宋秀芬[1]2002年在《棉花黄萎病菌外泌毒蛋白的分离、纯化及性质研究》文中进行了进一步梳理棉花是我国重要经济作物之一，棉花黄萎病是当前影响我国棉花产量与品质的主要病害之一，是由大丽轮枝菌（Vertillium dahliae,Vd）引起的一种危害性极大的维管束系统病害。国内外在棉花黄萎病防治及抗病育种方面虽然取得了一些进展，但进展缓慢，除了客观上缺乏免疫抗源外，一个很重要的原因就在于有关黄萎病菌致病机理的基础研究尚处于相对滞后状态。国内外研究一致认为，棉花黄萎病菌的致病因子是其分泌到细胞外的一种蛋白—脂多糖复合物（PLPC）。因此，分离纯化出这种蛋白—脂多糖复合物对于弄清棉花黄萎病菌的致病机理具有重要意义。本实验利用丙酮沉淀，获得棉花黄萎病菌外泌毒蛋白（Vd粗蛋白），该Vd粗蛋白具有耐高温及酸碱（0.1M NaOH与0.1M HCl）的性质；利用低压层析系统、高压液相层析系统，通过Q-Sepharose Fast Flow 阴离子柱层析，SephadexG-100分子排阻层析，ConA Sepharose4B 亲和层析及C18 反向柱层析等方法对Vd粗蛋白进行分离纯化，获得了一个较纯的单一蛋白组分，经质谱（MALDI-TOF-MS）分析，分子量在1800 Da左右，约含有16个氨基酸。迄今，国内外尚未见从棉花黄萎病菌外泌物中分离纯化出单一致萎活性组分的报道。本实验对棉花黄萎病菌致萎活性组分的分离纯化方法进行了摸索，并分离到一种较纯的单一致萎活性组分。对于这种致萎活性组分的理化及生化等相关性质还需做进一步的研究，研究结果为棉花黄萎病菌致病机理研究及棉花抗黄萎病基因工程育种提供一些理论及实践方面的参考。
陈旭升[2]1998年在《棉花黄萎病菌致萎毒素的生理生化特性研究》文中指出棉花黄萎病是一种危害性极大的维管束系统病害。当前,全球每年因黄萎病危害所造成的经济损失平均以10 亿多美元计。近年来,黄萎病在我国主产棉区相继造成严重危害,黄萎病已成为严重影响我国棉花高产稳产的主要障碍,尤以落叶型黄萎病为甚。而今,国内外在棉花黄萎病防治以及抗病育种方面没有取得明显进展,除了客观上缺乏免疫抗源外,一个很重要的原因就在于有关黄萎病致病机理的基础研究尚处于相对滞后状态。黄萎病菌分泌的毒素作为导致棉花黄萎病的关键生化因子,得到了越来越多的研究证实。因此深入探讨黄萎病菌致萎毒素的生理生化特征,了解致萎毒素的分子结构与功能,这对于揭开黄萎病菌的致萎机制,无疑是一项必不可少的基础性研究内容。本文采用现代快速蛋白质液相色谱技术(简称FPLC 技术),对以棉花为寄主的典型黄萎病菌系VD8、T9、SS-4 外泌毒素的有关生理生化特性进行了研究,得到以下结果:1. 粗产毒量与培养基pH 以及培养时间有一定关系,pH4.8 的培养基产毒量平均比pH6.8 的培养基高4.03ug/ml。在一定时间内,随着培养时间的延长,粗产毒量有增加的趋势,培养21 天的产毒量平均比培养15 天的产毒量高4.07ug/ml。另外,光照培养(2.1×102lx)对粗产毒有抑制作用;与黑暗条件相比,光照培养使叁个菌系平均产毒量下降了3.3ug/ml。2. 黄萎病菌培养过程中菌液pH 发生了变化。T9、VD8、SS-4 叁个菌系经培养后,其粗提液的pH值均趋于增大。从增加幅度来看,pH4.8 的培养基,其pH 增加的幅度大于pH 6.8的培养基;培养21 天粗滤液的pH 增幅大于培养15 天的增幅。黄萎病菌在培养过程中pH趋于增高,暗示H+的供应对病原菌的生长繁殖可能是必需的。3. 黄萎病菌外泌毒素盐析曲线的峰值在70-80%硫酸铵饱和度。硫酸铵盐析饱和度 90%足以使黄萎病菌致萎毒素几乎完全沉淀出来,并可用于进一步分离纯化。4. 致萎毒素可引起棉苗维管束系统堵塞。电镜切片观察显示:子叶叶脉的部分导管中充塞着黑色的侵填体,许多薄壁细胞发生扭曲变形、排列混乱。茎部许多导管孔变得异常狭小,成为水分输导的“瓶颈”。5. 叁个菌系的粗提毒素经Superose12 柱层析分离皆产生两个致萎峰:峰Ⅰ致萎力弱,其症状属黄斑型;峰Ⅱ致萎力极强,其症状属青枯型。其中峰Ⅱ毒蛋白组份经可透分子量8000-10000 Daltons 的透析袋透析后,会发生丢失;故建议在黄萎病菌致萎毒素的研究中,不宜使用可透分子量1 万左右的透析袋或超滤器。6. 致萎峰毒素具耐高温的能力。粗滤毒素经100℃水浴煮沸1 小时,FPLC 层析依然产生两个致萎峰。致萎毒素的热稳定性可能与它们的高含糖率有关,叁个菌系峰Ⅰ平均含糖率为32.61%、峰Ⅱ平均含糖率高达44.32%。7. 培养基pH 条件对致萎峰毒素百分产率有影响。适于黄萎病致萎毒素研究的培养基pH 以4.8-5.0 为宜。另外,与黑暗培养相比,光照培养使强毒菌系峰Ⅱ致萎毒素百分含量有所提高,使弱毒菌系SS-4 的峰Ⅱ致萎毒素百分含量有所下降;峰Ⅰ致萎毒素百分含量变化则表现相反的趋向。8. 致萎峰毒素的氨基酸组分存在差异:峰Ⅱ强致萎毒素组氨酸含量很高,平均达14.8%;而峰Ⅰ弱致萎毒素的组氨酸含量仅3.74%。组氨酸百分含量与层析后致萎峰蛋白溶液的单位质量电导率呈高度正相关,r=0.9818**。另外叁个菌系各致萎峰毒素皆测不出甲硫氨酸;酪氨酸仅在T9 的主峰Ⅱ中含0.13%,其余皆为0;各致萎峰半胱氨酸含量很低,皆在1%以下。9. VD8 与T9 的亲缘关系较近,与SS-4 的亲缘关系较远。生化分析显示:(1)粗提毒素
陈旭升, 王祝鸣[3]2002年在《棉花黄萎病菌致萎毒素的分离纯化方法》文中提出利用快速蛋白质液相色谱技术 (Fast Protein Liquid Chromatography,FPLC) ,对棉花 3个黄萎病菌 (Verticilliumdahliae)菌系外泌毒素的某些理化性质进行了分析。结果显示 :黄萎病菌毒素有两个致萎峰 ,大分子峰 毒蛋白致萎力较弱 ,致萎症状属黄斑型 ;而小分子峰 毒蛋白其致萎力极强 ,致萎症状属青枯型。透析试验表明 ,可透 80 0 0～ 1 0 0 0 0 Da的透析袋会使小分子峰 丢失。热稳定试验表明 :峰 、峰 毒蛋白皆可耐 1 0 0℃高温水浴热煮而不发生沉淀 ,并保持致萎活性。根据以上研究结果 ,本文提出了黄萎病毒素分离纯化新方法。
参考文献：
[1]. 棉花黄萎病菌外泌毒蛋白的分离、纯化及性质研究[D]. 宋秀芬. 首都师范大学. 2002
[2]. 棉花黄萎病菌致萎毒素的生理生化特性研究[D]. 陈旭升. 南京农业大学. 1998
[3]. 棉花黄萎病菌致萎毒素的分离纯化方法[J]. 陈旭升, 王祝鸣. 上海交通大学学报(农业科学版). 2002