白世平[1]2008年在《不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收机理研究》文中认为在本实验室前期锰营养研究成果的基础上,本论文共进行四个试验,采用原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法,通过锰吸收动力学和二价金属转运蛋白1的表达研究有机与无机态锰在肉鸡小肠中的吸收机理。试验一为了研究肉鸡小肠各段中不同形态锰吸收机理的差异,成功克隆获得了鸡小肠DMT1全长cDNAs序列。鸡二价金属转运蛋白1(divalent metal transporter 1, DMT1)在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用。本研究根据哺乳动物DMT1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3'RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠DMT 1 cDNA 3'端1 289 bp和1 092 bp两种片段,且发现其3'端翻译区和非翻译区存在差异。再根据鸡DMT cDNA 3'端片段的测序结果设计引物,扩增获得一个与3'端片段部分重迭的鸡DMT1 cDNA 5'端907 bp片段,并对其进行了克隆测序。最后根据鸡小肠DMT13'RACE片段和5'RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠DMT1cDNAs的全序列信息。研究结果表明,鸡小肠DMT1 cDNA有两种形式,一种全长为1 972个核苷酸,其中5'非翻译区104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3'非翻译区173个核苷酸,编码一个长564个氨基酸残基的蛋白质;另一种全长为1 775个核苷酸,其中5'非翻译区104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3'非翻译区78个核苷酸,编码一个长530个氨基酸残基的蛋白质。由两种形式DMT1cDNA推测获得的DMT1蛋白分子量分别为61.56 kDa和57.90kDa;等电点分别为5.51和5.75。对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,DMT1蛋白是一种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列。两种推测的DMT1蛋白都具有12个跨膜区和叁个糖基化位点,且有两个糖基化位点(332-335;345-348)位于DMT1蛋白的第7和第8跨膜区之间。DMT1cDNA第一种形式推导蛋白序列与已知人、小鼠、大鼠和猴等典型模式真核生物DMT1氨基酸序列进行比较,分别有80%、82%,、82%和78%的同源性;DMT1 cDNA第二种形式推导蛋白序列与已知人、小鼠、大鼠和猴等典型模式真核生物DMT1氨基酸序列进行比较,分别有83%、84%、84%和81%的同源性。最后根据鸡DMT1 cDNA的全序列信息,合成代表鸡DMT1 cDNA 3'最末端的新引物,运用末端PCR(End-to-End PCR)方法,直接从3'末端cDNA库体外扩增鸡小肠DMT1cDNA的拷贝。该全长cDNA拷贝被克隆进T载体,鉴定结果证明,已成功构建了鸡小肠DMT1正向和反向的全长cDNA克隆,为进一步研究肉仔鸡小肠各段中锰的吸收机理奠定基础。试验二用半体内原位结扎灌注肠段法研究快速生长肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠中无机锰吸收机理的差异。共包括2个试验,试验1通过结扎肉仔鸡小肠各段在灌注后不同时间点对无机锰吸收率的变化来确定研究结扎肉仔鸡小肠各段锰吸收动力学的采样时间;试验2通过结扎肉仔鸡小肠各段中锰吸收速率随锰浓度的变化曲线来比较无机锰在肉鸡小肠各段中吸收机制的差异,并通过二价金属转运蛋白1mRNA的表达来研究其在结扎肉鸡小肠各段锰转运中的作用。试验1采用单因子的完全随机试验设计,共设灌注后5、15、30和40分钟4个采样时间点处理组。由于可从每个灌注肠段于以上4个时间点连续取样,故4个处理组共用同一组鸡只。加锰灌注液中以硫酸锰添加2.18 mmol/L(即120 ug/ml)锰。将12只28日龄的肉仔鸡按体重随机分为6个重复,每个重复2只鸡(为扣除内源影响,其中一只鸡作为零添加锰水平处理),每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别用作相应部位灌注肠段的一个重复,故每个采样点共有6个重复观测值。试验2采用单因子的完全随机试验设计,共设8个处理组,分别为0、0.13、0.27、0.54、1.09、2.18、4.37和8.74 mmol/L锰浓度组。结扎小肠各段中灌注液的采样时间为灌注后5分钟,结扎小肠各段小肠粘膜的采样时间为灌注后30分钟。将80只28日龄的肉仔公鸡分别按体重随机分成8个处理组,每组10个重复,每个重复1只鸡,每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别用作相应部位灌注肠段的一个重复,故每个肠段有10个重复观测值。试验1的结果表明:结扎肉仔鸡小肠各段对无机锰的吸收随灌注时间呈渐近线式的增长;灌注后5分钟内,结扎小肠各段对锰的吸收均随着灌注时间直线上升,故选取灌注后5分钟研究结扎肉仔鸡小肠各段对无机锰的吸收动力学;灌注后30分钟时,结扎小肠各段对锰的吸收达到其最大吸收的80%以上,故选取灌注后30分钟研究添加锰对结扎肉仔鸡小肠各段中DMT1 mRNA表达的影响。试验2的结果表明:结扎肉仔鸡十二指肠和空肠中无机锰的吸收动力学最适合饱和载体转运模型;而结扎肉仔鸡回肠中锰的吸收动力学最适合非饱和扩散模型。灌注后5分钟,结扎十二指肠锰载体转运系统对无机锰的最大吸收速率Jmax显着高于(P<0.05)结扎空肠锰载体转运系统对无机锰的最大吸收速率(94.08 vs 81.17 nmol/cm/min);但二者的Km值无显着差异(P=0.85;3.41 vs 3.60 mmol/L);无机锰在结扎回肠中的非饱和扩散系数为2.42×10-2 cm2/min。结扎小肠各段中二价金属蛋白1mRNA的水平表明:对照组结扎AA肉仔鸡十二指肠和空肠中DMT1 mRNA的水平显着高于回肠(P<0.0001)中的水平,但结扎十二指肠和空肠中DMT1 mRNA的水平无显着差异(P=0.2112)。处理组(添加2.18 mM锰组)结扎AA肉仔鸡十二指肠和空肠中DMT1 mRNA水平也显着高于回肠中的水平(P=0.0175)。与对照组相比,处理组结扎肉仔鸡小肠各段中DMT1 mRNA的表达量明显降低(P<0.001)。试验结果提示:无机锰在结扎肉鸡十二指肠和空肠中主要是以饱和载体转运的方式吸收的,而在结扎回肠中,主要是以非饱和扩散的方式吸收的。在结扎肉鸡十二指肠和空肠中至少存在一种无机锰的载体转运蛋白。DMT1mRNA主要在结扎肉鸡的十二指肠和空肠中表达,而回肠中表达很低;添加无机锰降低了结扎肉鸡小肠各段中的DMT1 mRNA的水平,提示DMT1在肉仔鸡十二指肠和空肠锰的转运过程中起重要作用。因不同形态锰在肉仔鸡十二指肠中的吸收差异最大,试验叁通过结扎肉仔鸡十二指肠中不同形态锰吸收的动力学曲线来比较不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收机制,并通过二价金属转运蛋白1mRNA的表达来研究不同形态锰在结扎肉鸡小肠中吸收机理的差异。本试验采用3(锰源)×7(水平)的两因子的完全随机试验设计。灌注液中添加的3种锰源分别为无机硫酸锰、本实验室前期采集的强络合强度有机锰(Qf=186,锰含量为10.18%)和中等络合强度有机锰(Qf=16.85,锰含量为9.06%);灌注液中添加锰的浓度分别为0.13、0.27、0.54、1.09、2.18、4.37和8.74 mmol/L;同时设置不添加锰对照组,共22个处理。灌注时间为30分钟内,肉仔鸡结扎十二指肠对锰的吸收随着灌注时间直线上升,故选取灌注后30分钟研究结扎肉仔鸡十二指肠对不同形态锰的吸收动力学。将220只28日龄体重相近的AA肉公鸡随机分到22个处理组中,每组10个重复,每个重复1只鸡,故每个肠段有10个重复观测值。试验结果表明:结扎十二指肠对不同形态锰吸收的动力学都最适合饱和载体转运模型;中等络合强度有机锰(MnAAB,Qf=16.85)和强络合强度有机锰(Bioplex Mn,Qf=186)在结扎肉仔鸡十二指肠段中的饱和载体转运系统Jmax值和Km值都显着高于(P<0.001)无机硫酸锰;但中等络合强度有机锰和强络合强度有机锰在结扎肉仔鸡十二指肠中饱和载体转运系统的Jmax和Km值无显着差异(P>0.66)。不同形态锰对结扎肉仔鸡十二指肠中总DMT1 mRNA水平具有显着影响(P=0.0001)。无机硫酸锰、中等络合强度和强络合强度有机锰组分别比对照组总DMT1 mRNA的表达量下降了80.99%(P<0.0001)、65.58%(P<0.0001)和58.20%(P=0.0003)。中等络合强度和强络合强度有机锰组分别比无机锰组总DMT1 mRNA水平上升了81.1%(P=0.0095)和119.9%(P=0.0011)。中等络合强度和强络合强度有机锰组总DMT1 mRNA水平间无显着差异(P=0.4018)。I型DMT1 mRNA在肉仔鸡十二指肠中表达量很低,且不同形态锰对结扎肉仔鸡十二指肠中I型DMT1 mRNA水平无显着影响(P=0.4828)。添加不同形态锰对结扎肉仔鸡十二指肠中II型DMT1 mRNA水平有显着影响(P=0.0001)。无机硫酸锰、中等络合强度和强络合强度有机锰源组分别比对照组II型DMT1 mRNA的表达量下降了83.01%(P<0.0001)、66.84%(P<0.0001)和59.17%(P=0.0001)。中等络合强度和强络合强度有机锰组II型DMT1 mRNA水平分别比无机锰组增加了95.1%(P=0.0006)和140.2%(P=0.0004)。中等络合强度和强络合强度有机锰组II型DMT1 mRNA水平之间不无显着差异(P=0.3721)。试验结果表明:不同形态锰在结扎肉鸡十二指肠中均主要是以饱和载体转运的方式吸收;但添加络合的有机锰组肉仔鸡十二指肠中总DMT1 mRNA水平高于比无机锰组。肉仔鸡十二指肠中DMT1 mRNA主要以II型DMT1mRNA表达;添加不同形态锰降低了结扎肉鸡小肠中II型DMT1 mRNA水平,而对I型DMT1mRNA表达水平没有影响。试验四通过比较肝门静脉血浆中的锰含量来研究不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收差异;通过不同形态锰对肉仔鸡小肠各段中DMT1mRNA水平的影响揭示不同形态锰在肉仔鸡小肠中吸收机理的差异。试验采用单因子的完全随机试验设计,共设4个处理组,分别为:零添加锰水平对照组、硫酸锰组、本实验室前期应用的中等络合强度(Qf=16.85;Mn-AAB)和强络合强度(Qf=186;Bioplex Mn)有机锰组。将256只14日龄缺锰AA肉公鸡按体重随机分到以上4个处理组,每组8个重复,每个重复8只鸡。结果表明:(1)在试验的第7天和第14天,肝门静脉血浆锰含量均受到添加锰源的显着影响(P<0.0001)。在第7天,无机硫酸锰、中等和强络合强度有机锰组分别比对照组肉仔鸡的血浆锰含量增加了59.7%(P=0.0029)、112.4%(P<0.0001)和133.1%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组比无机硫酸锰组分别增加了32.9%(P=0.0075)和45.9%(P=0.0004)。强络合强度有机锰源处理组比中等络合强度有机锰源处理组增加了9.7%,但差异不显着(P=0.2669)。在试验的第14天,无机硫酸锰、中等和强络合强度有机锰组分别比对照组肉仔鸡的血浆锰含量增加了31.0%(P=0.0184)、78.3%(P<0.0001)和128.6%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组比无机硫酸锰组增加了36.1%(P<0.0001)和74.5%(P<0.0001)。强络合强度有机锰组比中等络合强度有机锰组增加了28.2%(P=0.0004)。(2)肉仔鸡十二指肠和空肠中总DMT1 mRNA水平极显着(P<0.01)高于回肠,十二指肠中总DMT1 mRNA水平极显着(P<0.01)高于空肠。与对照组相比,添加不同形态锰显着增加了肉仔鸡十二指肠和空肠中总DMT1 mRNA水平(P<0.0001);而对回肠中总DMT1 mRNA水平无显着影响(P=0.1793)。无机硫酸锰、中等和强络合强度有机锰组十二指肠总DMT1 mRNA水平分别比对照组增加了44.2%(P=0.2530)、224.3%(P<0.0001)和286.8%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组十二指肠总DMT1 mRNA水平比无机硫酸锰处理组增加了124.7%(P<0.0001)和168.1%(P<0.0001),强络合强度有机锰组十二指肠总DMT1 mRNA水平显着高于(P=0.0995)中等络合强度有机锰组。无机硫酸锰、中等络合强度和强络合强度有机锰组空肠总DMT1 mRNA水平分别比对照组增加了47.3%(P=0.0935)、150.7%(P<0.0001)和149.7%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组空肠总DMT1 mRNA水平比无机硫酸锰处理组增加了70.1%(P=0.0051)和69.4%(P=0.0065),强络合强度与中等络合强度有机锰组空肠总DMT1 mRNA间无显着差异(P=0.9318)。(3)肉仔鸡十二指肠和空肠中I型DMT1 mRNA水平极显着(P<0.01)高于回肠;添加不同形态锰对肉仔鸡小肠各段中I型DMT1 mRNA表达无显着影响(P>0.28)。试验结果提示:自然饲喂的肉仔鸡小肠中DMT1mRNA主要表达在十二指肠和空肠,而回肠最低;添加不同形态锰增加了肉仔鸡十二指肠和空肠中总DMT1 mRNA水平。与无机锰相比,中等和强络合强度的有机锰增加了肉仔鸡十二指肠和空肠中DMT1 mRNA的表达,且强络合强度的有机锰又高于中等络合强度的有机锰。综上所述,无机锰在肉仔鸡十二指肠和空肠中主要以饱和载体转运方式吸收,而在回肠中主要以非饱和扩散的方式吸收。锰转运蛋白DMT1主要在肉鸡十二指肠和空肠中表达,而回肠中很低,提示其在肉鸡十二指肠和空肠锰的载体转运过程中起重要作用。络合(螯合)有机锰在肉鸡十二指肠中主要是以饱和载体转运的方式吸收;中等和强络合强度有机锰组肉仔鸡十二指肠和空肠中锰转运蛋白DMT1 mRNA水平均明显高于无机锰组,且强络合强度有机锰组又高于中等络合强度有机锰组。以上研究结果对于我国肉鸡生产中科学研制开发和应用中等和强络合强度的新型高效吸收锰添加剂,奠定了坚实的理论基础。
计峰[2]2003年在《用体外法和体内法研究有机锰在肉仔鸡小肠中的吸收特点》文中研究说明在本实验室前期肉仔鸡锰营养研究成果的基础上，本论文共进行了五个试验，进一步优化探讨了络合态锰的检测方法，并采用体外外翻肠囊法、体内原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法研究有机与无机态锰在肉仔鸡小肠中吸收特点的差异。 试验一 有机锰络合率的研究 利用红外光谱法、凝胶过滤色谱法和阳离子交换平衡法，分析了甘氨酸锰的红外光谱特征、甘氨酸锰和蛋氨酸锰在pH7、0.1M Tris缓冲溶液中的络合率。结果表明：(1)所合成的甘氨酸锰在红外光谱图上表现出锰络合物的结构特征；(2)在本研究所设定的检测条件下，用凝胶过滤色谱法和阳离子交换平衡法均未检测到甘氨酸锰和蛋氨酸锰在pH7、0.1M Tris缓冲液中有络合锰的存在。本研究结果提示，由于锰离子形成络合物的能力比较弱，溶液中的络合锰在凝胶过滤和离子交换过程中，可能因络合平衡破坏而在分离过程中发生解离，从而未能检测出络合形态的锰，故不能由此就否定氨基酸锰溶液中无络合锰存在。 试验二 用外翻肠囊法研究有机锰在肉仔鸡小肠中的吸收特点 本试验用外翻肠囊法研究肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠对无机锰和有机锰的吸收特点的差异。共包括2个试验，试验1中以硫酸锰为添加锰源，根据单位时间锰的吸收率与外翻肠囊培养时间的曲线关系确定最佳培养时间，试验2中应用此培养时间研究不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收特点。试验1 采用单因子的完全随机试验设计，共设培养时间分别为20、40、60和80分钟的4个处理组。加锰培养液中锰的添加量为120μg／ml。将48只28日龄商品代AA肉公鸡随机分到以上的4个处理组，每组6个重复，每个重复2只鸡(为了扣除内源影响，其中的一只鸡作为零添加锰水平处理)，每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别作为相应肠段外翻肠囊的一个重复。在试验2中，采用单因子安排的完全随机设计，共设8个处理组，分别为：硫酸锰组、甘氨酸锰螯合物组、蛋氨酸锰螯合物组、本实验室新近生物学利用率研究(李素芬，2002)中选用的弱络合强度的蛋氨酸锰(Mn-Met E)组、中等络合强度的氨基酸锰(Mn-AA A)组和强络合强度的氨基酸锰(Mn-AA B)组、硫酸锰与甘氨酸的混合物组及硫酸锰与蛋氨酸的混合物组。为了扣除内源影响，另设一组作为零添加锰水平处理。加锰培养液中以各种锰源添加12Opg/ml锰，培养时间为30分钟。用与试验1中日龄相同的AA肉公鸡72只，随机分到以上设置的9个组，每组8个重复，每个重复1只鸡，每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别作为相应肠段外翻肠囊的‘~·个重复。结果表明:(l)综合叁个部位肠段的吸收情况，锰的吸收率和培养时间在40分钟内呈线性关系，因此选择30分钟为试验2的培养时间;(2)体外培养回肠肠囊对无机锰的吸收率一般是十二指肠和空肠的2一6倍，而且随着培养时间的延长，甚至达到了9倍(P<0.01);(3)回肠中锰的吸收率受到添加锰源的显着影响(P二0.0533)。其中合成蛋氨酸锰中锰的吸收率比硫酸锰增加了77.6%(P二0.0534)，比合成甘氨酸锰增加了1 16.1% (p二0.0187)。中等络合强度的Mn一AAA中锰的吸收率比无机硫酸锰和甘氨酸锰分别增加了82.1%和121.5%(P<0.07)，强络合强度的Mn一AAB中锰的吸收率比无机硫酸锰和甘氨酸锰分别增加了74.6%和1 12.4%(P<0.07)，而弱络合强度的Mn一MetE中锰的吸收率比硫酸锰增加了43.9%，有高于无机锰的趋势(P>0，10)。本研究结果提示，在体外缓冲溶液中培养的外翻肠囊中，回肠是肉仔鸡小肠吸收锰的主要部位;络合(鳌合)的有机态锰在体外培养的肉仔鸡小肠外翻肠囊中的吸收率比无机形态锰的高;中等络合强度和强络合强度有机锰源中锰的吸收率高于弱络合强度有机锰;作为配体而言，蛋氨酸比甘氨酸更有利于促进锰的吸收。试验叁用外翻肠囊法研究高钙条件下有机锰在肉仔鸡小肠中的吸收特点 本试验用外翻肠囊法进一步研究高钙对肉仔鸡不同肠段(十二指肠、空肠和回肠)吸收不同形态锰的影响，以比较有机锰和无机锰在高钙条件下吸收特点的差异。采用2x4双因子处理安排的完全随机设计，培养液中的两种钙水平分别为常钙(0.01%)和高钙水平(0.1%)，培养液中添加的4种锰源分别为:硫酸锰、弱络合强度的蛋氨酸锰(Mn一MetE)、中等络合强度的氨基酸锰(Mn一AAA)和强络合强度的氨基酸锰(Mn一AAB)。培养液中锰的添加量均为120陀/m1，培养时间为30分钟。为了扣除内源的影响，在常钙和高钙水平下各设置1个零添加锰水平处理。将80只31日龄AA肉公鸡随机分到以上设置的10个组，每组8个重复，每个重复l只鸡，每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别作为相应肠段外翻肠囊的一个重复。结果表明:(l)体外培养回肠肠囊对锰的吸收率约为十二指肠的3一5倍(P<0.01)，空肠的吸收率约为十二指肠的2一4倍，但只有常钙水平下的强络合强度有声务吓机锰源组、高钙水平下的弱络合强度和强络合强度有机锰源组的十二指肠和空肠之间表现出明显差异(P<0 .01);(2)高钙条件下，十二指肠、空肠和回肠肠囊对锰的吸收率约为常钙水平下的1.5一2倍(P<0.05):(3)空肠和回肠肠囊对锰的吸收率受到添加锰源的显着影响(P<0.06)。空肠和回肠肠囊对强络合强度的Mn~AAB中锰?
张伶燕[3]2016年在《有机铁源的化学特性、对肉仔鸡的相对生物学利用率及其小肠铁吸收研究》文中提出本论文共通过五个系列试验,分析了有机铁源的化学特性,研究了不同络(螯)合强度[complex(chelation)strength,quotient of formation(Qf)values,Qf值]有机铁对肉仔鸡的相对生物学利用率,以及其无机铁及不同络(螯)合强度有机铁在肉仔鸡小肠各段的吸收规律和机制。试验一有机铁源的化学特性研究利用等离子体发射光谱法、滴定法、高效液相色谱法和极谱法分析了24种有机铁源(包括6种蛋氨酸铁(Fe-Mets 1-6)、10种甘氨酸铁(Fe-Glys 1-10)、1种赖氨酸铁(Fe-Lys)、4种蛋白铁(Fe-Prots 1-4)、3种复合氨基酸铁(Fe-AAs 1-3)以及试剂级硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)的总铁含量、叁价铁离子(Fe3+)含量、氨基酸组成、在pH 2.0、0.2 M HCl-KCl与pH5.0、0.1 M KH2PO4-K2HPO4的缓冲溶液及去离子水中的溶解度以及各有机铁源的Qf值。结果表明:1)24种有机铁源产品的总铁含量在10.2~20.1%之间,同时含有不同程度的Fe3+(0~5.66%);2)所测24种有机铁源产品的总氨基酸与铁的摩尔比为0.80:1~2.48:1,其中6种(Fe-Met 2、Fe-Gly 1、Fe-Gly 10、Fe-Prot1、Fe-Prot 4和Fe-AA 3)有机铁源的摩尔比小于1:1(氨基酸:铁),1种有机铁源(Fe-Prot 2)的摩尔比大于2:1(氨基酸:铁),其它12种有机铁源的摩尔比介于1:1~1:2之间;3)有机铁源在不同的溶剂中溶解度差异很大,介于0~100%之间,其中在pH 2.0、0.2 M HCl-KCl中的溶解度>在去离子水中的溶解度>在pH5.0、0.1 M的KH2PO4-K2HPO4中的溶解度;4)有19种有机铁源产品(Fe-Mets1-6、Fe-Glys 1-10、Fe-Lys、Fe-Prot 4和Fe-AA 2)的Qf值低于10,属于弱络(螯)合强度有机铁源,有4种有机铁源产品(Fe-Prot 1、Fe-Prot 3、Fe-AA 1和Fe-AA 3)的Qf值介于10~100之间,属于中等络(螯)合强度有机铁源,1种有机铁源(Fe-Prot 2)的Qf值为8,590,超过1000,属于极强螯合强度有机铁源。以上研究结果表明,有机铁源间的化学特性变异很大,为评价不同有机铁源对肉仔鸡的相对生物学利用率与其Qf值之间的关系奠定了基础。试验二肉仔鸡对不同络(螯)合强度有机铁源的相对生物学利用率研究由于有机铁源的络(螯)合强度是决定其相对生物学利用率的最重要的化学特性,故综合考虑上述24种有机铁源化学特性,从中选出分别属于不同络(螯)合强度类别的3种有机铁源,即弱络合强度有机铁(Fe-Met 2,标记为Fe-Met W,14.7%Fe,Qf=1.37)、中等络合强度有机铁(Fe-Prot 1,标记为Fe-Prot M,14.2%Fe,Qf=43.6)和极强螯合强度有机铁(Fe-Prot 2,标记为Fe-Prot ES,10.2%Fe,Qf=8,590)。选用1,170只1日龄商品代爱拔益加(Arbor Acres,AA)肉公雏进行动物试验,通过观测在玉米-豆粕常用饲粮下,添加不同铁源及铁水平对肉仔鸡生长性能、血液指标、组织铁含量、组织过氧化氢酶(Catalase,CAT)和琥珀酸脱氢酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)活性及其基因表达的影响,以评价肉仔鸡对不同络(螯)合强度有机铁源的相对生物学利用率。试验鸡按4╳3+1两因子安排的完全随机设计按体重随机分为13个处理组(每组6个重复,每个重复15只鸡),分别饲喂不添加铁的玉米一豆粕型基础饲粮(为对照组,含铁实测为55.8 mg/kg)和在对照组基础饲粮中以无机硫酸亚铁及以上3种弱、中和极强络(螯)合强度的有机铁源的形式分别添加铁20、40和60 mg/kg。试验期为21天,分别于7、14和21日龄采样分析。结果表明:1)随饲粮中铁水平的增加,14日龄鸡血浆铁饱和度、7日龄和14日龄鸡胫骨铁含量、7日龄、14日龄和21日龄鸡肝脏铁含量、14日龄鸡肾脏铁含量、21日龄鸡肝脏以及7和21日龄鸡肾脏SDH酶活、14日龄鸡肝脏和心脏CAT mRNA水平、21日龄鸡肝脏和肾脏SDH mRNA水平均显着线性增加(P<0.05);2)以肉仔鸡的实际铁采食量对上述指标作多元线性回归分析,以斜率比法计算各铁源的相对生物学利用率时发现,仅以21日龄鸡肝脏和肾脏sdhmrna为评价指标时,各铁源之间差异显着(p<0.05);3)以21日龄鸡肝脏sdhmrna为评价指标时,弱、中等和极强络(螯)合强度有机铁相对于无机硫酸亚铁(100%)的生物学利用率分别为129%(p=0.18)、164%(p<0.003)和174%(p<0.001);以21日龄鸡肾脏sdhmrna水平作为评价指标时,以上叁种有机铁源的相对生物学利用率分别为102%(p=0.95)、143%(p=0.09)和174%(p<0.004)。其中,极强螯合强度有机铁源的生物学利用率显着高于弱络合强度有机铁源与无机硫酸亚铁(p<0.05),中等络合强度有机铁与极强螯合强度有机铁之间以及弱络合强度有机铁与无机硫酸亚铁之间的生物学利用率差异不显着(p>0.05)。本次试验研究结果提示,21日龄肉仔鸡肝脏和肾脏sdhmrna水平为评价肉仔鸡对不同铁源生物学利用率的特异敏感功能性指标;并以其为评价指标综合评价获得fe-metw、fe-protm和fe-protes相对于无机硫酸亚铁(100%)的生物学利用率分别为116、154和174%;采用实用饲粮并在肉仔鸡铁需要量上下添加不同水平铁,采用多元线性斜率比法,以特异敏感功能指标评价获得的不同铁源对肉仔鸡的相对生物学利用率结果更科学更具实用性。试验叁用原位结扎灌注肠段法研究无机硫酸亚铁在肉仔鸡小肠中的吸收规律及其分子机制本试验包括2个小试验,用原位结扎灌注肠段法研究无机硫酸亚铁在肉仔鸡十二指肠、空肠及回肠的吸收动力学模式及其与二价金属离子转运蛋白1(divalentmetaltransporter1,dmt1)和高铁转运体1(ferroportin,fpn1)基因表达的相关性。试验1通过研究不同灌注时间点时肉仔鸡小肠各段无机硫酸亚铁吸收率的变化规律,以确定研究肉仔鸡结扎小肠各段铁吸收动力学的适宜灌注时间。选用100只28日龄铁缺乏的商品代肉公鸡,按体重随机分为5个处理组(每个处理组10个重复,每个重复2只鸡),灌注25μg/ml(0.45mm)的无机铁(硫酸亚铁),共设0、5、15、30和60min,共5个采样时间点。结果表明,在0~60min内,无机铁在肉仔鸡结扎十二指肠和空肠的吸收率均呈渐近线变化,而在回肠中呈现二次曲线变化。根据灌注时间变化拟合方程得到十二指肠、空肠和回肠达到最大吸收率的时间分别为60、60和43min。十二指肠铁吸收率在灌注后30、45和60min时显着(p<0.006)高于空肠铁吸收率,并在60min时高于回肠(p<0.03)。在30min时各肠段铁吸收率均达到了最大吸收率的85.0%以上,故在试验2中采用的适宜灌注时间为30min。试验2通过结扎肉仔鸡小肠各段并灌注不同铁浓度0(0mm)、6.25(0.11mm)、12.5(0.22mm)、25(0.45mm)、50(0.89mm)、100(1.78mm)、或200(3.56mm)μg/ml的硫酸亚铁,观测无机铁吸收速率与灌注铁浓度之间的关系,揭示无机铁在肉仔鸡小肠各段的吸收动力学模式,并通过检测小肠各肠段dmt1和fpn1mrna表达水平来研究dmt1和fpn1在铁吸收转运中的作用。试验2选用与试验1相同的28日龄缺铁商品代aa肉公鸡70只,按体重随机分为7个处理组(每个处理组10个重复,每个重复1只鸡)。肉仔鸡小肠各段铁吸收动力学模型表明,十二指肠和空肠的铁吸收符合饱和载体转运模式,回肠铁吸收符合非饱和扩散模式。十二指肠dmt1mrna表达水平都显着(p<0.0001)高于空肠和回肠,空肠显着高于(p<0.009)回肠。以上结果表明,十二指肠和空肠的铁吸收以饱和载体转运模式为主,回肠铁吸收以非饱和扩散模式为主,铁在十二指肠和空肠中的吸收方式可能与其dmt1和fpn1的表达有关。试验四用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中的吸收规律采用2╳8二因子完全随机设计,共16个处理组。设置2个灌注铁浓度,分别为:200μg/ml(3.58mm)和400μg/ml(7.16mm)。灌注8种铁源,分别为:无机硫酸亚铁、无机硫酸亚铁与蛋氨酸混合物、无机硫酸亚铁与甘氨酸混合物、蛋氨酸铁、甘氨酸铁、弱络合强度蛋氨酸铁(fe-metw,qf=1.37)、中等络合强度的蛋白铁(fe-protm,qf=43.6)和极强螯合强度的蛋白铁(fe-protes,qf=8,590)。选用160只28日龄铁缺乏的商品代aa肉公鸡,按体重随机分为16个处理组(每个处理组10个重复,每个重复1只鸡),分别以上述铁源灌注不同浓度的铁,于灌注后30min采样。结果表明:1)灌注液铁浓度为400μg/ml时肉鸡小肠中的铁吸收率高于(p<0.0001)灌注液铁浓度为200μg/ml时肉鸡小肠中的铁吸收率,十二指肠中的铁吸收率显着高于(p<0.003)空肠和回肠,空肠和回肠之间铁吸收率无显着差异(p>0.10),进一步证明十二指肠是肉仔鸡小肠铁吸收的主要部位;2)铁源影响肉仔鸡小肠段中的铁吸收率(p<0.0001),无机硫酸铁与蛋氨酸或甘氨酸混合组铁的吸收率与甘氨酸铁组和蛋氨酸铁组近似(p>0.05),有高于硫酸亚铁的趋势(p=0.10和0.02)。中等和极强络(螯)合强度组的铁吸收显着高于(p<0.01)无机硫酸亚铁组。无机硫酸亚铁与蛋氨酸混合物组、无机硫酸亚铁与甘氨酸混合物组、蛋氨酸铁组、甘氨酸铁组、弱络合强度的蛋氨酸铁组之间铁吸收率差异不显着(p>0.05)。中等络合强度组与极强螯合强度组之间没有差异(p>0.05)。从数值上看,各处理组铁吸收率由高到低为:极强螯合强度的蛋白铁组>中等络合强度的蛋白铁组>蛋氨酸铁组>甘氨酸铁组>无机硫酸亚铁与甘氨酸混合物组>无机硫酸亚铁与蛋氨酸混合物组>弱络合强度的蛋氨酸铁组>无机硫酸亚铁组。以上结果进一步表明,十二指肠是肉仔鸡小肠铁的主要吸收部位;有机铁的吸收优于无机铁,且与其qf值密切相关,其中以极强螯合强度有机铁的吸收最好,中等络合强度有机铁次之,弱络合强度有机铁的最差,与无机硫酸亚铁的近似;将蛋氨酸及甘氨酸分别与硫酸亚铁简单地混合,有促进铁吸收的趋势,其吸收率与蛋氨酸铁、甘氨酸铁以及弱络合强度有机铁的相近。试验五用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中吸收差异的机制本试验在前面试验的基础上,采用原位结扎灌注肠段法,进一步深入研究不同形态铁在肉仔鸡结扎十二指肠中的吸收动力学模式,并探讨其在肉仔鸡小肠中吸收差异的机制。本试验采用4×5两因子完全随机设计,取肉仔鸡十二指肠灌注,灌注液中添加的4种铁源分别为:无机硫酸亚铁、弱络合强度的蛋氨酸铁(fe-metw,qf=1.37)、中等络合强度蛋白铁(fe-protm,qf=43.6)和极强螯合强度蛋白铁(fe-protes,qf=8,590);灌注液中的铁添加水平分别为50(0.89mm)、100(1.78mm)、200(3.56mm)、400(7.12mm)和800(14.33mm)μg/ml。同时设置不添加铁的空白对照组,共21个处理。选用210只28日龄铁缺乏的商品代肉公鸡,按体重随机分为21个处理组(每个处理组10个重复,每个重复1只鸡),分别按上述灌注浓度灌注不同形态铁,于灌注后30min采样。结果表明:1)铁源影响(p<0.0001)肉仔鸡小肠铁吸收速率。中等和极强络(螯)合强度有机铁的吸收速率高于(p<0.05)无机硫酸亚铁,中等络合强度有机铁和极强络螯合强度有机铁有机铁之间,以及弱络合强度有机铁与其他铁源之间差异不显着(p>0.05);2)对不同形态铁吸收速率随其添加水平的变化趋势进行非线性回归拟合,发现肉仔鸡十二指肠中不同形态铁的吸收均为饱和载体转运过程。另外,中等络合强度有机铁的jmax值>(p<0.05)极强螯有机铁的jmax值>(p<0.05)弱络(螯)合强度有机铁及无机铁的jmax值。各铁源的km之间差异不显着(p>0.05);3)与空白对照组相比,灌注液中添加不同形态铁均抑制了肉仔鸡十二指肠中dmt1mrna表达约50%(p<0.0003),但提高其fpn1mrna表达水平约2-3倍(p<0.001)。但不同铁源间的dmt1和fpn1mrna表达水平之间无显着差异(p>0.14);4)灌注液中添加铁源对十二指肠dmt1和fpn1蛋白表达水平无显着影响(p>0.20)。本试验结果表明,有机铁源络(螯)合强度越大,铁吸收越多,但在肉仔鸡十二指肠中均以饱和载体转运方式吸收,DMT1和FPN1以外的载体可能参与了不同形态铁的吸收。综上所述,24种有机铁源的络(螯)合强度(Qf值)等化学特性变异很大;21日龄肉仔鸡肝脏和肾脏SDH mRNA表达水平是评价肉仔鸡对不同形态铁源生物学利用率的特异功能性敏感指标;十二指肠是肉仔鸡小肠铁吸收主要部位;肉仔鸡十二指肠和空肠铁吸收以饱和载体转运方式为主,回肠的铁吸收以非饱和扩散方式为主;有机铁源对肉仔鸡的相对生物学利用率及其小肠铁吸收均与其Qf值密切相关,Qf值越大,其铁吸收越多,铁相对生物学利用率越高;肉仔鸡十二指肠中除DMT1和FPN1以外的转运载体可能参与了不同形态铁的吸收,尚有待进一步研究。以上研究新成果对于我国肉鸡生产中科学研制开发和应用适宜络(螯)合强度的新型高效有机铁添加剂,以促进肉鸡健康和高效地生长发育,同时减少铁排出对环境的污染,保护生态平衡,都具有十分重要的理论与现实指导意义。
于昱[4]2008年在《不同形态锌在肉仔鸡小肠中的吸收特点及机理研究》文中研究说明在本实验室前期肉仔鸡锌营养研究成果的基础上,本论文研究共设五个试验,采用原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法研究不同络合强度有机锌及其与无机锌在肉仔鸡小肠中吸收特点的差异,并进一步探讨其具体吸收机理。试验一采用原位结扎灌注肠段法研究无机锌在肉仔鸡小肠中的吸收特点及其机理,共包括二个试验。试验1以硫酸锌为添加锌源,根据锌的吸收百分率与灌注时间的曲线关系,在二者的线性范围内确定肠段最佳灌注时间,为以后的试验在最敏感状态下研究锌吸收提供试验依据,并初步确定锌在肉仔鸡小肠中的主要吸收部位;试验2通过对锌吸收动力学特点的研究及对肉仔鸡不同肠段中MT、ZnT1、ZnT2和ZnT5基因表达的检测进一步阐明锌在肉仔鸡小肠各段中的吸收机理。试验1采用单因子完全随机试验设计,设灌注时间分别为5、15、30、45及60 min共5个处理组;试验2也采用单因子安排的完全随机设计,灌注液中以硫酸锌形式添加如下七个锌水平:0μg/ml(0 mM)、5μg/ml(0.077 mM)、10μg/ml(0.154 mM)、20μg/ml(0.308 mM)、40μg/ml(0.616 mM)、80μg/ml(1.232 mM)和160μg/ml(2.464 mM),共7个处理。结果表明:1)肉仔鸡结扎十二指肠、空肠及回肠的锌吸收随时间变化的曲线分别符合二次曲线、二次曲线及渐近线变化。在30min以下叁个肠段的锌吸收均呈线性增加,因此30min为结扎肠段的适宜灌注时间。2)在5μg/ml和10μg/ml锌添加水平下,回肠的锌吸收显着高于十二指肠(P<0.0001),高于空肠(P=0.1252);在其余锌添加水平下,回肠的锌吸收均显着高于十二指肠和空肠(P<0.0001),约为十二指肠的1-2倍,空肠的1-5倍。由此可以看出,回肠是肉仔鸡锌吸收的主要部位。3)对叁个肠段锌吸收速率随锌添加水平增加而变化的趋势进行动力学曲线拟合可知,回肠的锌吸收不同于十二指肠和空肠,以非饱和扩散过程为主,其P为5.72×10-3±1.1×10-4 cm2/min;而十二指肠和空肠的锌吸收则以饱和载体调节为主,其Jmax分别为5.32±1.46、2.57±0.39 nmol/min/cm, Km分别为1.44±0.33、0.51±0.17 mM。4)添加40μg/ml锌组十二指肠的MT、ZnT1mRNA表达量显着高于空肠和回肠(P≤0.0344),空肠和回肠之间表达量相近(P≥0.1257),而叁个肠段ZnT5mRNA表达量间无明显差异(P≥0.5398)。另外,回肠MT、ZnT1和ZnT5表达量在叁个肠段中均趋于最低。水平间比较的结果表明,补锌后显着提高十二指肠、空肠和回肠MTmRNA表达量(P<0.05),显着降低回肠ZnT5mRNA表达量(P=0.034);其它肠段的其它基因在补锌前后表达量未见显着变化(P≥0.1252),但是添加锌后十二指肠和回肠的ZnT1、ZnT2及十二指肠ZnT5mRNA表达量有降低的趋势,而空肠的叁个基因表达量却略有增加。不同锌水平间及不同肠段间ZnT2 mRNA表达量均无明显变化(P≥0.1232)。锌转运蛋白的基因表达差异进一步说明回肠锌吸收以扩散为主,而十二指肠和空肠的锌吸收与多种锌转运蛋白密切相关。试验二采用原位结扎灌注肠段法研究不同形态锌在肉仔鸡小肠中的吸收特点。采用单因子安排的完全随机设计,共设8个处理组,分别为:硫酸锌、甘氨酸锌螯合物、蛋氨酸锌螯合物、弱络合强度(Qf 6.48 )的复合氨基酸锌(ZnAAC)、中等络合强度(Qf 30.73)的锌蛋白盐B(ZnProB)和偏极强络合强度(Qf 944.02)的锌蛋白盐A(ZnProA)、硫酸锌与甘氨酸混合物及硫酸锌与蛋氨酸混合物的处理组。结果表明:1)无论是有机锌还是无机锌,其在回肠的锌吸收均显着高于十二指肠和空肠(P<0.0001),为后二者的1-3倍,进一步证明回肠是肉仔鸡小肠锌吸收的主要部位。2)在叁个肠段中,硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组锌吸收不仅没有高于硫酸锌组,反而有降低的趋势,除空肠中硫酸锌与甘氨酸混合物组锌吸收显着低于硫酸锌组外(P=0.0779),其余肠段中叁组间差异不显着(P>0.3140)。在十二指肠中,甘氨酸锌组、蛋氨酸锌组、弱络合强度ZnAAC组、中等络合强度ZnProB组及偏极强络合强度ZnProA组中锌的吸收比硫酸锌组、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组高44.94%-102.33%(P<0.02),吸收由低到高顺序为:硫酸锌与甘氨酸混合物组<硫酸锌与蛋氨酸混合物组<硫酸锌<蛋氨酸锌组<甘氨酸锌组<ZnAAC组< ZnProB组<ZnProA组;在空肠中,甘氨酸锌组、蛋氨酸锌组、弱络合强度ZnAAC组、中等络合强度ZnProB组及偏极强络合强度ZnProA组中锌的吸收比硫酸锌组、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组高29.35%-128.57% (P<0.04),吸收高低顺序为硫酸锌与甘氨酸混合物组<硫酸锌与蛋氨酸混合物组<硫酸锌<蛋氨酸锌组< ZnAAC组< ZnProB组<甘氨酸锌组<ZnProA组;在回肠中,甘氨酸螯合锌组及蛋氨酸螯合锌组锌吸收率比硫酸锌组(P≥0.1872)、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组(P≤0.0572)提高了9.13%-17.01%。弱、中、偏极强络合强度有机锌组、甘氨酸螯合锌组及蛋氨酸螯合锌组五个处理组间差异不显着(P≥0.2713),偏极强络合强度ZnProA组锌吸收率显着高于硫酸锌组、硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组(P≤0.0906);中等络合强度ZnProB组高于硫酸锌组(P=0.2656),显着高于硫酸锌与甘氨酸混合物组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组(P≤0.0869);而弱络合强度ZnAAC组高于硫酸锌组及硫酸锌与蛋氨酸混合物组(P≥0.2130),显着高于硫酸锌与甘氨酸混合物组(P=0.0784)。以上结果表明,有机锌与无机锌在回肠的吸收差异不显着,而在十二指肠和空肠中差异显着;螯合的有机锌在肉仔鸡小肠中的吸收率比无机形态锌的高,且有机锌的络合强度与其在肉仔鸡小肠内的吸收有密切相关性,其中偏极强络合强度有机锌的吸收最好,中等络合强度有机锌的次之,弱络合强度有机锌的最差;将蛋氨酸及甘氨酸与硫酸锌简单地混合,不能改善锌的吸收,进一步说明配体是促进还是抑制元素吸收,与配体与元素的络合(螯合)程度密切相关。试验叁在试验二基础上,筛选出几种吸收较好的有机锌源,采用原位结扎灌注肠段法研究在高植酸条件下,有机锌的吸收是否好于无机锌,进一步验证在消化道逆环境中有机锌相对于无机锌的优越性。采用4×3双因子完全随机设计,取肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠灌注,灌注液中分别添加试验二中确定的吸收效果较好的叁种有机锌源:弱络合强度(Qf 6.48 )的复合氨基酸锌(ZnAAC)、中等络合强度(Qf 30.73)的锌蛋白盐B(ZnProB)和偏极强络合强度(Qf 944.02)的锌蛋白盐A(ZnProA),还有硫酸锌,并在添加四种锌源的灌注液中分别添加植酸,使其与锌摩尔比分别为2:1和10:1或不添加植酸,同时设置不添加锌与植酸的空白对照组,共13个处理。结果表明:1)无论是有机锌还是无机锌,在不同植酸添加水平下,其在回肠的锌吸收均显着高于十二指肠,为十二指肠的1-2倍(P<0.005),也高于空肠,除不添加植酸的弱和中等络合强度有机锌组差异显着外(P<0.05),其余各组二个肠段间差异不显着(P≥0.1172),再次表明,回肠是肉仔鸡小肠锌吸收的主要部位。2)植酸水平与锌源互作非常显着(P<0.0001)。在肉仔鸡十二指肠、空肠及回肠中,当添加植酸与锌的摩尔比为2:1时,硫酸锌组锌吸收比未添加植酸的硫酸组分别降低9.06%(P=0.1020)、6.17%(P=0.0006)及3.50%(P =0.0083);弱络合强度ZnAAC组锌吸收比未添加植酸的ZnAAC组分别降低4.73%(P=0.3998)、6.40%(P=0.0009)及5.75%(P<0.0001);中等络合强度ZnProB组锌吸收比未添加植酸的ZnProB组分别降低7.09%(P=0.1814)、5.14%(P=0.0050)及5.66%(P< 0.0001);偏极强络合强度ZnProA组锌吸收比未添加植酸的ZnProA组分别降低5.30%(P= 0.3416)、3.82%(P=0.1195)及3.13%(P=0.0199)。当添加植酸与锌的摩尔比为10:1时,硫酸锌组锌吸收比未添加植酸的硫酸组分别降低40.22%、25.65%及21.34%(P<0.0001);弱络合强度ZnAAC组锌吸收比未添加植酸的ZnAAC组分别降低50.18%、20.54%及19.49%(P <0.0001);中等络合强度ZnProB组锌吸收比未添加植酸的ZnProB组分别降低34.75%、24.12%及23.27%(P<0.0001);偏极强络合强度ZnProA组锌吸收比未添加植酸的ZnProA组分别降低8.13%(P=0.1387)、8.28%(P<0.0001)及8.46%(P<0.0001)。添加植酸与锌的摩尔比为10:1与2:1相比时,除十二指肠中偏极强络合强度ZnProA组锌吸收差异不显着外(P= 0.5918),其余各组各肠段的锌吸收均有明显差异(P<0.02)。说明在肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠中,添加植酸明显降低不同形态锌的吸收率,并且随植酸与锌的摩尔比增加,锌吸收降低幅度增加,这种影响在十二指肠中表现得更为明显;不同络合强度的有机锌均表现出一定的抗植酸络合作用,从而降低植酸对锌吸收的负面影响。其中,在肉仔鸡叁个肠段中,偏极强络合强度有机锌在消化道中不易解离,更能抵抗植酸的络合作用从而更有利于锌的吸收。试验四在前面试验的基础上,采用原位结扎灌注肠段法深入研究不同形态及络合强度锌的吸收动力学特点,探讨其在肉仔鸡小肠中吸收存在差异的机理。采用4×6双因子完全随机设计,取肉仔鸡十二指肠灌注,灌注液中添加无机锌及试验二和试验叁确定的吸收效果比较好的弱络合强度(Qf 6.48)的复合氨基酸锌(ZnAAC)、中等络合强度(Qf 30.73 )的锌蛋白盐B(ZnProB)和偏极强络合强度(Qf 944.02)的锌蛋白盐A(ZnProA)共四种锌源,锌添加水平分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/ml。同时设置不添加锌的空白对照组,共25个处理。结果表明:1)在5μg/ml和10μg/ml锌添加水平下,不同形态锌间锌吸收速率无显着差异(P≥0.2759);而在其余锌添加水平下,有机锌组锌吸收均高于无机锌。2)对不同形态锌吸收速率随其添加水平的变化趋势进行非线性回归拟合,发现肉仔鸡十二指肠中不同形态锌的吸收均为饱和载体参与调节的过程。有机锌与无机锌的吸收机理一样,说明有机锌可以通过无机锌的吸收途径被吸收,即有机锌通过避免肠腔中沉淀剂对矿物元素的沉淀或吸附作用(试验叁结果表明不同络合强度有机锌可以抵抗植酸的络合从而更多地被吸收),而直接到达小肠刷状缘,并在吸收位点处发生水解,其中的锌以离子形式被吸收。另外,随有机锌的络合强度增加,其Km值也逐渐递增,且均高于无机锌。Jmax也表现出同样的变化趋势(P<0.01)。说明虽然不同形态锌的吸收均为饱和载体调节过程,但参与锌吸收的锌转运蛋白种类或表达量可能不同,因为锌转运蛋白不同,其与锌的结合能力是不同的。3)与不添加锌的空白对照组相比,灌注液中添加不同形态锌均增加肉仔鸡十二指肠中MTmRNA表达量。其中,不同络合强度有机锌组MTmRNA水平为对照组的1.5-2倍(P<0.07),而ZnSO4组为对照组的1.2倍左右(P=0.4156)。偏极强络合强度ZnProA组MTmRNA水平最高,高于弱络合强度ZnAAC组(P=0.2290),显着高于中等络合强度ZnProB组和ZnSO4组(P<0.03)。弱络合强度ZnAAC组MTmRNA水平高于中等络合强度ZnProB组(P=0.2628),显着高于ZnSO4组(P=0.0324)。中等络合强度ZnProB组和ZnSO4MTmRNA水平间无显着差异(P=0.2835)。说明补锌确可增加MT转录水平的基因表达。而与无机锌相比,不同络合强度有机锌均可增加MTmRNA表达量,其中中等络合强度有机锌组与无机锌组间无显着差异,而偏极强和弱络合强度有机锌组则显着高于无机锌组(P<0.04)。由于MT的表达与锌吸收呈反比,因此本试验中有机锌组MT表达高于无机锌组无法解释有机锌吸收好于无机锌,说明还有其它的锌转运蛋白参与调节锌吸收,并进一步验证吸收动力学研究结果,即参与调节不同形态锌吸收的转运载体的种类或者表达量不同。试验五采用全体内法-自然饲喂法研究在保持机体正常生理状态下,不同形态及络合强度有机锌对肉仔鸡肝门静脉血浆锌含量及其小肠中MTmRNA水平的影响,探讨其吸收差异及机理,以进一步验证前面的试验结果。采用单因子完全随机试验设计,饲粮中按肉鸡锌营养需要量分别添加硫酸锌、试验二和试验叁确定的吸收效果比较好的弱络合强度(Qf 6.48)的复合氨基酸锌(ZnAAC)、中等络合强度(Qf 30.73 )的锌蛋白盐B(ZnProB)和偏极强络合强度(Qf 944.02)的锌蛋白盐A(ZnProA)共四种锌源,同时设置不添加锌的空白对照组,共5个处理。结果表明:1)在试验的第7天(21日龄),无机硫酸锌组、弱络合强度、中等络合强度及偏极强络合强度有机锌组鸡肝门静脉血浆锌含量比对照组增加了23.44%-34.48%(P<0.005)。而不同络合强度有机锌组血浆锌含量比硫酸锌组增加了6.75%-8.86%(P≥0.1571)。在第14天(28日龄),无机硫酸锌组、弱络合强度、中等络合强度及偏极强络合强度有机锌组血浆锌含量比对照组增加了31.94%-42.93%(P<0.0001),而其中偏极强络合强度有机锌组血浆锌含量比中等络合强度有机锌组增加了1.49%(P=0.7415),比弱络合强度有机锌组和硫酸锌组增加了7.48%-8.33%(P<0.07);中等络合强度有机锌组血浆锌含量高于无机硫酸锌组和弱络合强度有机锌组,但差异不显着(P≥0.1029)。无机硫酸锌组和弱络合强度有机锌组血浆锌含量无显着差异(P=0.9156)。说明有机锌的吸收好于无机锌,且偏极强络合强度有机锌吸收效果最好。2)在叁个肠段中,与不添加锌的空白对照组相比,饲粮中添加不同形态锌均显着增加肉仔鸡MTmRNA表达量(P<0.0001)。其中,在十二指肠和回肠中,不同形态锌间MTmRNA水平差异不显着(P≥0.2727);在空肠中,不同形态锌间MTmRNA水平差异显着(P<0.0001)。其中,弱络合强度ZnAAC组MTmRNA水平高于ZnSO4组和偏极强络合强度ZnProA组(P≥0.4649),显着高于中等络合强度ZnProB组(P<0.03)。而ZnSO4组MTmRNA水平高于偏极强络合强度ZnProA组(P=0.7817),显着高于中等络合强度ZnProB组(P=0.0601)。中等络合强度ZnProB组和偏极强络合强度ZnProA组MTmRNA水平间无显着差异(P=0.1051)。同一锌源在不同肠段中MTmRNA水平差异显着(P<0.0001)。其中,除空白对照组与中等络合强度ZnProB组在回肠中的MTmRNA水平低于空肠(P≥0.1663),显着低于十二指肠(P<0.0003),而空肠又显着低于十二指肠(P<0.003)外,其余锌源在回肠中的MTmRNA水平均显着低于空肠和十二指肠(P<0.001),而空肠又显着低于十二指肠(P<0.0001)。说明与无机锌相比,不同络合强度有机锌均可增加肉仔鸡小肠中MTmRNA表达量,其中中等络合强度有机锌组与无机锌组间无显着差异,而偏极强和弱络合强度有机锌组则显着高于无机锌组。并且由于MT的表达与锌吸收呈反比,因此有机锌组MT表达高于无机锌组无法解释有机锌吸收好于无机锌,再次说明可能还有其它的锌转运蛋白参与调节锌吸收。另外,本试验中不同锌源在回肠的MTmRNA水平均最低,明显低于十二指肠和空肠。该结论与试验一研究结果一致,提示有机锌在回肠的吸收途径可能与无机锌类似,也是通过不依赖于载体调节的非饱和扩散被吸收的。而且本试验结果进一步验证了试验四的推测,即有机锌吸收极有可能符合竞争吸收假说,即可解离成离子后通过无机锌的吸收途径被吸收。综上所述,螯合的有机锌在肉仔鸡小肠中的吸收率比无机形态锌高,且有机锌的络合强度与其在肉仔鸡小肠内的吸收有密切相关性,其中偏极强络合强度有机锌的吸收最好,中等络合强度有机锌的次之,弱络合强度有机锌的较差。而且,不同络合强度有机锌均表现出一定的抗植酸络合作用,从而降低植酸对锌吸收的负面影响。其中,偏极强络合强度有机锌在消化道中不易解离,更能抵抗植酸的络合作用从而更有利于锌的吸收。有机锌在十二指肠中的吸收机制与无机锌一样,均以饱和载体调节为主;与无机锌相比,有机锌可增加肉鸡小肠MT基因表达,不同形态锌有可能通过对其它锌转运蛋白如ZnT1和ZnT5等表达的不同调节从而导致其吸收存在差异。有机锌吸收极有可能符合竞争吸收假说,即有机锌可以通过无机锌的吸收途径被吸收。以上研究新成果对于我国肉鸡生产中科学研制开发和应用适宜络合强度的新型高效有机锌添加剂,以促进肉鸡生长发育,同时减少锌排出对环境的污染,保护生态平衡,都具有十分重要的理论与现实指导意义。
徐运杰[5]2009年在《鸡小肠离体培养条件优化及在饲料磷效价评定中的应用研究》文中研究说明本试验用外翻肠囊法初步探讨了不同培养温度、不同培养时间、培养液不同pH值和磷浓度对离体培养鸡小肠的磷吸收和肠粘膜细胞活性的影响,并进一步研究了用外翻肠囊法评定饲料有效磷的可行性和中草药添加剂对离体培养鸡小肠的磷吸收和肠粘膜细胞活性的影响。本研究包括叁个试验。试验一离体鸡小肠培养条件优化选用30日龄、体重468.64±31.74g的叁黄公鸡132只,采用4个单因子完全随机试验和1个3×3正交试验,研究了不同培养温度、培养时间、培养液不同pH值和磷浓度对生长肉鸡离体小肠磷吸收和肠粘膜细胞活性的影响。结果表明：①在0～60min,培养液中乳酸脱氢酶活力上升较缓慢,60min后上升幅度较快。②培养温度在30℃～38℃时,肠囊磷吸收量与温度呈正相关(R2=0.9465),38℃时肠囊的磷吸收量显着高于30℃和34℃时肠囊的磷吸收量(P<0.05),42℃时,肠囊的磷吸收量极显着降低(P<0.01)；培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性与培养温度呈线性关系,培养温度在30℃～38℃时,培养液中LDH活性没有明显差异(P>0.05),但42℃时培养液中LDH活性极显着高于其它处理(P<0.01)。③培养液磷含量在50μg／ml～200μg／ml时,肠囊的磷吸收量与磷含量呈正相关(R2=0.8998),但当磷含量增加到400μg／ml,十二指肠肠囊和空肠肠囊的磷吸收量开始降低；磷吸收率与培养液磷含量之间呈负相关(R2=0.8439),不同处理之间差异极显着(P<0.01)。④pH 5.0～7.0时,肠囊的磷吸收量线性增加,pH8.0时,肠囊的磷吸收量降低,与pH5.0比较,pH7.0时,肠囊的磷吸收量极显着增加(P<0.01)；培养液中LDH活力受pH影响较大,pH5.0～7.0之间时,培养液中LDH活性线性降低,pH7.0时,培养液中LDH活性都极显着低于pH5.0时LDH活性(P<0.01),与pH6.0之间没有明显差异(P>0.05),当培养液pH升高到8.0时,培养液中LDH活性反而增加。综合分析,以培养液中LDH活力变化和肠囊磷吸收量变化为判断指标,肉仔鸡外翻肠囊的适宜培养时间约为40～50min适宜培养温度以36℃～38℃为宜；适宜pH范围是6.0～7.0；以叁黄肉仔鸡小肠为试验材料,用外翻肠囊法评定饲料磷吸收速率时,培养液中磷含量不要超过200gg／ml,用外翻肠囊法评定饲料磷生物学效价时,培养液中磷含量以50μg／ml左右为宜。试验二鸡离体小肠评定植物性饲料磷生物学效价的研究本试验研究了鸡离体小肠对玉米、豆粕、麦麸、统糠和菜粕5种植物性饲料磷的体外吸收率,旨在探讨用外翻肠囊法评定养分生物学效价的可行性。选用30只40日龄体重相近的叁黄公鸡,随机分成5个处理,每个处理6个重复,每个重复1只鸡。每只鸡的空肠前段制成两个肠囊,40℃条件下培养50min,分别测定肠囊对不加植酸酶和加植酸酶两种不同处理植物性饲料中磷的吸收率。结果表明：体外吸收率与真消化率之间虽然相关性较好。试验叁中草药提取物对鸡离体小肠磷吸收和细胞活性的影响本试验主要研究了中草药提取物对鸡离体小肠磷吸收和肠黏膜细胞活性的影响,旨在初步探索中草药对饲料磷吸收利用的影响机制。采用单因子完全随机设计,36只40日龄体重相近的叁黄公鸡随机分成6个组,每组6个重复,每个重复1只鸡。测试了白头翁、马齿苋、大青叶和秦皮四味中草药的单一提取物及其组合方剂对磷吸收和肠黏膜细胞活性的影响。结果表明：大青叶和秦皮对磷的吸收和肠黏膜细胞活性有负作用,白头翁、马齿苋和混合方剂对磷的吸收和肠黏膜细胞活性有正效应。试验结论：不同中草药提取物对鸡离体小肠肠黏膜细胞活性和磷吸收有不同的影响,但具体原因还有待进一步研究。
刘凌云[6]2006年在《乙二胺四乙酸铁钠吸收机理研究》文中指出乙二胺四乙酸铁钠(NaFeEDTA)是一种新型的螯合型铁营养强化剂,近年来由于其在预防缺铁性贫血方面具有显着效果而备受关注。1993年,隶属国际食品法典委员会的国际权威机构JECFA经过全面评价后推荐NaFeEDTA作为铁营养强化剂使用。作为食品营养强化剂,NaFeEDTA具有口感好,铁锈味较小,未见胃肠刺激,不易受铁吸收抑制剂的干扰,对载体食物的感官和理化品质影响小,在人体中的吸收利用率高等特点,是目前公认的综合性能较好的铁营养强化剂。NaFeEDTA作为铁强化剂,其生物利用率比其他强化剂如FeSO_4高2-3倍,在预防和控制缺铁性贫血方面取得了很大的成效,但是NaFeEDTA在生物体胃肠道吸收的机理还没有得到较明确的阐述。本实验采用体外模型法、透析袋模型法和外翻肠囊法叁种方法探讨了NaFeEDTA可能的吸收机理。 通过体外模型法研究发现:NaFeEDTA在pH为2～7.5的条件下化学稳定性较好;在模拟生物体胃肠液环境的人工胃肠液中NaFeEDTA没有发生任何变化,生物体消化道分泌的消化酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)对NaFeEDTA的稳定性没有影响;在人工胃肠液中加入草酸和植酸后,当Fe∶草酸(植酸)的摩尔比为1∶1,1∶3,1∶5和1∶8时,NaFeEDTA均可以稳定存在,表明草酸和植酸不能够从络合强度足够大的FeEDTA螯合物中“抢夺”其中的叁价铁离子。由此推测NaFeEDTA在生物体的胃肠道溶液中的化学稳定性较高。 透析袋模型实验发现,NaFeEDTA在透析袋内透过量的大小与渗透时间有关。2h时透析袋内NaFeEDTA浓度为透析袋外的61%,4h时为84%,6h时达到94%,8h后透析袋内、外NaFeEDTA浓度几乎达到平衡。再次表明NaFeEDTA可以整体形式存在于模拟胃肠液环境中,并以整体形式通过透析袋,NaFeEDTA的肠粘膜通透性良好。由此推测生物体对NaFeEDTA的吸收可能是通过小肠粘膜细胞的整体吸收。 外翻肠囊法通过采用体外培养大鼠十二指肠、空肠和回肠的外翻肠囊来考察不同肠段粘膜吸收细胞对NaFeEDTA的摄取情况。实验发现:十二指肠、空肠和回肠肠囊在含有NaFeEDTA的粘膜测培养液中培养一段时间后,浆膜测肠囊内的溶液中均能检测到NaFeEDTA的存在,且随着培养时间的延长,肠囊内溶液中NaFeEDTA的含量呈逐渐增加的趋势,表明NaFeEDTA可以整体的形式被肠粘膜上皮吸收细胞所摄取。进一步比较肠囊内溶液中总铁和NaFeEDTA的浓度,发现两者之间没有显着差异,表明总铁中的铁全部来自于NaFeEDTA,即NaFeEDTA全部是以整体形式摄取的。叁段肠段之间的比较发现,在相同的培养时间条件下,空肠肠囊内透过的NaFeEDTA的量大于十二指肠的,而回肠的又大于空肠的,说明回肠更有利于摄取NaFeEDTA。在培养液中加入草酸和植酸后,NaFeEDTA透过肠囊的量与不加入的差异不显着,表明在小肠上皮吸收细胞摄取NaFeEDTA的过程中,草酸和植酸可能没有影响。
参考文献：
[1]. 不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收机理研究[D]. 白世平. 中国农业科学院. 2008
[2]. 用体外法和体内法研究有机锰在肉仔鸡小肠中的吸收特点[D]. 计峰. 中国农业科学院. 2003
[3]. 有机铁源的化学特性、对肉仔鸡的相对生物学利用率及其小肠铁吸收研究[D]. 张伶燕. 中国农业科学院. 2016
[4]. 不同形态锌在肉仔鸡小肠中的吸收特点及机理研究[D]. 于昱. 中国农业科学院. 2008
[5]. 鸡小肠离体培养条件优化及在饲料磷效价评定中的应用研究[D]. 徐运杰. 湖南农业大学. 2009
[6]. 乙二胺四乙酸铁钠吸收机理研究[D]. 刘凌云. 河北农业大学. 2006