序列,设计扩增引物。采用RT-PCR自人肝脏中扩增出HSA 基因的1995 bp 全长cDNA。产物纯化后连至pMD-18T 载体,转化大肠杆菌DH5a。筛选阳性克隆菌,酶切鉴定并进行序列分析。结果与GeneBank 中登录的人、猴子、牛、猪、绵羊和小鼠的血清白蛋白cDNA 序列的同源性分别为99%、92%、82%、82%、81%和75%,而且,突变并没有引起最大读码框的改变,即成功的克隆了HSA 的cDNA 序列。 2.本试验以肝脏为材料,用Trizol 法提取总RNA,经甲醛凝胶变性电泳,能清晰的看到28s rRNA和18s rRNA 以及一条较弱的5s rRNA带,表明,所提取的RNA完整性好,完全可以用于RT-PCR 反应。3.根据表达载体pEGFP-C1 上的多克隆位点以及质粒pBL 中的CSN2 启动子序列,重新设计引物,在HSA cDNA 两端添加限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ酶切位点,并采用双酶切后定向克隆的方法,成功的将HSA cDNA 表达序列与CSN2 调控序列融合在一起。测序结果显示,两者正确融合,HSA cDNA 读码框正确无误,没有发生影响表达的突变。 4.采用双酶切定向克隆的方法,利用真核表达载体pEGFP-C1 构建了含有抗性基因、报告基因的人血清白蛋白非融合型乳腺表达载体pEGFP-BH。用PCR 方法和酶切方法检测,表明其中的整个人血清白蛋白乳腺表达构件插入位点准确无误。 5.脂质体法将pEGFP-BH 转染体外培养的乳腺上皮细胞,经过G418 的初步筛选,通过荧光显微镜观察到报告基因绿色荧光蛋白的表达。设计特异性的检测引物,利用PCR
刘建忠[3]1999年在《转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究》文中认为动物转基因研究是目前分子生物学研究的热点内容之一，其基本特征是改变动物的遗传组成，而改变动物遗传组成的目的是多种多样的。在本研究中，我们希望通过改变动物的遗传组成来赋予转基因动物一种新的性状，所用的试验动物为昆明小白鼠。 随着生活水平的提高，肥胖日益成为一种严重的社会问题，现代医学研究表明肥胖与人的糖尿病、心脏稿及高血压有密切关系。由人肥胖基因编码的瘦蛋白是调节脂肪代谢及体重的重要因子之一。能否用转基因动物生产该种蛋白质以及能否将该种蛋白质用于治疗与人肥胖有关的疾病是进行这项研究的目的。 用包含兔乳清酸性蛋白基因启动子及其远端上游区(约6.3kb，-6300bp-+28bp)、人肥胖基因的编码序列(约1.0kb)及兔乳清酸性蛋白基因终止子(约0.2kb)的叁个质粒经亚克隆构建了融合表达载体，在构建表达载体之前，我们首先用AB1377 DNA测序仪对人肥胖基因进行了序列测定，测定结果表明该序列包含人肥胖基因第一外显子的最后9bp，完整的第二外显子(172bp)和第叁外显子的一部分(包括了全部的编码序列和部分3′非翻译区)，编码序列(504bp)中包含典型的翻译起始密码子ATG和终止密码子TGA。用NotⅠ消化表达载体，回收包含上述叁个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5kb)，溶于TE(10 mmol／L Tris·C1，pH 7.4；0.1 mmol／LEDTA)后进行显微注射。注射用的DNA浓度为2μg/ml，每ml注射液中DNA的拷贝数约为2.4×10~(11)，每一枚原核期小鼠胚胎注射1 p1-2 p1。采用标准的显微注射方法，获得48只后代小鼠。四周龄对剪取0.1g左右的小鼠尾巴并提取尾组织DNA。根据rWAP启动子序列及人肥胖基因cDNA的序列设计了两对引物，其序列如下： P_1：5′Tgg，AAg，gAC，Agg，ATg，ggg，Tgg，Ag—3′ P_2：5′—gAT,AAg，gTC，Agg，ATg，ggg，Tgg，Ag—3′ P_3：5′—ggg，ATC，CgT’gCC，gAT,CCA，AAA，AgT，CCA，AgA—3’ P_4：5′—CgA，ATF,CCC，TTC，AAg，gCC，TCA，gCA，CCC，Ag—3′ 对于上述两对引物，预计P_1、P_2的扩增长度为1.1kb，P_3、P_4的扩增长度为460bp。随后的扩增结果表明该方法检测转基冈小鼠的结果不够稳定。以人肥胖基因cDNA为探针，用EcoRI消化总组织DNA，经Southern杂交反复确证其中两只母鼠(2~#与C_3)为转人肥胖基因小鼠。在出生的后代小鼠中，转基因阳性率约为4％(2／48)。基于此，我们认为采用PCR扩增的方法检测转基因动物具有费用低和耗时短的优点，但容易受污染而导致假阳性结果的出现，通过Southern杂交的方法检测转基因动物虽然费用高且耗时长，但效果十分稳定而可靠，我们建议直接采用Southern杂交的方法检测始祖转基因小鼠。两只转基因小鼠与非转基因公鼠交配，妊娠足月分娩后，2~#与C_3分别生出7只和8只仔鼠，Southern杂交结果表明2~#与C_3所生出的仔鼠中各有3只为含有转基因片段的仔鼠，这表明转基因始祖小鼠可正常繁殖并可将转基因传递给后代，其遗传遵循孟德尔遗传规律。将产后第5d的转基因小鼠与仔鼠隔离3h以上，并通过腹腔注射0.3IU的缩宫素和按摩乳房的方法采集其乳汁，以非转基因小鼠产后第5天的奶样为对照进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳的结果表明两只转始祖基因小鼠奶样都较对照一2一华中农业大学博士学位论文奶样多出一条带，大小约为16KDa，与人肥胖基因的表达产物瘦蛋白的分子量接近，初步估计其表达量为lm留ml一Zm留ml。基于此我们认为本研究中所构建的表达载体是一个表达效果良好的载体，6.3kb的r认伙P启动子及其远端上区具有较强的驱动下游基因(包括cDNA)表达的能力，可以用于构建表达其它基因的表达载体。 通过该研究，我们建立了在乳腺中表达人瘦蛋白的转基因动物模型，转基因得到较高水平的表达。以之为基础，在今后的研究中我们可以用该表达载体制作转基因奶山羊或奶牛，该表达载体在大型动物的乳腺中可能同样会有高水平的表达，从奶样中分离纯化该蛋白质并通过动物临床试验确定其生物学效应，该产品可能能够用于与人肥胖有关的疾病的治疗。
郑月茂[4]2005年在《转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育》文中研究说明本研究通过PCR 法克隆了2 248 bp 的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列,以之作为启动子指导人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中特异性表达,以验证表达载体构建的合理性和外源基因的表达效率。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA 的重组质粒pBLIG,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418 及PCR 筛选获得阳性细胞,以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。应用PCR 法检测转基因克隆胚中的外源基因,并与荧光观察进行对照,从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测,为进一步对荧光阳性胚胎进行移植,以期得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下:1. 山羊乳腺上皮细胞传至第15 代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体;大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞。第15 代细胞表面微绒毛极为发达,细胞质中线粒体和粗面内质网丰富并含有大量脂滴,表明细胞增殖活力旺盛。染色体分析表明,山羊乳腺上皮细胞系稳定,在离体培养条件下细胞未发生转化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对山羊乳腺上皮细胞培养上清液中的蛋白质进行分离,发现山羊乳腺上皮细胞上清液有3 个条带与标准酪蛋白的3 个条带一致,表明本研究培养的上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞,在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。2. 利用PCR 法克隆了山羊β-乳球蛋白基因5′调控序列(2 248 bp),其中包括第一外显子及第一内含子。PCR 产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector 的T 位点。质粒标记为pBLG。序列分析表明,该序列与发表的山羊序列同源性达99.70 %。计算机分析表明,此调控序列含有多个调节因子结合位点或反应元件,包括STAT5(MGF)信号转导子和转录激活子5(乳腺因子)结合位点、CCAAT/增强子结合蛋白结合位点、SP1 因子结合位点、Milk box“乳盒”、TBF 因子结合位点、视黄酸反应元件(RARE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,这提示此调控序列可调控外源基因在乳腺上皮细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体。3. 将质粒pBLG 和表达载体pEGFP-c1 用AseI 和NheI 双酶切,回收目的片断,T4DNA
刘芹[5]2012年在《肝细胞瘦素受体基因表达及其机制的初步探讨》文中认为背景和目的：瘦素是脂肪组织分泌的激素,由肥胖基因(obese gene, ob)编码,具有抑制食欲、调节能量代谢、神经内分泌、生长、生殖和免疫反应等多种功能。瘦素通过结合瘦素受体发挥其广泛的生理作用。通过与下丘脑的受体结合降低食欲和增加能量消耗；通过与外周组织受体结合影响一系列机体代谢过程,如胰岛素的释放、脂肪的分解合成、葡萄糖的产生、转运、代谢及胰岛素抵抗等。在人体,先天性瘦素基因缺陷将罹患极度肥胖,给予瘦素治疗后可以显着地降低体重。此外,瘦素与多种疾病,如糖尿病、肾病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病、肿瘤等的发生密切相关。同其他激素一样,瘦素的生物学活性受到精细的调节,如瘦素的水平、瘦素受体的表达、瘦素在体内的稳定性及清除率等。现知道,瘦素在血液循环中以游离型和结合型两种形式存在,其游离型具有生物活性。血液中的瘦素结合蛋白通过结合瘦素调节其游离型／结合型的比值(即游离瘦素指数free leptin index, FLI),在瘦素的稳定性、清除率及生物学活性的调节中发挥重要作用。而血液中可溶性瘦素受体(soluble leptin recetor, sOB-R)的确切组织来源及其调控因素目前尚未完全清楚。在大鼠及小鼠等实验动物模型的研究结果显示,肝脏瘦素受体的基因表达在调节血浆可溶性瘦素受体水平中具有至关重要的作用。采用1251标记的瘦素静脉注射大鼠,观察活体内瘦素结合活性的相对组织分布,结果显示：80%的放射性瘦素结合在肝组织中,表明肝脏是机体结合瘦素的主要器官。特异敲除肝细胞瘦素受体的小鼠(OB-RAlbKO),其血浆中sOB-R的诱导表达作用儿乎消失。对118名健康人血液检测分析发现,血浆中sOB-R及游离瘦素指数(FLI)还受到体脂量、性别、性激素等因素的调节,其中sOB-R与糖皮质激素水平呈显着的正相关(r=0.27,P<0.01)。鉴于肝脏是糖皮质激素作用的重要靶器官,也是瘦素受体表达最丰富的器官。我们推测糖皮质激素可能直接通过作用于肝细胞上的相应受体,诱导瘦素受体基因表达,为血浆sOB-R提供了最主要的来源。为此,我们在培养的正常肝细胞(L02)及肝癌细胞(HepG2)中直接地检测了地塞米松(人工合成的糖皮质类激素)对瘦素受体基因表达的影响。同时,通过对相关文献的分析,我们发现胰岛素信号在调节肝细胞瘦素受体基因表达中发挥着至关重要的作用。小鼠肝脏特异敲除胰岛素受体(liver-specific ins μlin receptor knock-out, LIRKO)后,其血液中瘦素的含量与野生型小鼠相比升高10倍,可溶性瘦素受体的含量升高80倍。采用实时定量PCR检测,发现LIRKO小鼠肝脏中Ob-Ra、Ob-Rb及Ob-Re的mRNA含量均显着升高,但这一现象并未在脂肪或肌肉组织胰岛素受体敲除的小鼠体内出现。这为我们深入探讨OB-R基因表达调控的分子机制提供了重要的线索。FOXO1是受胰岛素信号负性调节的重要转录因子,同时又是受糖皮质激素诱导的转录因子。因此,我们进一步采用脂质体介导的基因转染技术结合siRNA干扰等方法,观察了肝细胞中FOXO1表达水平的改变对Ob-R基因表达的影响,并利用报告基因分析技术在Ob-R基因启动子水平进行了初步的验证。研究旨在从分子水平上加深对瘦素活性的内分泌调节机制的认识,并为瘦素功能失调相关疾病的内分泌干预等将提供有价值的基础研究依据。材料方法：1.在培养的正常人肝细胞(L02)和肝癌细胞(HepG2)上,采用不同浓度的地塞米松(DEX)处理细胞,提取细胞总RNA和总蛋白质,通过逆转录-PCR、Real-time PCR、 Western Blot等观察DEX对瘦素受体基因表达的影响。2.采用脂质体介导的基因转染技术,在HepG2上导入siRNA特异干扰细胞内源性转录因子FOXO1的表达,或导入组成性活性的FOXO1表达质粒(FOXO1-TSS),观察转录因子FOXO1对瘦素受体基因表达的影响。3.采用启动子报告基因分析系统,将已克隆的人瘦素受体启动子(-3296～+105bp)与荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接而构建的报告基因载体,通过脂质体介导的基因瞬时转染技术导入HepG2细胞,检测细胞内荧光素酶活性,并以转染的β-半乳糖苷酶活性为对照,观察了siRNA干扰转录因子FOXO1对瘦素受体(OB-R)的启动子活性的影响。结果：1.地塞米松(糖皮质激素)能诱导肝细胞中总瘦素受体(OB-Rt)及长型瘦素受体(OB-Rb)的mRNA表达。2.地塞米松对瘦素受体的诱导作用具有一定的“剂量范围”,在肝癌细胞中50-500nM均能起诱导作用,且诱导效应显着(可高达30倍)；而在正常肝细胞中DEX的诱导剂量范围较窄(50-100nM),且诱导效应温和(仅3-4倍)。3.地塞米松(糖皮质激素合成物)能诱导肝细胞中转录因子FOXO1的基因表达。4FOXO1可以直接调节瘦素受体的启动子活性,FOXO1降低抑制了瘦素受体的启动子活性,反之FOXO1表达升高则增强了瘦素受体的启动子转录活性。5.肝细胞中瘦素受体(OB-Rb)的表达受FOXO1的调节,FOXO1条低抑制了瘦素受体的mRNA表达,反之FOXO1表达升高则增强了瘦素受体的基因表达。结论：1.地塞米松(糖皮质激素)能诱导肝细胞中总瘦素受体(OB-Rt)及长型瘦素受体(OB-Rb)的mRNA表达。2.地塞米松(糖皮质激素合成物)能诱导肝细胞中转录因子FOXO1的基因表达。3.肝细胞中瘦素受体的表达受FOXO1的调节,FOXO1表达水平降低抑制了瘦素受体的mRNA表达,反之FOXO1表达升高则增强了瘦素受体的基因表达。综上所述,本研究首次发现转录因子FOXO1参与了瘦素受体基因表达的调节。但FOXO1如何诱导瘦素受体的详细分子机制仍待阐明,FOXO1是通过与瘦素受体启动子上的结合位点直接促进其表达,还是通过诱导其他转录因子间接刺激其表达尚需更多的实验加以证实；此外,糖皮质激素是否通过诱导FOXO1参与瘦素受体的基因表达仍有待进一步实验验证。
参考文献：
[1]. 人瘦蛋白乳腺表达载体的构建及细胞表达的初步研究[D]. 刘金龙. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 人血清白蛋白基因的克隆及乳腺特异性表达载体的构建[D]. 李虎. 西北农林科技大学. 2005
[3]. 转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究[D]. 刘建忠. 华中农业大学. 1999
[4]. 转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D]. 郑月茂. 西北农林科技大学. 2005
[5]. 肝细胞瘦素受体基因表达及其机制的初步探讨[D]. 刘芹. 西南大学. 2012
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