胡南[1]2016年在《七氟醚对老龄大鼠血脑屏障的影响及Wnt/β-catenin-Annexin A1在其中的作用》文中研究说明目的探讨七氟醚麻醉对老龄大鼠血脑屏障的影响及Wnt/β-catenin-Annexin A1通路在其中的作用。内容制作老龄大鼠吸入七氟醚模型,从在体水平研究七氟醚对血脑屏障组成部分以及Annexin A1蛋白表达水平的影响。采用7日龄幼鼠脑组织微血管内皮细胞培养技术,从离体水平证明七氟醚对于Wnt/β-catenin通路活性的影响以及后者对Annexin A1表达的调节。为麻醉药物的选择提供参考。方法该研究主要分为叁部分:第一部分采取18至20月龄雄性老龄大鼠,分为对照组(C组):持续吸入含有氧浓度为30%的空气;七氟醚组(S组):持续吸入含有不同浓度七氟醚(2.4%,3.1%,3.6%)的混合气体,吸入持续时间分别为2h,4h,6h。于术后24h采用过深麻醉方法处死动物,取海马组织,分别采用伊文氏蓝染色以及免疫荧光法对纤维蛋白原fibrinigen进行染色,检测各组伊文氏蓝以及fibrinogen在海马沉积面积的变化。第二部分为在体实验。首先采取18至20月龄雄性老龄大鼠,应用免疫荧光染色法,将Annexin A1分别与神经元标记物Neu N、小胶质细胞标记物Iba-1以及血管内皮细胞标记物CD31进行双染,观察海马部位Annexin A1细胞来源。然后制作老龄大鼠吸入七氟醚模型(6h,3.6%),采用western blot方法于麻醉结束后6h、12h、24h检测老龄大鼠海马组织内紧密连接蛋白occludin、claudin-3以及claudin-5和ZO-1,黏附连接蛋白VE-cadherin,细胞骨架蛋白F-actin蛋白表达含量的改变,以及麻醉结束后采用western blot和免疫荧光染色法于6h、12h、24h检测老龄大鼠海马部位膜联蛋白Annexin A1蛋白表达含量的改变。最后将老龄大鼠随机分为3组:(1)对照组(C组):持续吸入含有氧浓度为30%的空气。(2)七氟醚组(S组):持续吸入七氟醚浓度为3.6%的混合气体6h;(3)人重组Annexin A1+七氟醚组(AS组):麻醉前1小时尾静脉注射人重组膜联蛋白Annexin A1,后持续吸入含有七氟醚浓度为3.6%的混合气体,持续6h。采用western blot方法检测麻醉结束后24h时间点老龄大鼠海马组织内紧密连接蛋白occludin、claudin-3以及claudin-5和ZO-1,黏附连接蛋白VE-cadherin,细胞骨架蛋白F-actin蛋白表达含量的改变;采用免疫荧光方法检测麻醉后24h时间点老龄大鼠海马纤维蛋白原沉积;采用Y迷宫和条件恐惧法检测麻醉后1d和3d老龄大鼠认知功能。第叁部分为离体实验,分为两部分。首先采用出生后7d的雄性Wistar大鼠,提取脑组织微血管内皮细胞进行体外培养,重构血脑屏障的体外模型。观察麻醉前以及采用3.6%七氟醚处理6h后的第6h、12h以及24h内皮细胞总蛋白与核蛋白水平的β-catenin以及总蛋白水平的GSK-3β。然后分别在有/无七氟醚麻醉处理的情况下给予该种培养细胞Wnt/β-catenin的激动剂wnt-3a以及抑制剂DKK1,并采用western blot以及免疫荧光方法检测处理后Annexin A1表达水平。结果与对照组相比,吸入3.6%浓度七氟醚6h引起麻醉后24h老龄大鼠海马伊文氏蓝以及纤维蛋白原沉积面积均显着升高。老龄大鼠海马组织内的Annexin A1与血管内皮标记物CD31高度重合。与麻醉前对照组相比,老龄大鼠海马血脑屏障occludin,claudin-3,VE-cadherin以及F-actin于麻醉后24h蛋白表达降低;与麻醉前相比,麻醉后24h老龄大鼠海马Annexin A1表达显着降低。与S组动物相比,AS组occludin,claudin-3,VE-cadherin以及F-actin于24h后显着增加,海马纤维蛋白原沉积阳性面积降低。与C组相比,S组麻醉后1d、3d穿梭次数减少,在新异臂停留时间减少,场景相关僵直百分比下降,条件诱导僵直百分比减少;与S组相比相比,AS组麻醉后1d、3d穿梭次数增多,在新异臂停留时间延长,场景相关僵直百分比升高,条件诱导僵直百分比升高。离体实验中与未经七氟醚处理组相比,3.6%七氟醚处理6h麻醉结束后第24h微血管内皮细胞内总蛋白与核蛋白水平的β-catenin显着下降,总蛋白水平的GSK-3β蛋白表达上升。与对照组相比,wnt-3a/DKK1处理显着提高/降低血管内皮细胞Annexin A1表达。结论七氟醚麻醉通过抑制Wnt/β-catenin通路活性下调血管内皮细胞内Annexin A1的表达,从而破坏血脑屏障完整性,参与造成老龄大鼠认知功能损伤。
李大河[2]2016年在《强直性脊柱炎韧带组织比较蛋白质组学研究及膜联蛋白A2功能验证》文中指出强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种以慢性炎症和异常骨化为特征的自身免疫性疾病。世界范围内各个国家和种族基本都存在AS患者,而且AS病患人群数量庞大。我国AS患病率约0.3%,鉴于我国巨大的人口基数,AS病人数量接近400万;AS临床特征表现为慢性炎症反应和新骨形成、异常骨化。AS致残率很高,病人在长期遭受背痛、腰痛、关节痛的折磨后,人体的中轴骨和四肢关节结构进行性破坏,最终出现关节骨性僵直,进而导致颈部、腰部和下肢行动能力的减弱,甚至完全丧失活动能力。其中,AS患者中有73%会出现外周关节受累,其中髋关节韧带骨化发生率为25%-50%,而这些患者中有50%-90%会累及双侧髋关节。除此之外,AS伴发全身性并发症,可累及眼睛、肠道、肺、肾、心脏、血管、皮肤、骨和中枢神经等多个重要组织和器官。目前,AS的治疗仅能做到缓解炎症反应,但是缓解的机理尚不清除。对于新骨形成、异常骨化尚无任何治疗手段。因此,对于AS这种疾病需要进一步去了解,需要采取更多的研究手段加深认识。近年来蛋白质组学已成为生命科学的前沿领域之一。蛋白质组学是采用大量精密的数据分析手段,以功能谱和表达谱的形式表现有机体的本质,以达到所有的蛋白基因表达的研究。采用2D-Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白组学研究技术,可以大大提高差异蛋白质的检出率,远远高于传统的固相2D蛋白质组学研究方法,现在已经成为最新的蛋白质组学研究手段。国际上对AS的蛋白质组学研究现在只处在初步阶段,仅有几篇以血液细胞为实验材料的报道。强直性脊柱炎(AS)的蛋白质组学分析比较患者与对照韧带成纤维细胞样细胞的蛋白表达差异,阐明强直性脊柱炎(AS)的发病机制是本课题的研究目的。第一章强直性脊柱炎韧带组织比较蛋白质组学研究利用晚期发生韧带骨化或具有骨化倾向的AS患者的病变韧带组织和正常人韧带组织,首先进行原代成纤维细胞培养,获得了35例AS样本,10例正常对照样本。再采用shot-gun法lable-free方式进行强直性脊柱炎韧带成纤维细胞的比较蛋白质组学研究,寻找存在于AS患者及正常人的韧带组织中的差异表达蛋白。利用蛋白质组学技术,对正常人和患者的蛋白质组进行比较分析,以找出该疾病的特异性蛋白分子,先通过二维液相色谱-质谱技术对样品中的所有蛋白质进行分离,Deltavue软件被用来确定疾病组和正常对照组蛋白表达的“质量”(乙酰化和磷酸化修饰)和“量”(表达)的差异,然后不同的手段,例如质谱鉴定或者是氨基酸序列的推测及构建,以达到确定蛋白质的目的,利用生物信息学方法预测蛋白质结构和可能的功能筛选候选基因;发现β脂肪酸氧化通路中的6个蛋白上调显着(HADHB,ECHS1,ACSL4,ACADM,ACSL1和HADH)而INSR通路(INSR,IRS1,PI3K和PKC)蛋白却下调表达。其次,通过聚合酶链反应、蛋白印迹和质谱等技术对这些蛋白的表达进行了验证。同时,结合临床数据发现,AS患者BMI和BMIZ评分显着低于正常人。以上这些结果提示β脂肪酸氧化通路减少了AS患者体内的脂肪储备,这一点首次通过基础实验数据证明。第二章膜联蛋白A2在强直性脊柱炎致病过程中的功能研究强直性脊柱炎在结构上主要是由于新骨的形成而导致结构损伤,进而使得中轴骨发生骨化强直。骨组织发育需要多种因子共同参与的过程,这些因子包括Osterix蛋白(OSX)、runt相关基因2(Runx2)、转化生长因子p、骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)以及骨形成蛋白2(BMP2)等。调控破骨细胞分化的细胞因子主要包括:骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子(receptoractivator of nuclear factor-kappa B,RANK)及核因子κB受体活化因子配体(receptoractivator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)。目前,对于强直性脊柱炎的体外模型,报道较少,我们以Annexin A2的高表达为指标,发现IL-6诱导原代的韧带成纤维细胞,可以升高Annexin A2,因此采用此种模型进行Annexin A2功能考察。我们用A2蛋白干扰序列转染方法和杂交Western检测方法,考察了BMP2、OCN、OPG、OSX、ERK1/2、RANK以及RANKL的表达水平,结果发现Annexin A2干扰序列能够抑制BMP2、OCN、OPG、OSX的高表达以及ERK1/2磷酸,同时还能够促进RANK、RANKL的表达,因此我们推测Annexin A2干扰序列对于强直性脊柱炎的影响,一方面可以通过抑制的ERK1/2的磷酸化达到控制炎症的作用;另一方面可以通过对骨形成因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)的调节,达到抑制新骨形成的作用;同时Annexin A2干扰序列还能够提高破骨细胞因子RANK、RANKL的表达,促进破骨细胞的生成,从而抑制破骨细胞的增殖和分化。同时我们设计合成了Annexin A2过表达序列,考察了Annexin A2过表达序列对IL-6诱导原代的韧带成纤维细胞的影响,结果发现成骨细胞因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)高表达,同时还抑制了破骨细胞因子(RANK、RANKL)的表达,而在Annexin A2过表达载体植入的原韧带成纤维细胞中加入ERK1/2抑制,Western blot检测发现与ERK1/2抑制相比,成骨细胞因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)的表达有所升高,而破骨细胞因子(RANK、RANKL)的表达有所降低。因此,这一结果提示我们Annexin A2可能是通过ERK1/2信号通路来调控成骨细胞因子和破骨细胞因子的表达。
高梦月, 王云轲, 黄先杰, 张晶, 华子春[3]2018年在《黄色荧光蛋白的结构对Annexin A5凋亡检测功能的影响探究》文中提出细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧, Annexin A5可与PS高亲和力结合,这是其检测凋亡的原理。绿色荧光探针标记的Annexin A5和碘化丙啶联合标记应用于流式细胞术进行细胞凋亡检测,该方法灵敏度高、特异性好、效率高,已成为目前全世界通用的细胞凋亡检测方法。除FITC-Annexin A5外, Annexin A5-EGFP融合蛋白是另一个常用的简单、可信、易于制备的凋亡检测探针。黄色荧光蛋白是绿色荧光蛋白的一种突变体,其荧光向红色光谱偏移。目前,有叁种改良的黄色荧光蛋白:Citrine、Venus、Ypet,这叁种改良的蛋白荧光更亮、更稳定、成熟更快。该文选择Citrine、Venus、Ypet来制备Annexin A5凋亡检测探针,通过原核表达和分离纯化Annexin A5-Citrine、Annexin A5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白,获得了高产量的可溶性蛋白,探究这叁种融合蛋白与凋亡细胞的结合能力,筛选出适用于流式检测的黄色荧光蛋白标记的Annexin A5,为后续研究奠定基础。以pET28a-Annexin A5-EGFP-his重组质粒为模板,利用分子生物学手段又构建了重组质粒pET28a-Annexin A5-Citrine-his、pET28a-Annexin A5-Venus-his、pET28a-Annexin A5-Ypet-his,然后通过Ni柱亲和层析纯化获得了这叁种蛋白,纯度约为90%。该文重点比较了叁者检测细胞凋亡的能力,流式细胞仪检测结果显示, Annexin A5-Citrine、Annexin A5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白均可以识别和标记凋亡细胞,它们与凋亡细胞的亲和力分别是3 113.0 nmol/L、444.3 nmol/L和391.6 nmol/L。叁者与凋亡细胞的亲和力差异很大,通过对Citrine、Venus、Ypet的氨基酸序列进行分析,该文初步发现了决定叁个黄色荧光蛋白与凋亡细胞亲和力的关键氨基酸。
陈文炜[4]2016年在《原发性肝细胞癌根治术后近期复发转移相关蛋白Annexin A4的临床和基础研究》文中指出原发性肝细胞癌(HCC,简称肝癌)是我国最常见的致命性恶性肿瘤之一,其病死率居恶性肿瘤死因的第二位。手术切除仍然是是目前原发性肝癌治疗的首选治疗方式,但是约有70%的患者术后会出现肝内复发或肝外的转移,其中大多数发生术后早期,这是直接导致肝癌患者预后不佳的最主要原因。因此,寻找切实有效的预测肝癌早期复发转移的生物分子标记,阐明其与肝癌复发转移的关系及相关分子机制,并以此为靶点进行针对性干预治疗,对于改善患者预后具有重要意义。Annexin A4蛋白属于膜联蛋白Annexins家族一员。目前大量研究证实其在卵巢癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌等多种肿瘤异常表达,与肿瘤发生发展密切相关。我们课题组前期开展的蛋白质组学研究结果显示,Annexin A4蛋白与肝癌近期复发转移有关,查阅相关文献发现其在肝癌中研究较少,而且具体作用机制如何还不明确。目的:1、检测Annexin A4蛋白在不同时期复发转移患者肝癌组织中的表达,结合临床病理资料,评价其对肝癌术后早期复发转移以及远期预后的预测价值;2、研宄Annexin A4基因过表达或沉默对于肝癌细胞增殖、凋亡、周期以及迁移侵袭等生物学行为的影响;3、初步探讨Annexin A4促进肝癌细胞侵袭转移可能的分子机制。方法:1、收集141例手术切除并经病理证实的临床肝癌组织标本,根据肝癌患者术后复发转移时间将其分为1年内复发转移组,1~2年复发转移组以及2年内未复发转移组,采用Q-PCR、Western blot、组织芯片及免疫组化技术检测Annexin A4在不同分组肝癌组织中的表达,结合临床病理资料及随访信息,研究Annexin A4与临床病理特征的相关性,探讨其对肝癌术后早期复发转移及总体生存率的预测价值;2、Q-PCR和Western blot检测Annexin A4在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达;采用质粒转染和sh RNA介导的RNAi技术,构建Annexin A4基因过表达和稳定沉默的肝癌细胞系;CCK-8、流式细胞术,Transwell小室实验检测Annexin A4基因过表达或沉默对肝癌细胞增殖、凋亡、周期以及迁移侵袭等生物学行为的影响;裸鼠皮下成瘤以及原位移植(肿瘤组织接种到肝脏)实验,在体观察Annexin A4基因过表达和沉默对肝癌细胞致瘤能力以及体内转移能力的影响;3、比较蛋白质组学技术分析Annexin A4基因稳定转染或沉默后肝癌细胞的蛋白质表达谱变化,筛选与目的基因关联蛋白质。Q-PCR和Western blot对所获得的差异蛋白进行验证,初步探讨Annexin A4基因介导肝癌侵袭转移的分子机制。结果:1、Q-PCR和Western blot结果显示Annexin A4在1年内复发转移组和1~2年复发转移组的肝癌组织中m RNA及蛋白表达水平较2年内未复发转移组均有显着上调(P<0.05),与我们此前的蛋白质谱分析结果一致。构建包含141例临床肝癌组织样本的组织芯片,免疫组化检测并结合临床病理资料分析,结果表明Annexin A4高表达与门静脉癌栓(P=0.03)及更高的BCLC分期(P=0.002)等侵袭性临床病理特征相关,而与年龄、性别、血清AFP水平、HBV-DNA、肝硬化、肿瘤分化程度、肿瘤数目、肿瘤直径大小、肿瘤包膜无关(P均>0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明高表达Annexin A4患者具有更高的转移复发率(Log-rank test,P<0.001)及更差的总体生存率(Log-rank test,P<0.001)。COX多因素分析显示Annexin A4是一个影响肝癌术后复发(P=0.032)与总体生存(P=0.009)的独立危险因素。2、Q-PCR和Western blot结果表明Annexin A4在不同转移潜能的肝癌细胞系中表达存在差异,其在低转移潜能的Hep G2细胞中表达量最低,在高转移潜能的MHCC-97H细胞中表达量最高。在此基础上,利用质粒转染和RNAi技术成功构建高表达Annexin A4的Hep G2细胞和稳定沉默Annexin A4表达的MHCC-97H细胞,细胞功能学试验结果显示,在Hep G2细胞中上调Annexin A4表达能显着增强肝癌细胞的体外迁移与侵袭能力,在MHCC-97H细胞中下调Annexin A4表达肝癌细胞的体外迁移与侵袭能力显着降低,而Annexin A4过表达或沉默对肝癌细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为无明显影响;裸鼠皮下瘤以及原位移植实验结果显示,沉默Annexin A4表达不影响MHCC-97H细胞的皮下肿瘤生长速度,但可抑制肝内种植瘤发生远处肺转移。本研究中未观察到Annexin A4基因过表达对Hep G2细胞体内侵袭转移的影响,考虑与ATCC来源的Hep G2细胞较差的致瘤性及较低的转移能力有关。3、蛋白质组学质谱分析结果显示,Annexin A4基因的过表达或沉默引起一系列相关蛋白在数量和表达水平上发生相应的变化,其中包括N-Cadherin和Vimentin:过表达Annexin A4的Hep G2细胞与对照组细胞相比,N-Cadherin和Vimentin表达水平分别上调1.85倍和1.53倍;沉默Annexin A4的MHCC-97H细胞与对照组细胞相比,N-Cadherin和Vimentin分别下调了0.45倍和0.39倍,这一结果提示Annexin A4可能诱导了肝癌细胞发生EMT。光镜下细胞形态学观察发现,Hep G2细胞过表达Annexin A4后,细胞由多边形向梭形间质细胞形态转变,而MHCC-97H细胞沉默Annexin A4表达后,细胞出现从梭形的间质细胞形态向鹅卵石型的上皮细胞形态转变。Q-PCR和Western blot结果显示过表达Annexin A4的Hep G2细胞中,N-cadherin和Vimentin表达上调,而E-cadherin表达下降,伴有EMT转录因子Zeb1的表达增加。而与之相反的是,干扰Annexin A4表达的MHCC-97H细胞中,N-cadherin和Vimentin表达下降,而E-cadherin表达升高,同时伴有转录因子Zeb1的表达下调。而其他EMT转录调控因子Snail、Slug、Twist等,随着Annexin A4基因表达的改变其表达水平未见明显变化。结论:1、Annexin A4异常高表达与肝癌患者的术后预后密切相关,可以作为一个评估肝癌术后早期复发转移风险的肿瘤分子标记物;2、Annexin A4对肝癌细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为无明显影响,但可显着增强肝癌细胞的侵袭转移能力;3、Annexin A4可能通过调控转录因子Zeb1的表达诱导肝癌细胞发生EMT进而促进肝癌细胞的侵袭转移能力,但是Annexin A4具体通过何种信号转导机制调控Zeb1有待后续进一步研究。
李秀娟[5]2017年在《食管鳞癌侵袭转移相关分子靶标的筛选和功能研究》文中认为目的:1)建立不同侵袭转移潜能人食管鳞癌细胞亚系,用基因芯片筛选差异基因,建立食管鳞癌侵袭转移相关基因表达谱;2)验证部分差异基因在不同侵袭转移潜能食管鳞癌细胞和组织的表达,探讨HSP90α、Annexin A1和14-3-3β在新疆哈萨克族食管鳞癌的表达和病理意义;3)研究HSP90AA1沉默对食管鳞癌细胞生物学行为的影响和机制。方法:1)采用Transwell侵袭小室对Eca109母系(Eca109-T0)进行筛选,建立高侵袭转移潜能食管鳞癌细胞亚系Eca109-T4;体、内外比较Eca109-T0、Eca109-T4、CE81T-0和CE81T-4各系ESCC迁移和增殖能力;以Eca109-T0和Eca109-T4为对象,提取总RNA,分别用Cy5和Cy3荧光标记成cDNA探针,与基因芯片Affymetrix Gene Chip?Human Genome U133 Plus 2.0 Arry杂交,筛选出不同侵袭转移潜能食管鳞癌差异表达基因;对差异基因进行GO和KEGG聚类分析;2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化验证部分差异基因表达;在细胞水平验证基因(HSP90AA1、ANXA1、YWHAB、CXCR7、SDC2和TNFRSF10DmRNA)和蛋白(HSP90α、AnnexinA1、14-3-3β和CXCR7)表达差异:采用免疫组化验证蛋白(HSP90α、AnnexinA1和14-3-3β)在86对新疆哈萨克族食管鳞癌和癌旁组织中的表达,分析各蛋白表达水平与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、性别、年龄、大体类型、肿瘤位置和大小等临床病理参数的相关性;3)采用RNAi干扰技术下调CE81T-4细胞中HSP90AA1的表达,绿色荧光、qRT-PCR及Western blot检测转染效果,MTT法检测CE81T-4细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测MET、MMP2、ERK和P-ERK蛋白的表达变化;qRT-PCR检测MET和MMP2mRNA表达差异;复制裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤增殖速度和瘤体重量。结果:1)Transwell小室筛选出Eca109-T4高侵袭转移潜能人食管鳞癌细胞亚系,体内外生物学特性比较结果:Eca109-T4、CE81T-4的增殖、迁移及体外成瘤能力均高于Eca109-T0和CE81T-0;Eca109-T4的迁移、浸润能力高于CE81T-4组;对Eca109-T0和Eca109-T4基因芯片检测,共筛选出326个差异基因,其中Eca109-T4组上调123个,与Eca109-T0比较下调表达203个;GO聚类分析显示差异基因主要定位在细胞质、细胞核和细胞液;分子功能涉及蛋白结合,金属离子结合和DNA结合等;参与细胞信号转导、转录、细胞凋亡、细胞增殖、细胞黏附等生物学过程;KEGG聚类分析显示差异基因主要参与肌动蛋白细胞骨架调节、mapk通路和癌症通路等信号转导途径;2)验证结果与基因芯片筛选结果基本一致,qrt-pcr检测:hsp90aa1、ywhab、cxcr7和sdc2mrna在eca109-t4、ce81t-4的表达高于在eca109-t0、ce81t-0的表达(p<0.05);tnfrsf10dmrna在ce81t-4组低于在eca109-t4的表达(p<0.05);annexina1在eca109-t0、ce81t-0的表达高于在eca109-t4、ce81t-4表达(p<0.05);westernblot结果:hsp90α、14-3-3β、cxcr7蛋白在eca109-t0和ce81t-0低于在eca109-t4和ce81t-4的表达(p<0.05),annexina1蛋白在eca109-t0、ce81t-0的表达高于在eca109-t4和ce81t-4的表达(p<0.05);hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在ce81t-4表达高于在eca109-t4的表达(p<0.05);免疫组化结果:hsp90α、14-3-3β在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中阳性表达率高于在癌旁组织的表达(87.2%﹠18.6%,80.23%﹠41.86%,p=0.000,0.0002),annexina1在食管鳞癌组织的表达低于在癌旁组织表达(32.6%﹠59.3%,p=0.0002);hsp90α与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移相关(p=0.024、0.021、0.011),与患者性别、年龄、类型、位置和肿瘤大小无关(p>0.05);annexina1与分化程度和淋巴结转移相关(p=0.037、0.014),与浸润深度、年龄、性别、类型、肿瘤大小和位置等其他病理参数无关(p>0.05);14-3-3β表达与浸润深度和分化程度有关(p=0.008、0.035),与年龄、性别、淋巴结转移、类型、位置和肿瘤大小无关(p>0.05);3)hsp90aa1-rnai干扰ce81t-4细胞后可见到绿色荧光,hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在实验组(hsp90aa1-rnai)的表达低于阴性组对照组(nc-rnai)和正常培养组(nc)(p<0.05),证实有效下调hsp90aa1表达;mtt检测0h和24h两个时间点各组无差异(p>0.05),在48h、72h和96hhsp90aa1-rnai组细胞增殖被抑制(p>0.05);hsp90aa1-rnai组细胞周期阻滞于g0/g1期,hsp90aa1下调诱导细胞凋亡,凋亡率在hsp90aa1-rnai、nc-rnai和nc组分别为(27.30±4.33)%、(5.63±1.12)%、(10.20±2.04)%(p<0.05);划痕后24h、48h和72h各时间点hsp90aa1-rnai组细胞的迁移距离减小(p<0.05);transwell侵袭实验结果:hsp90aa1-rnai组侵袭细胞数目降低(p<0.05);westernblot检测hsp90aa1-rnai组的met、mmp2和p-erk蛋白表达降低(p<0.05),erk在各组表达无差异(p>0.05);qrt-pcr检测met、mmp2mrna在hsp90aa1-rnai组表达降低(p<0.05);hsp90aa1-rnai组皮下移植瘤增殖速度慢,重量低(p<0.05)。结论:1)建立的不同侵袭转移潜能食管鳞癌细胞株模型,为后续研究提供了模型;侵袭转移差异基因表达谱的建立和生物信息学分析为深入转移相关研究提供了丰富的信息;2)hsp90aa1、anxa1、ywhab、cxcr7和sdc2与食管鳞癌侵袭转移有关;hsp90α、14-3-3β在食管鳞癌高表达,它们与浸润深度呈正相关,与分化程度呈负相关;hsp90α和淋巴结转移呈正相关;annexina1在食管鳞癌中低表达,在分化程度高的,无淋巴结转移的食管鳞癌中Annexin A1表达上调;HSP90α、Annexin A1及14-3-3β的表达可一定程度反映食管鳞癌的分化程度、侵袭深度和有无淋巴结转移,有望成为食管鳞癌早期诊断,预测转移,侵袭和分化程度的分子标志物;2)RNAi技术可有效抑制CE81T-4细胞中靶基因HSP90AA1表达,HSP90AA1下调表达使CE81T-4细胞周期阻滞于G0/G1期,促进凋亡,抑制增殖、侵袭和迁移能力,可能通过下调P-ERK、MET和MMP2机制介导的。
罗威[6]2007年在《EB病毒LMP1介导PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化的分子机制研究》文中提出EB病毒与多种肿瘤的发生发展密切相关，如伯基特淋巴瘤、霍杰金氏淋巴瘤，鼻咽癌、乳腺癌和胃癌等上皮性肿瘤。作为一个外界环境致病因子，对其基因组功能分析发现其编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)是一个重要的瘤蛋白。在LMP1的羧基末端存在叁个功能性结构域CTAR1、CTAR2和CTAR3，它们通过募集信号衔接分子TRAFs、TRADD和JAK3异常激活NFκB、AP-1和STAT叁条信号转导通路。激活的转录因子NFκB、AP-1和STAT进而调节下游靶基因EGFR、cyclin D1、MMP9、survivin等的表达和磷酸化。在对EB病毒致瘤蛋白LMP1激活宿主单条信号通路研究的基础上，新近我们研究小组采用新的研究策略——信号转导蛋白质组学，简称为信号组学(signalomics)，初步构建了EB病毒瘤蛋白LMP1介导的信号转导通路虚拟网络。在上皮来源的鼻咽癌细胞中，通过分析磷酸化蛋白的蛋白组学，即比较不同细胞的二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2DE)蛋白谱，获得差异蛋白点，再用质谱(MALDT-TOF-MS)技术和ESI多肽序列进行鉴定，发现了25个受LMP1调节的新的磷酸化蛋白。并以鉴定的蛋白质分子Annexin A2为代表，建立LMP1与下游功能效应蛋白质分子的关系。前期实验证明了“LMP1→PKC→p-ser-Annexin A2”这条新的信号通路；而且发现EBV致瘤蛋白LMP1介导蛋白激酶PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化，使Annexin A2移位入核，并确定LMP1调节Annexin A2的入核是能量和温度依赖性的。PKC是细胞内一类非常重要的钙、磷脂依赖性蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶，PKC各同工酶的分布具有特殊性，并在细胞功能方面各自发挥着不同的作用。Annexin A2是Annexins这类钙离子依赖性的蛋白家族中的一员，Annexin A2与细胞的转化和肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤细胞中均存在Annexin A2蛋白表达和磷酸化水平的上调。在细胞内，Annexin A2以36kD的单聚体形式和与p11结合形成AnxⅡ_2／p11_2 94kD的四聚体形式存在。PKC是除NFκB、JNK、JAK／STATs、MAPK和PI3K／Akt外，我们首次发现的可由LMP1介导的另外一个蛋白激酶。Annexin A2是PKC的下游效应分子，其磷酸化是细胞恶性转化的重要分子机制之一。在上皮来源的鼻咽癌细胞中，对LMP1介导PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化分子机制及其生物学功能的研究，有助于进一步完善这条新的信号通路。为此我们确定了“EB病毒LMP1介导PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化的分子机制研究”这一课题，采用LMP1阴性的CNE1和LMP1稳定表达的CNE1-LMP1鼻咽癌细胞系为主要实验材料。我们通过PKC Kinase Activity Assay Kit(Non-Radioactive，Stressgen)特异检测经过不同处理细胞的PKC激酶活性；同时使用抗丝氨酸抗体进行IP-Western blotting，检测细胞内Annexin A2丝氨酸磷酸化水平的变化。使用PKC激活剂TPA、阻断LMP1表达的脱氧核酶Dz1和PKC特异性活性抑制剂发现，PKC的活化状态与Annexin A2丝氨酸磷酸化状态的变化趋势一致，因此得出结论：LMP1确实可通过PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化，进一步确定了这条通路的存在。PKC属于“IP3、DAG信号系统”，磷脂酰肌醇磷脂酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)是PKC的上游关键性激酶，PLC同功酶中以PLC-β和PLC-γ的功能最为重要。使用特异针对PLC-β和PLC-γ的激酶活性抑制剂U73122，并以结构相似但无活性的小分子U73343和载体DMSO作为对照，研究PI-PLC激酶对PKC激酶和PKC下游效应蛋白Annexin A2丝氨酸磷酸化水平的影响。PI-PLC活性小分子抑制剂U73122能降低两种细胞系的PKC激酶活性，进而降低PKC下游蛋白Annexin A2的丝氨酸磷酸化水平。证实了LMP1介导PI-PLC调控PKC激酶活性和Annexin A2丝氨酸磷酸化水平。前期实验通过使用特异针对PKCα和PKCβ的抑制剂，证实了LMP1可能主要通过PKCα和PKCβ调控Annexin A2丝氨酸磷酸化。我们进一步研究PKC亚型对Annexin A2丝氨酸磷酸化的调控机制。通过免疫共沉淀结合Western-Blotting，发现在细胞内PKCα和PKCβ均可直接与Annexin A2结合；而且LMP1对PKCα、PKCβ的激酶活性都有上调的作用，但以对PKCβ的调控更显着。继而我们在CNE1和CNE1-LMP1细胞中转染PKCα、PKCβ特异性shRNA质粒，特异且有效地阻断PKCα、PKCβ的蛋白表达，发现在两种细胞系中PKCαshRNA和PKCβshRNA质粒均能有效降低p-ser-Annexin A2水平，证实在CNE1和CNE1-LMP1细胞内PKCα和PKCβ两种亚型均调控Annexin A2的丝氨酸磷酸化。进一步我们进行了重组活性激酶PKC和纯化的GST-annexin A2之间的体外蛋白激酶反应。结果表明，活性PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ均可丝氨酸磷酸化Annexin A2，从而在细胞外水平提供了PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ使Annexin A2丝氨酸磷酸化的新证据。我们前期研究发现LMP1调节Annexin A2丝氨酸磷酸化而移位入核。在Annexin A2的氨基末端包含有体内外证实的PKC调节的丝氨酸磷酸化位点Ser25和体外证实的丝氨酸磷酸化位点Ser11。确定了在CNE1和CNE1-LMP1细胞中，PKCα、PKCβ均可调控Annexin A2的丝氨酸磷酸化后，我们构建了pEGFP-AnxⅡ野生型表达质粒和叁个突变质粒(分别将Ser11、Ser25、Ser11和Ser25均突变成谷氨酸)，以进一步确定Annexin A2的具体丝氨酸位点的磷酸化对其入核的影响。通过免疫荧光和激光共聚焦显微镜发现Annexin A2丝氨酸25位的磷酸化影响其入核。进一步通过胞浆胞核分开抽提Western-Blotting，定量检测野生型和叁种突变质粒表达蛋白的细胞分布予以了证实。前期实验已经表明PKCαshRNA、PKCβshRNA质粒特异降低PKCα、PKCβ的蛋白表达水平，并进一步降低p-ser-Annexin A2水平，而且只有pEGFP-AnxⅡWT和S11E质粒的表达蛋白可以入核。以CNE1-LMP1细胞为代表，将WT和S11E质粒分别与PKCαshRNA和／或PKCβshRNA质粒共转染CNE1-LMP1细胞，依次与WT和S11E质粒转染CNE1-LMP1细胞的胞浆、胞核蛋白中EGFP-Annexin A2融合蛋白的分布情况比较。结果表明，PKCαshRNA、PKCβshRNA质粒均能降低野生型和S11E突变质粒表达蛋白的入核程度，进一步证实了p-ser-Annexin A2水平影响Annexin A2的入核，同时提示我们PKCα、PKCβ确实可以通过调控Annexin A2丝氨酸25位磷酸化影响其入核。Annexin A2磷酸化而入核，入核后可提高DNA聚合酶α的活性，从而促进DNA复制和细胞增殖。我们使用CellTiter-Glo~(?) Luminescent Cell Viability Assay(Promega)，检测Annexin A2丝氨酸25位磷酸化入核后对细胞增殖的影响。结果表明两种细胞中转染了pEGFP-AnXⅡWT和S11E质粒的细胞增殖速率明显快于转染了S25E和S11ES25E质粒的细胞。提示我们由于Annexin A2丝氨酸25位突变后不能被PKC正常磷酸化，影响Annexin A2入核发挥促进细胞增殖的功能，从而进一步确定了Annexin A2丝氨酸25位磷酸化对其生物学功能的重要性。Annexin A2丝氨酸25位磷酸化与其入核密切相关，而丝氨酸11位没有明显影响。有研究发现，四聚体形式的Annexin A2在细胞膜上被PKC磷酸化后，有利于四聚体从细胞膜上解离下来和其自身解离，而且这种解离主要由Annexin A2的丝氨酸11位磷酸化所决定，可能是因为Ser11位于配体蛋白p11结合序列(Annexin A2的氨基端1-13位)内。LMP1是否介导PKCα和PKCβ使Annexin A2丝氨酸11位磷酸化，从而调节Annexin A2四聚体形式的解离和从细胞膜上的释放，有待我们进一步的研究。综上所述，通过本研究我们发现在鼻咽癌细胞中，EB病毒LMP1可通过PI-PLC上调PKC激酶活性和Annexin A2丝氨酸磷酸化水平，即进一步确定了“LMP1→PI-PLC→PKC→p-ser-Annexin A2”这条新的信号通路的存在。细胞内实验证明了LMP1介导PI-PLC-PKCα／PKCβ信号通路增加Annexin A2丝氨酸磷酸化水平，并且主要通过激活PKCβ；同时活性激酶PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ可以体外丝氨酸磷酸化Annexin A2，从细胞外水平证明了Annexin A2是PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ的直接蛋白底物。Annexin A2在细胞核内促进DNA复制和细胞增殖；通过将Annexin A2氨基端丝氨酸11位和丝氨酸25位突变成谷氨酸，使这两个位点不能被PKC正常磷酸化，进一步证明Annexin A2丝氨酸25位的磷酸化影响其入核和促进细胞增殖的生物学功能。我们确定了“LMP1→PI-PLC→PKCα／PKCβ→p-ser25-Annexin A2→Annexin A2入核→促进细胞增殖”这条新的信号通路，发现了两个受LMP1调控的新的蛋白激酶PI-PLC和PKC；深入阐明了Annexin A2的磷酸化和入核机制，证明了LMP1介导PI-PLC-PKCα／PKCβ使Annexin A2丝氨酸25位磷酸化及入核，进而影响Annexin A2在细胞核内发挥促进细胞增殖的生物学功能，证明了Annexin A2是LMP1新的下游靶分子。从而为LMP1促进细胞增殖的功能提供了新的实验证据，为完善EB病毒致瘤蛋白LMP1的致瘤网络提供了新的实验证据。
王丽[7]2017年在《Annexin A7和CAP1对肿瘤细胞粘附分子表达调控及生物学行为的影响》文中指出背景:原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前致死率最高的上皮来源恶性肿瘤之一,近年来在我国的发病率依然居高不下。淋巴道转移是恶性肿瘤最早的出现的转移方式,是造成肝癌高侵袭、高复发以及预后差的主要原因之一。国内外许多研究结果表明淋巴道转移机制受许多基因调控,它们或被激活或被抑制,或相互协调或互相拮抗,其中包括细胞增殖、粘附、迁移、细胞外基质降解等多个阶段与环节。膜联蛋白A7(Annexin A7)是本课题组前期发现的潜在决定小鼠肝癌淋巴道转移的关键基因之一,对各种肿瘤细胞生长、分化、增殖、分泌、侵袭、迁移乃至凋亡能力均可产生影响。同时Annexin A7基因是ca2+磷脂结合蛋白,具有ca2+依赖膜融合活性,可促进膜聚集、融合、粘着、运输等,还可激活GTP酶,介导ca2+/GTP信号转导通路。腺苷酸环化酶联合蛋白(adenylate cyclase-associated protein 1,CAP1)最早发现于酵母,在其中可调节Ras/c AMP信号通路,并且与哺乳动物CAP1具有相同作用调节肌动蛋白的周转与重组,对细胞迁移产生影响。近年来关于CAP1与肿瘤转移关系的研究逐渐深入,但似乎在不同肿瘤细胞中对于细胞生物学功能的影响不尽相同。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶,在许多上皮来源的肿瘤细胞中过表达,如乳腺癌、结肠癌、口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌和胃癌等,可能在肿瘤生长、增殖、侵袭、转移及血管形成中产生影响。Src为SRC酪氨酸激酶家族成员,参与细胞生长、分化、粘着、增殖、凋亡及细胞运动等过程。桩蛋白(Paxillin)是一种主要定位于黏着斑的关键衔接蛋白信号分子,是FAK下游重要的焦点粘附调节蛋白之一,其异常表达与肿瘤的发生、增殖、粘附、浸润、骨架重组及转移能力的改变密切关联。E-钙黏蛋白(E-cadherin,CDH1)是与肿瘤转移侵袭密切相关的一种钙粘蛋白,可参与细胞极性、细胞形态与组织结构完整性的维持,与肿瘤细胞的良恶性及转移程度呈负相关。目的:通过细胞脂质体转染、qRT-PCR、Western Blot等技术观察对比下调小鼠肝癌Hca-P细胞Annexin A7与CAP1基因后观察其对细胞黏附相关分子FAK、Src、Paxillin、E-cadherin基因及蛋白表达水平的调控。通过CCK-8增殖检测、流式细胞仪凋亡检测、小鼠淋巴结粘附以及Transwell小室等实验方法观察CAP1下调对Hca-P细胞生物学行为的影响。对比Annexin A7与CAP1下调后对彼此基因和蛋白表达水平的影响以及二者在Hca-P细胞的表达定位。方法:1.构建PGPUP-GFP-neo-sh RNA-Annexin A7和PGPUP-GFP-neo-sh NC表达载体,稳定转染至小鼠Hca-P细胞,获得Annexin A7下调表达及无关序列Hca-P细胞株,应用qRT-PCR、Western Blot技术验证Annexin A7基因下调对CAP1、FAK、SRC、E-cadherin基因及蛋白表达水平的影响。2.构建PGPUP-GFP-neo-sh RNA-CAP1和PGPUP-GFP-neo-sh NC表达载体,稳定转染至Hca-P细胞,获得CAP1下调表达及无关序列Hca-P细胞株,应用qRT-PCR、Western Blot技术验证CAP1基因下调对FAK、Src、Paxillin、E-cadherin基因及蛋白表达水平的影响。3.获得CAP1下调表达及无关序列Hca-P细胞株后,应用CCK-8增殖检测、流式细胞仪凋亡检测、小鼠淋巴结粘附以及Transwell小室等实验方法,对比CAP1下调组与对照组增殖、凋亡、粘附、侵袭、迁移能力,分析CAP1对Hca-P细胞生物学行为的影响。4.应用qRT-PCR、Western Blot技术验证Annexin A7基因下调对CAP1基因及蛋白表达水平的影响。采用细胞免疫荧光技术检测Annexin A7与CAP1表达的共定位。结果:1、在mRNA表达水平上,Annexin A7在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低82.86%和82.78%(P<0.05),而在A7无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。FAK、Src基因在ShRNA-A7细胞组表达分别为A7无关序列组及Hca-P组的1.88倍、1.67倍和1.78倍、1.54倍(P<0.05),二者在A7无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。E-cadherin基因在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低49.88%和43.01%(P<0.05),在A7无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。在蛋白质表达水平上,Annexin A7在ShRNA-A7细胞组中蛋白表达水平较A7无关序列组及Hca-P细胞组降低62.75%和60.34%(P<0.05),而在Hca-P与A7无关序列组间不存在明显差异(P>0.05)。FAK及Src在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列组及Hca-P组蛋白表达量上升1.80倍、1.52倍及1.59、1.58倍(P<0.05),E-cadherin蛋白在ShRNA-A7细胞组较A7无关序列组与Hca-P组下降54.27%和59.11%(P<0.05),但叁种蛋白在Hca-P与A7无关序列组间不存在明显差异(P>0.05)。2、在mRNA表达水平上,CAP1在ShRNA-CAP1细胞组较CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低60.73%和65.25%(P<0.05),而在CAP1无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。FAK、Src、Paxillin基因在ShRNA-A7细胞组表达分别为A7无关序列组及Hca-P组的2.47倍、2.18倍和1.64倍、1.76倍及1.67倍、1.58倍,叁者在CAP1无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。E-cadherin基因在ShRNA-CAP1细胞组较CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组分别降低40.11%和43.01%(P<0.05),在CAP1无关序列组及Hca-P组间差异不明显(P>0.05)。在蛋白质表达水平上,CAP1在ShRNA-CAP1细胞组中蛋白表达水平较CAP1无关序列组与Hca-P组降低50.83%和50.29%(P<0.05),而在Hca-P与CAP1无关序列组间差异不明显(P>0.05)。FAK、SRC及Paxillin在ShRNA-CAP1细胞组较CAP1无关序列组和Hca-P组蛋白表达量分别升高1.64倍和1.60倍、1.67倍和1.61倍、1.43倍和1.39倍(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平在ShRNA-CAP1组较CAP1无关序列组及Hca-P组均有下降,下降幅度为39.6%及48.22%(P<0.05),但FAK、SRC、Paxillin及E-cadherin四者在Hca-P细胞组与CAP1无关序列细胞组之间表达量不存在明显差异(P>0.05)。3、CCK-8增殖实验分别检测Hca-P细胞组、ShRNA-CAP1细胞组与CAP1无关序列细胞组在0h、24h、48h、72h、96h等时间段的吸光值,其中ShRNA-CAP1细胞组各时间点吸光值均数±标准差分别为0.106±0.015、0.152±0.010、0.522±0.049、0.651±0.040、0.651±0.040、0.708±0.037;CAP1无关序列细胞组各时间点吸光值均数±标准差分别为0.095±0.017、0.144±0.024、0.374±0.027、0.485±0.018、0.535±0.039;Hca-P细胞组各时间点吸光值均数±标准差分别为0.101±0.014、0.153±0.006、0.410±0.021、0.553±0.022、0.601±0.030,结果提示Hca-P、ShRNA-CAP1、CAP1无关序列叁种细胞数量在24小时内不存在显着差异(P>0.05),自48小时起开始产生明显差异,每个时间点差异均显着(P<0.05),且ShRNA-CAP1细胞增殖能力始终高于CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组,CAP1无关序列组与Hca-P组的增殖能力在各时间段无显着差异(P>0.05)。4、流式细胞仪分别检测Hca-P细胞组、ShRNA-CAP1细胞组与CAP1无关序列细胞组早期凋亡能力,结果显示叁组细胞早期凋亡细胞比例分别为6.33%±0.17%,3.41%±0.22%及6.43%±0.25%,提示在CAP1基因低表达后,ShRNA-CAP1细胞组早期凋亡细胞数低于CAP1无关序列及Hca-P细胞组。5、淋巴结粘附实验检测Hca-P组、ShRNA-CAP1组与CAP1无关序列组细胞淋巴结粘附能力,叁种细胞组粘附于淋巴结的细胞数目分别为255.67±28.43、734.33±67.50、228.33±20.03,提示在CAP1基因低表达后,ShRNA-CAP1细胞组对于小鼠淋巴结的黏附能力强于Hca-P细胞组与CAP1无关序列细胞组。6、Transwell小室细胞侵袭实验中Hca-P细胞组、ShRNA-CAP1细胞组与N2-Control细胞组穿透小室膜的细胞数目均数±标准差分别为61.00±8.51、173.00±18.03、58.00±6.40,提示ShRNA-CAP1细胞组穿过小室的细胞数目明显多于CAP1无关序列细胞组及Hca-P细胞组,CAP1无关序列细胞组与Hca-P细胞组对比则差异不显着(P>0.05)。7、对Annexin A7与CAP1相互关系的分析提示,在Annexin A7基因表达下调后,CAP1基因与蛋白表达水平均降低,其中,ShRNA-A7细胞组与A7无关序列细胞组对比,CAP1基因下调至原水平的17.21%(P<0.05),CAP1蛋白表达水平下调至原水平的46.86%(P<0.05),表明Annexin A7基因低表达后,CAP1基因与蛋白水平均随之下降。另外通过免疫荧光方法证明Annexin A7与CAP1均主要在在Hca-P细胞浆内表达,少量表达于细胞核,由图像结果推测两种蛋白可能在细胞浆及邻近细胞内膜处共定位。结论:Annexin A7与CAP1基因分别可调控FAK、SRC、Paxillin、E-cadherin的表达,在mRNA和蛋白质水平,FAK、SRC、Paxillin均随Annexin A7与CAP1基因的下调而高表达,而E-cadherin则在上述两基因表达下调后低表达。CAP1低表达后,Hca-P细胞增殖、淋巴结黏附、侵袭能力均有所上升,早期凋亡能力下降;Annexin A7基因下调表达后,CAP1在mRNA和蛋白质水平随之下调,且两基因在Hca-P细胞内表达位置基本一致,可能存在共定位。Annexin A7基因可能与CAP1基因存在一定分子机制的关联,可对细胞粘附转移分子产生一致性影响,并对肝癌Hca-P细胞的生物学行为的产生密切相关。
沈晓宇, 姜英, 武昕[8]2017年在《Annexin-A1和Annexin-A2在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的表达及意义》文中指出目的:探讨Annexin-A1及Annexin-A2在外阴硬化性苔藓和外阴鳞癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化检测25例外阴鳞癌、20例外阴硬化性苔藓、15例正常外阴皮肤组织中Annexin-A1及Annexin-A2的表达,并收集外阴鳞癌患者的临床病理资料进行分析。结果:Annexin-A1及Annexin-A2在外阴鳞癌中表达明显低于外阴正常皮肤(P<0.05)。Annexin-A1在外阴鳞癌Ⅰ期中平均光密度值为(26.52±2.98),Ⅱ+Ⅲ期的平均光密度值为(18.55±1.94),两者相比有统计学差异(P<0.05),在年龄及分化程度上Annexin-A1表达无差异(P>0.05)。Annexin-A2在外阴鳞癌组织中年龄、临床分期及分化程度上的表达差异无统计学意义(P>0.05)。在外阴硬化性苔藓中Annexin-A1表达与正常皮肤相比无统计学上的差异;Annexin-A2表达下降,与正常皮肤相比差异有统计学意义(P<0.05),但Annexin-A2从正常皮肤到硬化性苔藓细胞浆内蛋白减少或消失,只表现为膜阳性。结论:Annexin-A2表达下调与外阴硬化性苔藓发生有关。Annexin-A1及Annexin-A2低表达与外阴鳞癌的发生、进展有关。
龚晓芸[9]2016年在《利用离子淌度质谱解析配体对蛋白质结构的影响》文中研究说明离子淌度质谱(ion mobility mass spectrum,IM-MS)即将离子淌度分离技术与质谱联用的一项新型分析方法,已成为一种强有力的结构生物学分析工具,能同时测定分析物的结构、拓扑学结构、动态过程以及组成等。本论文以膜联蛋白A5及其同质二聚体diannexin和维生素B12结合蛋白F为材料,探究不同配体如钙离子和维生素B12对蛋白质结构的影响。由电喷雾电离产生的蛋白质离子在离子淌度质谱仪的漂移管中与气体发生碰撞而导致蛋白质被活化,促使其构象失去天然状态发生去折迭等变化,且离子在漂移管中会根据他们的质量、电荷、大小被逐渐分离。在本论文中我们采用Waters Synapt G2-Si HDMS质谱仪采集离子的漂移时间,并经过许多已知理论碰撞横截面积的蛋白质标准品做校正后得到离子天然构象与去折迭状态的碰撞横截面积。实验发现:未受碰撞活化的离子,其测得的碰撞横截面积与预期的处于天然状态的蛋白质的碰撞横截面积非常一致。而当碰撞能量增加,离子被活化导致构象发生变化,且构象去折迭的程度与蛋白质复合物分子内或分子间的非共价相互作用的稳定性有关。以上结果表明蛋白质与配体结合后能使其在气相中的结构稳定性大大增强。
刘小花[10]2012年在《Annexin A2、CD147、MMP-2在宫颈鳞癌组织中的表达及意义》文中提出背景和目的：宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中居第二位,近年来随着宫颈脱落细胞学检查的广泛应用,宫颈癌的检出率大大增加。而宫颈鳞癌是宫颈癌中最常见的病理类型,具有侵袭性和转移性强的特点,虽然传统的手术、放化疗等多种治疗措施的综合应用已经显着的提高了患者的生存质量,但宫颈癌的浸润和转移仍是许多患者治疗失败和死亡的主要原因。目前,宫颈癌的诊断已不是难事,继续认识宫颈鳞癌肿瘤细胞的生物学行为,探讨其浸润和转移的机制,寻找抑制其浸润和转移的特定基因靶点,开发新的抗肿瘤生物工程药物,是目前的亟待要解决的重点问题。肿瘤的发生发展、浸润、转移是一个多阶段、多步骤、多因素参与的长期复杂过程,原癌基因的激活、抑癌基因的失活和由此造成多种蛋白因子的过度表达或缺失,都参与了这个过程。膜联蛋白Annexin A2是Ca2+介导的磷脂结合蛋白,参与形成细胞膜的骨架、膜聚合、胞吞和胞吐等一系列依赖于Ca2+的生理活动,研究发现Annexin A2可以在肿瘤细胞表面结合组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原(PLG)、纤溶酶、细胞粘合素C、组织蛋白酶B、S100A4、腱糖蛋白-C (TN-C)等多种因子共区域化,激发酶促反应,进而降解细胞外基质,加速肿瘤细胞向周围组织浸润、淋巴结及远处转移。CD147,细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloProteinase inducer),是种在胞膜表面广泛表达的单次Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)成员,CD147可以诱导肿瘤细胞及周围的成纤维细胞分泌MMPs,包括：MMP-K MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-11等,而后者几乎能够降解细胞外基质的所有成分,近年来的大量研究发现,CD147在多种肿瘤细胞中呈现高表达。MMP-2,又称为明胶酶A,是MMPs家族的重要成员之一,可以降解明胶,Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原,FN和弹性纤维等多种成分,活化的MMP-2富集于细胞穿透基质的突出部位,在酶解细胞间基质及基底膜的主要成分过程中起主要的作用。关于联合检测Annexin A2、CD147、MMP-2在宫颈鳞癌组织中的表达情况以及叁者与肿瘤发生发展关系的研究,尚未见文献报道。本实验采用免疫组织化学SP法检测了Annexin A2、CD147、MMP-2在14例宫颈正常鳞状上皮组织、31例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和39例宫颈鳞癌组织中表达情况,旨在通过分析叁者的表达与宫颈鳞癌各临床病理资料的联系,探讨叁者之间的相关关系和可能存在的作用机制,以期找到能够评价宫颈癌临床特征和恶性程度的蛋白因子,探索宫颈癌基因治疗的新途径。方法：1.采用免疫组织化学SP方法分别检测14例宫颈正常鳞状上皮组织、31例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和39例宫颈鳞癌组织中Annexin A2、CD147、MMP-2的表达情况。2.统计学处理：所有数据均应用SPSS17.0统计学软件处理,阳性率的比较采用x2检验(chi-square),表达强度的比较采用两组独立样本的Wiloxon秩和检验或多组有序分类资料的Kruskal Wall is H秩和检验。阳性率的相关分析采用2×2或3×2列联表的关联分析,表达强度的相关分析采用Spearman秩相关分析。显着性水准为α=0.05。结果：1. Annexin A2蛋白在宫颈正常鳞状上皮组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和宫颈鳞癌组织的阳性表达率分别为35.71%(5/14)、61.2996(19/31)、89.74%(35/39)。Annexin A2蛋白在宫颈正常鳞状上皮组织、CIN组织中的阳性表达率和表达强度均明显低于其在宫颈鳞癌组织中的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)；两两比较,宫颈正常鳞状上皮组织和CIN组织中Annexin A2的阳性表达率和表达强度的差异无统计学意义(P>0.017),宫颈正常鳞状上皮组织和宫颈鳞癌组织、CIN组织和宫颈鳞癌组织中Annexin A2蛋白阳性表达率和表达强度的差异均有统计学意义(P<0.017)。CIN各级组织中Annexin A2蛋白的阳性表达率和表达强度的差异,无统计学意义(P>0.05)。Annexin A2蛋白的阳性表达率和表达强度与腺体鳞化、腺体累及均无关；Annexin A2蛋白在有腺上皮鳞状上皮化生的患者组织内的阳性表达率是52.38%(11/21),在无腺上皮鳞状上皮化生的患者组织内的阳性表达率是55.56%(5/9),两者比较其阳性率和表达强度的差异均无统计学意义(P=1.000)；Annexin A2蛋白在有腺体累及的患者组织中的阳性表达率是53.85%(7/13),在无腺体累及的患者组织内的阳性表达率是50.00%(1/2),两者比较,其阳性表达率和表达强度的差异无统计学意义(P=1.000)。Annexin A2蛋白的表达与宫颈鳞癌患者的年龄、肿瘤分化等级、淋巴结转移均无关；在年龄<45岁的患者组织中Annexin A2的阳性表达率为88.24%(15/17),在年龄≥45岁的患者组织中其阳性表达率为90.91%(20/22),Annexin A2在两组中阳性率和表达强度的差异无统计学意义(P>0.05)。按照肿瘤的分化程度分类,Annexin A2在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中的阳性表达率分别是86.67%(13/15)、87.50%(14/16)、100%(8/8),叁组之间阳性表达率和表达强度的差异的均无统计学意义(P=0.561)。Annexin A2蛋白在有淋巴结转移组中的阳性表达率为75.00%(12/16),在无淋巴结转移组中的阳性表达率为91.30%(21/23),其阳性表达率和表达强度的差异均无统计学意义(P>0.05)。Annexin A2蛋白的阳性表达率与肿瘤浸润深度呈正相关关系(r阳性率=0.376,P=0.011),在23例肿瘤浸润百分比≥67%的患者组织中,Annexin A2蛋白的阳性表达率为100%(23/23),在16例肿瘤浸润深度百分比<67%的患者组织中,Annexin A2蛋白的阳性表达率为75.00%(12/16),两组比较其阳性率的差异有统计学意义(P<0.05),但表达强度无差异(P>0.05)。2.CD147蛋白在宫颈正常鳞状上皮组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和宫颈鳞癌组织的阳性表达率分别为35.71%(5/14)、67.74%(21/31)、89.74%(35/39)。CD147蛋白在宫颈正常鳞状上皮组织、CIN组织中的阳性表达率和表达强度均明显低于其在宫颈鳞癌组织中的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)；两两比较,宫颈正常鳞状上皮组织和CIN组织中CD147的阳性表达率和表达强度的差异无统计学意义(P>0.017),C IN组织和宫颈鳞癌组织中CD147蛋白的阳性表达率的差异无统计学意义,但其表达强度的差异有统计学意义(P<0.017)；宫颈正常鳞状上皮组织和宫预鳞癌组织中CD147蛋白阳性表达率和表达强度的差异均有统计学意义(P<0.017)。CIN各级组织中CD147蛋白的阳性表达率和表达强度的差异,无统计学意义(P>0.05)。CD147蛋白的阳性表达率和表达强度与腺体鳞化、腺体累及均无关；CD147蛋白在有腺上皮鳞状上皮化生的患者组织内的阳性表达率是42.86%(9/21),在无腺上皮鳞状上皮化生的患者组织内的阳性表达率是55.56%(5/9),两者比较其阳性率和表达强度的差异均无统计学意义(P=0.694)；CD147蛋白在有腺体累及的患者组织中的阳性表达率是76.92%(10/13),在无腺体累及的患者组织内的阳性表达率是100%(2/2),两者比较,其阳性表达率和表达强度的差异无统计学意义(P=1.000)。CD147蛋白的表达与宫颈鳞癌患者的年龄、肿瘤分化等级、淋巴结转移均无关；在年龄<45岁的患者组织中CD147的阳性表达率为88.24%(15/17),在年龄≥45岁的患者组织中其阳性表达率为90.91%(20/22),CD147在两组中阳性率和表达强度的差异无统计学意义(P>0.05)。按照肿瘤的分化程度分类,CD147在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中的阳性表达率分别是86.67%(13/15)、87.50%(14/16)、100%(8/8),叁组之间阳性表达率和表达强度的差异的均无统计学意义(P=0.561)。CD147蛋白在有淋巴结转移组中的阳性表达率为93.75%(15/16),在无淋巴结转移组中的阳性表达率为86.96%(20/23),其阳性表达率和表达强度的差异均无统计学意义(P>0.05)。CD147蛋白的阳性表达率和表达强度与肿瘤浸润深度均呈正相关关系(r阳性率=0.376,P=0.011；r表达强度=0.421,P=0.008),在23例肿瘤浸润百分比≥67%的患者组织中,CD147蛋白的阳性表达率为100%(23/23),在16例肿瘤浸润深度百分比<67%的患者组织中,CD147蛋白的阳性表达率为75%(12/16),两组比较其阳性率和表达强度的差异均有统计学意义(P<0.05)。3.MMP-2蛋白在宫颈正常鳞状上皮组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和宫颈鳞癌组织的阳性表达率分别为14.29%(2/14)、51.61%(16/31)、82.05%(32/39)。MMP-2蛋白在宫颈正常鳞状上皮组织、CIN组织中的阳性表达率和表达强度均明显低于其在宫颈鳞癌组织中的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)；两两比较,宫颈正常鳞状上皮组织和CIN组织中MMP-2蛋白的阳性表达率和表达强度的差异无统计学意义(P>0.017),宫颈正常鳞状上皮组织和宫颈鳞癌组织、CIN组织和宫颈鳞癌组织中MMP-2蛋白的阳性表达率和表达强度的差异均有统计学意义(P<0.017)。CIN各级组织中MMP-2蛋白的阳性表达率和表达强度的差异,无统计学意义(P>0.05)。MMP-2蛋白的阳性表达率和表达强度与腺体鳞化、腺体累及均无关；MMP-2蛋白在有腺上皮鳞状上皮化生的患者组织内的阳性表达率是33.33%(7/21),在无腺上皮鳞状上皮化生的患者组织内的阳性表达率是22.22(2/9),两者比较其阳性率和表达强度的差异均无统计学意义(P=0.681)；MMP-2蛋白在有腺体累及的患者组织中的阳性表达率是61.54%(8/13),在无腺体累及的患者组织内的阳性表达率是50.00%(1/2),两者比较,其阳性表达率和表达强度的差异均无统计学意(P=1.000)。MMP-2蛋白的阳性表达率与宫颈鳞癌患者的年龄、肿瘤分化等级、肿瘤浸润深度和淋巴结转移均无关,但其表达强度与肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关；在年龄<45岁的患者组织中MMP-2的阳性表达率为88.24%(15/17),在年龄≥45岁的患者组织中其阳性表达率为77.27%(17/22),MMP-2蛋白在两组中阳性表达率和表达强度的差异无统计学意义(P>0.05)；按照肿瘤的分化程度分类,MMP-2在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中的阳性表达率分别是66.67%(10/15)、87.50%(14/16)、100%(8/8),叁组之间阳性表达率和表达强度的差异的均无统计学意义(P=0.106)。MMP-2蛋白在有淋巴结转移组中的阳性表达率为87.50%(14/16),在无淋巴结转移组中的阳性表达率为78.26%(18/23),其阳性表达率的差异无统计学意义(P>0.05)。在23例肿瘤浸润深度百分比≥67%的患者组织中,MMP-2蛋白的阳性表达率为91.30%(21/23)；在16例肿瘤浸润深度百分比<67%的患者组织中,MMP-2蛋白的阳性表达率为68.75%(11/16),两组比较其阳性率的差异无统计学意义(P>0.05)。但MMP-2表达强度与肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈正相关关系(r肿瘤浸润深度=0.319,P=0.048；r淋巴结转移=0.327,P=0.042)。4. Annexin A2、CD147和MMP-2的联合表达与腺体鳞化和累及无关。在宫颈鳞癌组织中,同时表达Annexin A2、CD147、MMP-2叁种蛋白的阳性率为79.49%(31/39),叁者的联合表达与宫颈鳞癌患者的年龄、肿瘤分化等级、淋巴结转移无关,与肿瘤浸润深度密切相关,呈正相关关系。在年龄≥45岁的患者癌组织中,叁种蛋白的联合表达阳性率为77.27%(17/22),在年龄<45岁的患者组织中为82.35%(14/17),两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在肿瘤分化等为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级的患者组织中,叁者的阳性表达率分别为66.67%(10/15)、81.25%(13/16)、100%(8/8),叁组比较其差异无统计学意义(P>0.05)。在伴有淋巴结转移的患者癌组织中,叁种蛋白的联合表达阳性率为87.50%(14/16),在无淋巴结转移的患者组织中,叁种蛋白的联合表达阳性率为73.91%(17/23),两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在23例肿瘤浸润百分比≥67%的患者组织中,叁种蛋白的联合表达阳性率为91.30%(21/23)；在16例肿瘤浸润深度百分比<67%的患者组织中,叁种蛋白的联合表达阳性率为62.50%(10/16),两组比较其阳性率的差异有统计学意义(P<0.05),叁种蛋白的联合表达与肿瘤的浸润深度呈正比关系(r=0.331,P=0.028)。5.在宫颈鳞癌组织中,Annexin A2蛋白与CD147蛋白的表达呈正相关(r=0.405,P=0.006);Annexin A2蛋白与MMP-2蛋白的表达呈正相关(r=0.586,P=0.000)；CD147蛋白和MMP-2蛋白的表达呈正相关(r=0.488,P=0.000)。结论：1. Annexin A2、CD147和MMP-2蛋白可能参与宫颈鳞癌的发生过程。2. Annexin A2、CD147、MMP-2蛋白的高表达与宫颈鳞癌的浸润有关,MMP-2蛋白还可能参与了宫颈鳞癌的?
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