葛悦雯 上海市市西中学 200040
摘要：CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇的规间隔短回文重复序列）/Cas (CRISPR关联）系统属于原核生物的免疫防御系统，该系统可识别外源DNA并将其切断来抵抗病毒干扰。根据其原理，CRISPR/Cas技术借助sgRNA（single guide RNA）来引导Cas9核酸酶结合到特定的核酸序列实现目的基因位点的切割。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）后的一种广泛应用于基因组定位点编辑的有效工具，具有操作简单、实验周期短、成本低廉的优势，不可否认，这种基因编辑技术存在脱靶风险。为验证CRISPR/Cas9基因编辑的有效性和精确性，本实验将CPT1A基因作为靶基因，通过PCR增殖、靶基因与PCAG-EGxxFP载体连接，来形成载有CPT1A基因的质粒并转化入293T细胞系。研究图片显示，CPT1A载体在荧光显微镜下呈荧光，证明CRISPR/Cas9技术可进行基因编辑；只有部分基因呈现荧光状态，从而推测引导RNA的选择、非同源末端连接（HDR）修复效率低以及同源重组修复（NHEJ）的随机性影响了基因编辑的效率，所以CRISPR/Cas9技术仍存在改善之处。
关键词： CRISPR/Cas9基因编辑技术；CPT1A基因；基因编辑效率
自20世纪开始，便有科学家提出通过使用基因治疗即修改人体内DNA序列来治疗单基因遗传疾病。在1990年，安德森医生改造莫罗尼小鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus），使其携带正常的腺苷脱氨酶基因导入至人体细胞的基因组DNA来治疗联合免疫缺陷病。直至21世纪初，科研人员们提出新的概念“基因编辑”，在某一特定位点上敲除靶标DNA片段并插入新的基因片段从而达到编辑的目的。
基因编辑技术在生物界经历漫长的研发过程，从1996年钱德拉赛格兰开发的“锌指核酸酶”（Zinc finger nuclease ZFN）技术，利用锌指蛋白和核酸内切酶FokI结合，其中锌指蛋白负责定位基因组特定序列，而FokI负责切断DNA形成双链断裂DBS，来启动细胞自身的修复机制：非同源末端连接NHEJ和同源重组HDR来达到基因的敲入和修复目的。然而，ZFN需构建不同的融合蛋白来定位DNA序列，构建操作繁琐，存在一定缺陷。通过相似的方式，TALEN技术利用以TALE为基础的核酸酶来对特定位点进行切割断裂。相比于ZFN，TALEN对靶点识别效率更高、脱靶机率低。但作为定制的DNA结合蛋白，他们对操作者能力要求高、成本较高。而在2012年，新一代基因编辑工具——CRISPR/Cas9技术诞生。通过crRNA和反式激活的crRNA（tracr RNA)组成的复合物sgRNA来引导Cas9蛋白，使其靶向识别与PAM位点的相匹配的DNA靶序列结合，Cas9蛋白发挥内切酶作用，在靠近NGG位点处进行切割，导致靶标DNA双键断裂，使细胞启动修复机制。目前，该技术已实现多个基因组上的不同位点编辑。CRISPR/Cas9技术设计为简单，操作便捷、实验周期短、更容易构建质粒。
然而，该技术仍存在脱靶效应。为验证CRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率，本实验将通过CPT1A基因作为靶基因来验证其编辑效率及判断影响编辑效率的因素。
1CRISPR/Cas9系统的分子机制
1.1CRISPR/Cas系统来源
CRISPR又称规律成簇间隔回文重复序列是出现于细菌和古细菌中的重复序列（Repeats）和间隔序列（Spacers）。1987年，CRISPR重复序列首次发现于大肠埃希菌。随后在细菌、古细菌中发现了类似的序列，并由Jansen重新命名为CRISPR。紧接着，Jansen鉴定出关键的cas基因，属于一类多态性蛋白家族，目前已发现cas1-cas10等多种类型的cas基因。而CRISPR和相关序列（cas基因和Cas蛋白）共同进化，从而形成细菌中的CRISPR/Cas适应性免疫系统，其中CRISPR系统被分为三种类型，分别是：I型、II型和III型。I型的主要作用单元为Cas3基因编码的蛋白以及其他Cas蛋白参与，是Cas蛋白种类最复杂的一种类别。III型主要包含特征性cas10蛋白，目前发现Type III存在两种亚型：TypeIIIA和TypeIIIB，相比I型和III型，II型只需要通过一种cas蛋白——核酸酶cas9参与crRNA的成熟以及降解入侵的外源质粒或噬菌体。
其中CRISPR/Cas9系统属于II型，通过cas9蛋白来发挥主要作用——与crRNA和tracrRNA结合形成复合物，在guide RNA引导下对靶位点实行切割。
1.2CRISPR/Cas工作原理
CRISPR/Cas系统的组成包括：由不连续重复序列和长度相似的间区序列的间隔排列而成的CRISPR簇、前导序列和CRISPR相关cas蛋白。CRISPR/Cas系统的驱动免疫作用分为三个步骤：获得、表达和干扰。
当外源DNA入侵时，CRISPR/Cas识别入侵核酸、扫描外源DNA潜在的PAM（protospacer adjacent motif）通常为NGG序列，并在PAM附近的序列作为protospacer、合成重复序列，最后将其整合为新的CRISPR间隔区而产生免疫。在表达过程中，机制产生cas蛋白将pre-crRNA加工成更小的crRNA，同时tracrRNA和crRNA形成双链RNA，再和cas9蛋白组合具有切割性的复合物。机制“干扰”入侵核酸是crRNA-cas蛋白复合物在介导下识别同源靶标并进行特异性切割。
2实验设计与研究
2.1实验名称及原理
本次实验将CRISPR/Cas9技术应用于靶基因CPT1A基因，是一种线粒体中脂肪代谢的限速酶。为实现基因编辑，实验将guideRNA、cas9蛋白和CPT1A转入细胞内进行繁殖。
实验前期，本课题组使用CPT1A-F/R引物以H8P56基因组为模板进行PCR反应并对CPT1A、pCAG-EGxxFP、pX459质粒进行酶切。根据已知一段目的基因（H8P56基因组）的核苷酸序列来合成引物（CPT1A-F/R引物），并与目的基因一端的一条DNA模板链互补。再利用PCR反应使目的基因DNA受热后解链为单链，使引物和单链相应互补序列结合，在酶的作用下进行延伸。在酶切过程中，实验使用三种限制性内切酶结合于识别序列的DNA序列之内，使其切割双链DNA。由于缓冲液（Buffer）、温度条件及限制性内切酶会影响限制性内切酶的活性，所以实验中选择了不同的缓冲液（10xBuffer2.1、10xCutsmart）使酶保持一定活性，包括37℃的恒温箱和特异性内切酶都保证酶的切割效果。为得到酶切后的目的片段，实验利用琼脂糖凝胶电泳分离不同的DNA片段，并通过胶回收获取目的片段。 将酶切回收-pCAG-EGxxFP溶液与酶切回收-CPT1A溶液加入水和质粒SolutionI进行连接。同时，为得到向导DNA和载体的连接，实验通过加入PX459质粒、BbS1、Buffer2.1、水等进行合成溶液，随后在向导DNA中加入PX459溶液、CPT1A-g3-F/R溶液、Solution和水来进行连接。
当靶基因载体和CRISPR/Cas9载体构建完成后，将载体导入感受态细胞并进行培养。按照相应比例配置LB培养基，随后将感受态细胞、两种连接产物分别装入两管内。一段时间后，把已繁殖的细菌放入固态LB培养皿并倒置培养。
在感受态细胞增殖后，挑选单菌落并进行菌落PCR鉴定，利用电泳发现特定位置处出现连接成功的菌落。将已连接成功的菌落进行扩增来得到更多的目的质粒。为获取纯净目的质粒，实验组将已扩增的菌液依次加入Buffer P1溶解、Buffer P2、Buffer NP3洗涤多次，在重复离心过滤后取出离心管吸附柱，并进行溶液的浓度测量。
为表达不同质粒，本实验组将两种载体导入肾细胞293T细胞中进行细胞转染。在此过程中，将CPT1A基因、向导DNA和DMEM培养基按一定比例加入细胞培养板来培养293T细胞，并将GPF蛋白加入作为对照组。
3结论分析
3.1实验结论分析
图1 CPT1A-GFP 图2 CPT1A-DNA Guide-GFP
图3 GFP-GFP
根据荧光显微镜下所显结果，实验中的向导DNA识别CPT1A基因上的两个相应位点，当靶基因被切割后便启动细菌自身的修复机制，由非同源性末端结合来直接连接相应片段中断裂位置的两端，表达出荧光基因。在实验中使用了三组不同试剂来对比其结果。在第一组中只有CPT1A基因，没有加入向导DNA，所以无法在CPT1A基因上进行编辑，而第二组中加入了CPT1A基因以及向导DNA质粒，所以可以在靶基因中进行编辑，从而有荧光蛋白产生。由实验图片显示，部分细胞编辑成功，说明Cas9蛋白和向导DNA结合可以进行编辑，但是无法实施细胞的全部编辑，仍有部分荧光蛋白未表达。所以，在进行CRISPR/Cas9基因编辑时，有一定因素影响其编辑效率，本实验组推测引导RNA的选择、非同源末端连接（HDR）修复效率低以及同源重组修复（NHEJ）的随机性影响了基因编辑的效率，所以CRISPR/Cas9技术仍存在改善之处。
3.2关于CRISPR/Cas9技术的未来展望
毋庸置疑，新一代CRISPR/Cas9技术开辟了基因编辑的革新，相较于ZFN和TALLEN技术，CRISPR/Cas9有着众多优势，例如操作便捷性、实验周期短、成本低廉、构建质粒方便等。这一技术在治疗疾病、移植器官等领域有显著突破，开辟了基因功能研究的新时代。目前CRISPR/Cas9技术虽然存在一定的便捷性和可操作性，但是要在保证安全的同时提高其精确率和效率，为此对人类疾病的基因治疗至关重要。
参考文献
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论文作者:葛悦雯
论文发表刊物:《科技新时代》2019年2期
论文发表时间:2019/4/11
标签：基因论文; 序列论文; 编辑论文; 蛋白论文; 质粒论文; 目的论文; 技术论文; 《科技新时代》2019年2期论文;