高天明[1]2003年在《钾通道与神经元凋亡》文中指出目前对启动脑缺血后海马CA1锥体细胞凋亡的信号转导机制尚不清楚,因此,我们在在体及离体缺血/缺氧模型上探讨了钾通道在神经细胞凋亡中的作用及机理。1、在体脑缺血再灌流后CA1锥体神经元的BK_(Ca)通道活动持续增强缺血再灌流后CA1区锥体神经元BK_(Ca)通道的电导仅呈一过性增大,而通道的开放概率则持续升高。通道的电压依赖性保持不变,而通道对Ca~(2+)的敏感性显着增加。结果表明,脑缺血后BK_(Ca)通道活动增强是由于通道对Ca~(2+)的敏感性显着升高所致。
余小蒙[2]2014年在《映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对BK_(Ca)通道的影响》文中研究指明目的：观察映山红花总黄酮（total flavones of rhododendra，TFR）对原代培养的大鼠海马神经元缺氧-再复氧损伤的保护作用，以及大电导钙激活钾通道（Largeconductance calcium-activated potassium channels，BKCa）在TFR抗海马神经元缺氧-再复氧损伤中的作用，探讨TFR抗缺血性脑损伤作用的机制。方法：1.取原代培养6~8d的大鼠海马神经元，采用免疫荧光法鉴定海马神经元微管相关蛋白-2（MAP-2）。2.取原代培养6~8d的大鼠海马神经元，随机分为正常组、模型组、不同浓度TFR预处理组。将海马神经元放入含有94%N2、5%CO2及1%O2的叁气培养箱中缺氧4h，再正常培养24h，建立缺氧-再复氧损伤模型。（1）海马神经元复氧24h后，采用比色法检测TFR对MTT染色吸光度值的影响。（2）取海马神经元复氧24h后的培养上清液，检测TFR对MDA含量、LDH和NSE活力的影响。（3）海马神经元缺氧复氧后，采用Hoechst33258染色法检测TFR对海马神经元凋亡率的影响。（4）应用大鼠海马神经元缺氧-再复氧损伤模型，采用Western blot技术检测TFR对海马神经元BKCa蛋白表达的影响。3.采用全细胞膜片钳技术，记录大鼠海马神经元BKCa通道电流，观察TFR对海马神经元BKCa通道电流的影响。结果：1. MAP-2免疫荧光结果显示，原代培养的大鼠海马神经元胞体和轴突有绿色荧光，视野下可观察到少许非特异性染色，无其他背景细胞染色，证实培养的细胞为神经细胞。2. MTT结果显示，与正常对照组比较，模型组海马神经元MTT吸光度值显着下降；与模型组比较，（3.7，11.1，33.3，100，300mg/L）TFR预处理组海马神经元MTT吸光度值显着上升（P<0.01），并在一定的范围内呈浓度依赖性。3.与正常对照组比较，模型组海马神经元MDA含量、LDH及NSE活力显着上升；（3.7，11.1，33.3，100，300mg/L）TFR预处理组海马神经元MDA含量、LDH及NSE活力显着降低（P<0.01），并在一定的范围内呈浓度依赖性。4. Hoechst33258结果显示，正常对照组海马神经元凋亡率很低，而模型组海马神经元凋亡率显着增加（P<0.05）；（33.3，100，300mg/L）TFR能显着降低缺氧-再复氧损伤模型组海马神经元的凋亡率（P<0.05），并在一定的范围内呈浓度依赖性。5. Western blot结果显示，与正常对照组比较，模型组海马神经元BKCa通道蛋白表达无明显改变（P>0.05）；（100，300mg/L）TFR对缺氧-再复氧损伤模型组海马神经元BKCa通道蛋白表达没有显着影响（P>0.05）。6.全细胞膜片钳记录结果显示，原代培养的大鼠海马神经元上能记录到BKCa电流，此电流为一组快激活且不易失活的外向电流，并且此电流能被BKCa通道特异性阻断剂IBTX（100nmol/L）所阻断；（33.3，100，300mg/L）TFR可以显着增大此外向电流（P<0.05），并在一定的范围内呈浓度依赖性；（33.3，100，300mg/L）TFR引起的外向电流增强效应能被BKCa阻断剂IBTX（100nmol/L）阻断，即TFR可能是通过增加BKCa电流而增加外向电流的。结论：1. TFR对原代培养的大鼠海马神经元缺氧-再复氧损伤有一定的保护作用。2. TFR可以促进大鼠海马神经元BKCa通道开放，这可能是TFR对缺血性脑损伤发挥保护作用的机制之一。
王颖[3]2003年在《离子通道在培养大鼠海马神经元凋亡性容积减少中的作用》文中研究说明目的：探讨离子通道在培养大鼠海马神经元凋亡性容积减少(AVD)中的作用。 方法：用星形孢菌素(Staurosporine,STS)诱导的培养海马神经元凋亡模型，检测STS作用后神经细胞容积12h内的动态改变和12h时的细胞存活率，分别加入不同的钾通道和氯通道阻断剂，观察它们对细胞容积减少和凋亡的保护作用，细胞存活率的检测用细胞计数和MTT两种方法。用全细胞膜片钳技术观察培养海马神经元STS作用前后氯离子通道活动的变化。 结果：STS(2μM)持续作用12h，活细胞数是加药前的39.04％，TUNEL染色证明死亡的细胞多为凋亡。经STS作用后2h，培养海马神经元即呈现容积明显减少，并且随时间延长，容积递减，12h后容积减少到原来的78.1％。细胞外高K~+(25mM)能够明显抑制STS诱导的神经元容积减少，12h细胞存活率也升高到74.53％；广谱钾通道阻断剂TEA完全阻断了STS诱导的细胞容积减少，并且将12h细胞存活率提高到65.96％；BK通道阻断剂IBTX和paxilline分别使12h细胞存活率升高到63.92％和64.32％；而SK_(Ca)通道阻断剂apamin(1μM)和A型钾通道阻断剂4-AP(500μM)没有发现其保护作用。 使用氯通道阻断剂DIDS(0.5mM)也可以抑制海马神经元的AVD，并且12h后细胞存活率明显升高，达到68.4%;sITS(DIDS同类氯通道阻断剂，0.smM)对神经元凋亡的保护作用结果与DIDS的结果一致。用MTT法检测细胞存活率，单独使用钾通道阻断剂TEA(5 mM)，细胞存活率为66.0%，单独使用氯通道阻断剂DIDS，细胞存活率为83 .7%，同时使用TEA和DIDS，细胞存活率为115%。 用全细胞膜片钳技术观察STS诱导培养海马神经元前后氯离子通道活动的变化。用斜坡电压模式记录的结果显示，10min内正常细胞在钳制电压下电流未发生明显变化，氯通道阻断剂DIDS可以抑制所记录到的电流，加药10mln就使电流峰值降低到原来的36%，向浴槽液中加凋亡诱导剂STS smin后，+8伽mV钳制电压下电流即增大，为加药前的131.3%，加药后10min电流进一步增大，是加药前的巧5.9%，而且电流随时间延长具有继续增大的趋势。用跃级电压模式记录的结果做I一V曲线，氯通道在所测试电压下呈现外向整流特性，在一6肠mV一+40mv钳制电压下加药前后电流未发生明显改变，在+60mV钳制电压下，加药前电流为61.2士3.3%，加药后smin为101.3士n.2%;在+80mV钳制电压下，加药前电流为100.0%，加药后sntin为巧4.1士14.6%。 结论:研究结果表明钾通道和氯通道参与了凋亡性细胞容积减少，这也可能是的钾通道和氯通道介导细胞凋亡的重要机制之一。
汪芸[4]2009年在《缺糖缺氧/复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究》文中研究指明缺血性脑血管病具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,造成了严重的社会问题和经济负担。因此,深入认识其发病机制,寻找新的治疗靶点是目前亟待解决的问题。缺血性脑血管病的直接原因是脑血流减少,导致氧和能量供应中断,细胞死亡。治疗后脑血流恢复,但往往出现神经系统损伤加重的情况,即缺血再灌注损伤。中医理论认为中风病(这里主要指缺血性脑血管病)的病因与风、火、痰、瘀等毒邪损伤脑络有关。传统中药丹参具有活血化瘀的功效,已广泛应用于缺血性脑血管病的临床治疗。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是从传统中药丹参中提取的水溶性有效成分,由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成的酚酸类化合物,具有很强的抗氧化、清除自由基作用,但其在脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制还不完全清楚。本论文以中医中风病理论为指导,在我们实验室已证明丹酚酸B对小鼠脑缺血性损伤具有治疗作用的基础上,采用原代培养大鼠皮层神经细胞,建立缺糖缺氧/复糖复氧的细胞模型,从兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、细胞凋亡的角度研究神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。论文的实验研究包括四个部分:一、缺糖缺氧模型的建立及丹酚酸B有效剂量的确定目的:建立稳定可靠的缺糖缺氧模型,并确定丹酚酸B的有效剂量。方法:体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,复制神经细胞缺糖缺氧2h、3h、4h、5h的细胞模型,测氧仪测量培养液中溶解氧浓度,采用MTT法检测细胞活性和存活率。结果:体外培养的神经细胞状态稳定,经免疫组化神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定阳性细胞比例达70～80%,神经细胞Nissl's染色显示Nissl's小体丰富。随缺糖缺氧时间延长,培养液中溶解氧浓度逐渐降低,神经细胞活性、存活率也随之下降,各时间点与正常组比较均有显着性差异(P＜0.01)。选择对细胞损伤较重的缺糖缺氧4 h作为模型时间。神经细胞缺氧缺糖4 h后活性明显下降,与正常组比较有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组包括10μg/L,100μg/L,1mg/L,5 mg/L,7.5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L和50 mg/L共8个不同剂量,其中10、25、50 mg/L 3个剂量的丹酚酸B明显增强神经细胞活性,且存在量效关系,与缺糖缺氧4 h组相比差异明显(P＜0.01)。将10、25、50 mg/L3个剂量的丹酚酸B加入正常神经细胞,其活性与正常组之间没有显着性差异。选择终浓度10 mg/L作为以下实验丹酚酸B的用药剂量。二、缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:探讨缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。方法:将培养的神经细胞随机分为正常组、缺糖缺氧4 h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧4 h的病理模型,MTT法观察神经细胞活性和存活率,比色法检测LDH漏出率和培养液中谷氨酸含量,流式细胞术测定神经细胞线粒体膜电位(MMP)、胞浆内Ca~(2+),倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察神经细胞形态和超微结构的变化。结果:神经细胞缺糖缺氧4 h后活性、存活率、MMP荧光值明显降低,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量及胞浆内Ca~(2+)荧光强度显着升高,与正常组比较有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率、MMP荧光值均增高,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量、胞浆内Ca~(2+)荧光强度下降,与缺糖缺氧4 h组比较有显着性差异(P＜0.05～0.01)。正常组神经细胞胞体呈锥体形,细胞器丰富:缺糖缺氧4 h组大部分神经细胞肿胀,细胞器数目有所减少,可见线粒体肿胀明显;丹酚酸B治疗组神经细胞轻度肿胀,细胞器结构尚完整。叁、复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:研究复糖复氧对神经细胞的氧化损伤,并在体外模型中证实丹酚酸B的干预作用与其抗氧化能力有关。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧组和丹酚酸B治疗组。MTT法检测缺糖缺氧3h/复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h共6个时间点神经细胞活性、存活率。缺糖缺氧3h/复糖复氧3h、24h分别代表再灌注早期、晚期,并采用比色法观察神经细胞LDH漏出率,荧光标记和自旋捕集技术检测细胞内ROS水平,比色法测定神经细胞内Mn-SOD、CAT和GSH-PX的活性。倒置相差显微镜观察神经细胞形态变化。结果:缺糖缺氧3h后复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h,神经细胞活性、存活率均较正常组降低(P＜0.05～0.01);除复糖复氧1h、12h外,其他时间点丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率均高于复糖复氧组(P＜0.05)。神经细胞复糖复氧3h、24h后,LDH漏出率、细胞内ROS均明显高于正常组(P＜0.05～0.01);而丹酚酸B治疗组神经细胞LDH漏出率、细胞内ROS则低于复糖复氧组(P＜0.05～0.01)。复糖复氧3h、24h神经细胞内Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性均降低,与正常组比较差异明显(P＜0.05～0.01),丹酚酸B治疗组神经细胞内抗氧化酶的活性明显高于复糖复氧3h、24h组(P＜0.05～0.01)。正常组神经细胞胞体饱满,突起粗大伸展;复糖复氧3h后神经细胞形态发生改变,至24h神经细胞皱缩,部分细胞死亡;丹酚酸B治疗组神经细胞形态变化有所减轻。四、复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用机制的研究目的:探讨复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用的机制。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧24h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧3h/复糖复氧24h的细胞模型。激光扫描共聚焦显微镜测定胞浆内Ca~(2+)荧光强度,流式细胞仪检测MMP、细胞凋亡率,免疫组化法观察细胞内Bcl-2、Bax的表达水平,Western blot测定细胞色素C释放率,Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化,透射电镜观察神经细胞超微结构。结果:缺糖缺氧3h/复糖复氧24h引起胞浆内Ca~(2+)荧光强度明显增高,MMP荧光值降低,神经细胞凋亡率明显增高,与正常组相比有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组胞浆内Ca~(2+)荧光强度降低,MMP荧光值增强,凋亡率下降,与复糖复氧24h组相比亦有显着性差异(P＜0.01)。神经细胞复糖复氧24h,Bcl-2表达减弱,Bax表达升高,与正常组相比有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,与复糖复氧24h组比较差异明显(P＜0.05)。正常组胞浆内细胞色素C含量很低,主要集中于线粒体,复糖复氧24 h后胞浆内细胞色素C含量明显升高,其灰度值与正常组相比有显着性差异(P＜0.01),丹酚酸B治疗组胞浆内细胞色素C含量低于复糖复氧24 h组(P＜0.05)。复糖复氧24 h组细胞色素C释放率明显高于正常组(P＜0.01),丹酚酸B治疗组细胞色素C释放率明显降低,两组相比差异明显(P＜0.05)。正常神经细胞经Hoechst33342荧光染色,核呈均匀的蓝色荧光;复糖复氧24 h组则有较多细胞核呈凝聚固缩,荧光明显增强,并有核碎裂;丹酚酸B治疗组细胞核大部分呈淡蓝色或蓝色荧光,接近正常组,仅见个别细胞核浓染呈明亮蓝色荧光。透射电镜观察复糖复氧24 h组神经细胞核染色质凝聚,细胞膜完整,符合凋亡的形态改变;丹酚酸B治疗组神经细胞超微结构变化较复糖复氧24 h组有所减轻。结论:本研究建立了稳定可靠的神经细胞原代培养体系,复制的细胞模型可以实现体外神经细胞缺糖缺氧损伤。缺糖缺氧4 h引起神经细胞培养液中谷氨酸含量增加、细胞内Ca~(2+)超载、MMP下降。丹酚酸B通过减少培养液中的谷氨酸含量,抑制神经细胞内Ca~(2+)超载,稳定MMP,从而对缺糖缺氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3 h/复糖复氧3 h、24 h对神经细胞的损伤与氧化应激有关,丹酚酸B可以清除细胞内ROS,提高抗氧化酶Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性,从而对复糖复氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3h/复糖复氧24 h可诱导神经细胞发生凋亡,丹酚酸B通过保护线粒体功能,提高Bcl-2的表达,降低Bax的表达,减少促凋亡物质的释放,起到抗凋亡作用。综上所述,神经细胞缺糖缺氧损伤的机制与兴奋性毒性、细胞内Ca~(2+)超载有关,而复糖复氧损伤的机制则涉及到氧化应激、线粒体途径的细胞凋亡。丹酚酸B通过减轻兴奋性毒作用,抑制神经细胞内Ca~(2+)超载保护缺糖缺氧的神经细胞,通过改善细胞的氧化-还原状态,保护线粒体功能,拮抗凋亡,对复糖复氧神经细胞起到保护作用。
佚名[5]2002年在《国际神经递质及受体学术研讨会》文中认为Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐａｃｋａｇｉｎｇｉｎｔｏｓｙｎａｐｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｓ ＷｕＪａｎｇｙｅｎ ,ＪｉｎＨｏｎｇ ,ＷｕＨｅｎｇ ,ＧｒｅｇＯｓｔｅｒｈａｕｓ ,ＫａｔｈｌｅｅｎＤａｖｉｓ
参考文献：
[1]. 钾通道与神经元凋亡[C]. 高天明. 2003’离子通道、受体与信号转导专题研讨会专辑. 2003
[2]. 映山红花总黄酮对大鼠海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其对BK_(Ca)通道的影响[D]. 余小蒙. 安徽医科大学. 2014
[3]. 离子通道在培养大鼠海马神经元凋亡性容积减少中的作用[D]. 王颖. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[4]. 缺糖缺氧/复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究[D]. 汪芸. 北京中医药大学. 2009
[5]. 国际神经递质及受体学术研讨会[J]. 佚名. 解剖学研究. 2002