（中源协和生物细胞存储服务（天津）有限公司）
摘要：本实验通过设计AQP-1启动子引物，提取乳腺癌细胞的基因组，利用PCR技术扩增出AQP-1基因的启动子序列，通过酶切、连接到荧光素酶报告基因载体-- pGL-3 basic上，通过荧光素酶活性检测（Luciferase 活性分析）分析AQP-1启动子的活性。
关键词：AQP-1启动子；乳腺癌细胞MCF-7；COS-7细胞；荧光素酶活性检测（Luciferase 活性分析）
一、实验目的
旨在克隆AQP-1启动子并构建其荧光素酶报告基因表达质粒，从而进一步研究其他信号分子对AQP-1基因的调控作用。随着对AQP-1研究的不断深入，将不仅为有机体水转运的生理现象提供分子解释，而且还将促进人类对某些因水平衡紊乱而引起的疾病的发病机制的进一步认识，为治疗提供理论依据。
二、实验过程
1材料与实验药品
乳腺癌细胞MCF-7、蛋白酶K、Fast Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等。
2乳腺癌细胞基因组的提取
用胰酶消化下细胞用蛋白酶和细胞裂解液裂解，室温离心，氯仿提取一次，酚提取一次，离心，乙醇吹悬，离心，弃乙醇，室温干燥，加入30ul超纯水，4度保存。
3 PCR反应
PCR反应条件：94℃，5 min（热启动），94℃，60 s （变性），60℃，45s （退火），72℃，2 min （延伸），30次循环，72℃，10min。
4 酶切反应
16℃反应4h，再4℃连接过夜，取10μl连接产物转化E.coli 感受态细胞。
6 连接产物转化大肠杆菌
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与质粒共保温，实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入PBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了PBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
7 重组子（单克隆）鉴定与测序
挑取携带有重组质粒的重组E.coli DH5α单菌落接入LB液体培养基，37℃培养过夜，以1：4的比例加入75%的甘油（已灭菌），送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。
三、结果与讨论
1设计引物
根据AQP-1启动子序列结合所用载体确定酶切位点，设计引物，产物大小为484bp。
2 PCR扩增目的基因DNA片段
电泳鉴定显示AQP-1启动子的 PCR扩增产物的条带清晰明亮，明显扩增出AQP-1区，大小约为484bp。
3切胶回收PCR产物
将AQP-1启动子的三个平行的扩增产物进行切胶回收，结果显示三个扩增产物条带大小一致，均为484bp左右。
4酶切凝胶回收
用MluI/ Hind III限制性核酸内切酶对AQP-1和pGL-3空载体进行酶切，酶切后将空载载体同AQP-1启动子一同凝胶电泳以作参照，结果显示pGL-3条带较亮，大小约为5000bp左右。AQP-1启动子条带虽然比空载载体的条带暗，但比较清晰，大小为500 bp左右。
5重组质粒的小提验证
本实验提取质粒利用的是索莱宝质粒小量提取试剂盒。对重组质粒进行提取，然后进行DNA凝胶核酸电泳。电泳结果选出符合重组质粒要求的三条泳道，所以这三组质粒进行下一步的酶切验证。
6重组质粒的酶切验证
MluI/ Hind III限制性核酸内切酶对三组重组质粒进行酶切，电泳显示酶切后的重组质粒，较大的三条条带为载体pGL-3，大小约为5000 bp左右；较小的三条条带为AQP-1启动子，大小为484bp左右，证明AQP-1启动子的重组质粒构建成功。
在质粒空载体基因组中含有多个单一的限制性内切酶的酶切位点，外源基因插到两个酶切位点中，利用两个限制性内切酶将外源基因两端的酶切位点切开，得到两条线性DNA片段，其中小片段为含有外源基因的DNA，另一条为质粒DNA。对其进行凝胶电泳分析，在紫外灯下观察可观察到两条DNA条带。
7测序结果
通过凝胶回收、连接、转化DH5α、重组质粒制备和挑取携带有重组质粒的重组E.coli DH5α单菌落，送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。测序结果如图3-6所示。将测序结果在NCBI网站上进行比对，匹配率100%。
8 COS-7细胞的培养
（1）COS-7细胞的复苏
把冻存的COS-7细胞株复苏后加10%DMEM完全培养基于37℃、5％CO2培养箱培养。
第1d，镜下观察复苏细胞悬浮于培养液中，折光性强，胞体呈圆形。第2d，复苏细胞镜下观察细胞大部分贴壁。第3d，复苏细胞镜下观察细胞增殖速度较快，折光性好。5d后可按比例传代。
（2）COS-7细胞的传代
第1d，镜下观察传代细胞悬浮于培养液中，折光性强，胞体呈圆形。第2d，传代细胞镜下观察细胞已贴壁，折光性好，少数细胞出现伪足。第3d，传代细胞培养液显微镜下观察大部分细胞已伸出伪足，细胞轮廓清楚，折光性强，细胞数量明显增多。
传代细胞传至第6-8代仍保持增殖状态，细胞生长速度未见减慢，能长满瓶底。
9荧光素酶测定（Luciferase Assay System）
用多功能微孔检测仪检测COS-7细胞中的相对荧光度值。检测结果如图3-7所示。由图可明显看出，在COS-7细胞中，与不含AQP-1启动子的pGL-3空载体相比，含有AQP-1启动子的pGL-3具有更高的荧光素酶的活性。说明构建的AQP-1启动子荧光素酶报告基因质粒具有转录活性，质粒构建成功。
参考文献
[1] Preston GM，Agre P，Isolation of the cDNA for erythrocyte in2 tergral membrane protein of 28kilodoltons：member of an ancient channel family[J] . Proc Natl Sci USA，1991，88（24）：11110-111141.
[2] Preston GM，Carroll TP，Gu ggino WB，et al. Appearance of wa2 ter channels in xenopus
oocytes expressing red cell CHIP28 pro2 tein[J] . Science，1992，256 （5055）：385 – 3871.
[3] Denker BM，SmithBL，Kube jda FP，et al. Identification，purifi2 cation，and partial
characterization of a novel Mr 28，000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules[J] . J Biol Chem，1988，263（30）：15634 – 156421.
论文作者:李欣泽
论文发表刊物:《航空军医》2017年第8期
论文发表时间:2017/6/23
标签：质粒论文; 细胞论文; 条带论文; 基因论文; 电泳论文; 荧光论文; 折光论文; 《航空军医》2017年第8期论文;