郭海霞[1]2012年在《小分子酸改性啤酒废酵母对蛋白质吸附性能的研究》文中研究说明蛋白质在生物体的形成、生长和发育的过程中有着极其重要作用。随着现代科学的发展和人类需求的增长，科学研究和临床实验对纯度高和质量好的蛋白需求越来越大。但由于生命物质的特殊性，能单一且稳定存在的蛋白质较少。所以需要用科学的方法分离、纯化蛋白质。用吸附的方法纯化和分离蛋白质，与其他的方法相比，操作简便、设备简单、处理时间短且成本低廉。研究开发新型的具有高选择性、高效率和经济实用的吸附剂，仍是如今科学研究领域的一个热点。啤酒废酵母菌是啤酒工业的废弃物，在处理工业废水中应用较广泛。通过对啤酒废酵母菌进行化学修饰，可以在其表面接枝具有特异吸附性的官能团。不仅实现了废物的再生利用，节省资源，而且能实现其在其它方面的价值。以下工作是把几种常见的小分子酸修饰到啤酒废酵母菌表面，制备成一批新的生物吸附剂，并以其为对象，用各种仪器和方法进行表征。探讨了合成的目标产物对以下叁种常见蛋白质或酶(溶菌酶、牛血清白蛋白和牛血红蛋白)的吸附效果。具体工作如下：1、以NaH2PO4为催化剂，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，用柠檬酸修饰交联度1%的啤酒废酵母菌，制备了一种新的吸附剂（简称修饰酵母菌）。用红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)及表面氢离子含量的测定对产物进行了表征。用制备的吸附剂分离、纯化溶菌酶。考察了溶液的pH、温度、吸附时间、溶菌酶的初始浓度、NaCl离子强度等因素对吸附效果的影响。确定最佳吸附条件：吸附酸度pH7.4，吸附温度25℃，吸附时间40min。修饰酵母菌的最大吸附容量为954.7mg.g~(-1)，未修饰酵母菌最大吸附容量为89.9mg.g~(-1)，前者是后者的10.6倍。用该吸附剂从鸡蛋清处理液中提取溶菌酶，用1.0mol.L~(-1)NaCl水溶液洗脱，洗脱率为84.8%，活力收得率为71.3%，纯化倍数27.5。鸡蛋清处理液和吸附提取后洗脱液的电泳结果表明，该法从鸡蛋清中富集溶菌酶效果明显，酶纯度高。修饰酵母菌重复使用叁次，吸附率仅降低3%。用Langmuir和Freundich模型对吸附过程进行模拟，修饰酵母菌对溶菌酶的吸附能较好的符合Langmuir吸附模型。2、以吡啶为溶剂，将马来酸酐接枝到啤酒废酵母菌的表面，洗涤、烘干后，用饱和NaHCO3处理。制得马来酸酐修饰的啤酒废酵母菌吸附剂。在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以尿素为介质，将磷酸修饰到啤酒废酵母菌的表面。并通过修饰前后重量的变化、红外光谱、X射线光电子能谱及H+含量的滴定，对交联菌和两种修饰菌进行表征。表征结果证明马来酸酐和磷酸成功的和酵母菌表面的-OH反应，合成了目标吸附剂。分别以两种合成的产物为吸附剂，溶菌酶为吸附对象进行吸附条件实验。实验结果表明，马来酸酐修饰菌对溶菌酶的吸附未得到明显改善，最大吸附容量和未修饰菌较接近，仅是为未修饰菌的1.3倍。有意义的是，溶液的酸度对磷酸修饰菌吸附溶菌酶的影响不大，吸附过程较快，20min能达到吸附平衡，最大吸附容量为1423.2mg.g~(-1)，是未修饰菌（89.9mg.g~(-1)）的15.8倍，以1.0mol.L~(-1)pH7.0的NaCl溶液为洗脱液，洗脱率高达86.2%。将该吸附剂用于从鸡蛋清中提取溶菌酶，并对酶活力进行测定，总活力收得率为65.0%，纯化倍数为29.1。用两种吸附模型对吸附过程进行模拟，发现两种修饰菌均符合Langmuir模型。说明吸附剂对溶菌酶的吸附是单分子层吸附为主。3、以牛血清白蛋白为吸附对象，柠檬酸和马来酸酐修饰菌为吸附剂进行实验，结果发现柠檬酸修饰菌对牛血清白蛋白的最佳吸附条件为，吸附时间12h、吸附酸度pH4.0、吸附温度25℃，最大吸附容量为242.6mg.g~(-1)，是未修饰菌(31.4mg.g1)的7.7倍。马来酸酐修饰啤酒废酵母菌对牛血清白蛋白的最佳吸附条件为吸附时间20h、吸附酸度pH6.6、吸附温度25℃，最大吸附容量为162.9mg.g~(-1)，是未修饰菌(31.4mg.g1)的5.2倍。用Langmuir和Freundlich模型对柠檬酸修饰菌和马来酸酐修饰菌吸附等温线进行模拟，发现两种修饰菌对牛血清白蛋白的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式，表明牛血清白蛋白的吸附是以单分子层吸附为主。以0.5mol.L~(-1)咪唑水溶液为洗脱液，洗脱柠檬酸吸附的牛血清白蛋白，一次洗脱率达到69.6%。4、将磷酸、柠檬酸、马来酸酐修饰啤酒废酵母菌用于吸附牛血红蛋白的研究，实验发现叁种吸附剂的最佳酸度为pH5.0，磷酸修饰菌能在很短的时间内达到吸附平衡，柠檬酸修饰菌需要12h，马来酸酐修饰酵母菌对牛血红蛋白几乎不吸附。磷酸、柠檬酸修饰酵菌对牛血红蛋白的吸附容量较大。分别为309.8mg.g~(-1)和369.8mg.g~(-1)。与未修饰菌相比吸附容量有了很大的提高。
厉林静[2]2012年在《用修饰花生壳粉吸附剂提取纯化蛋白质的研究》文中指出蛋白质作为生命现象中最基本的基础物质之一，其分离纯化一直以来受到广泛关注，人类对蛋白质的研究也越来越多，而已报道的纯化方法如高效液相色谱、亲和层析、电泳等大多成本高、操作繁琐，用吸附的方法纯化和分离蛋白，与上述方法相比，具有操作简便，处理时间短且成本低廉等优点。本文选用天然生物质—花生壳作为原料，通过化学反应在其表面接枝具有特异性吸附作用的官能团或简单的酸碱活化制备而成不同的吸附剂，很大程度地改善了其吸附性能，拓宽了其应用范围，成功地实现了废弃物的再利用，具体工作如下：1、通过简单的化学反应将丁二酸酐修饰到戊二醛交联花生壳粉上，再用饱和碳酸氢钠处理，借称重、红外光谱、XPS能谱对产物进行了表征。以细胞色素C为吸附对象进行了一系列吸附条件实验（包括溶液酸度、细胞色素C的初始浓度、NaCl的浓度等）。结果发现，最佳的吸附条件为pH5.0、25℃、吸附3h，丁二酸酐修饰花生壳粉的最大吸附容量为432.6mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟修饰花生壳粉吸附细胞色素C的吸附等温线，R2>0.99，拟合的理论最大吸附容量为454.5mg.g~(-1)，与实验值接近。将修饰花生壳粉用于提取猪心肌中的细胞色素C，用1.5mol.L-1NaCNS水溶液洗脱，洗脱率为89.9%，活力收得率为74.0%，纯化倍数为13.5。2、以1-甲基咪唑为修饰剂、戊二醛为交联剂制备成新的吸附剂，通过称重、红外光谱、XPS能谱分别对原始、交联、修饰花生壳粉进行了表征。以溶菌酶为吸附对象进行了一系列吸附条件实验，比较了修饰花生壳粉与原始、交联花生壳粉的吸附性能。实验结果表明，修饰花生壳粉的最大吸附容量为194.6mg.g~(-1)，分别是原始和交联花生壳粉的1.9、1.3倍，叁种吸附剂均在pH10.7时达最大吸附容量，表现为以疏水作用为主进行吸附。用Langmuir和Freundlich模型对吸附过程进行模拟，结果发现能很好的符合Langmuir模型。用1-甲基咪唑修饰的花生壳粉提纯鸡蛋清中的溶菌酶，得到较高的活力收得率和纯化倍数，电泳结果表明提纯后的溶菌酶纯度较高。3、将丁二酸酐修饰花生壳粉、1-甲基咪唑修饰的花生壳粉用于过氧化氢酶的吸附，并与戊二醛交联花生壳粉进行了比较。探索了溶液酸度、过氧化氢酶的初始浓度、吸附剂用量、NaCl的浓度等因素对吸附的影响。结果发现，酸度对吸附的影响较大，只有在接近过氧化氢酶的等电点，即pH7.0时吸附率较高，说明吸附是以疏水作用为主进行的。两种修饰后的花生壳粉的最大吸附容量是交联花生壳粉的2倍，说明修饰后的吸附性能优于修饰前。分别用Langmuir和Freundlich模型对过氧化氢酶的吸附等温线进行拟合，所得相关系数表明能很好的符合Langmuir模型。同时还研究了多种洗脱剂对过氧化氢酶的洗脱效果，发现用内含0.5mol.L-1NaCNS、pH9.0的磷酸缓冲溶液作为洗脱剂的效果最好，其二次洗脱率可达83.5%。分别用丁二酸酐修饰花生壳粉和1-甲基咪唑修饰花生壳粉从猪心肌中提取过氧化氢酶，活力收得率分别为63.2%、71.6%，纯化倍数分别为17.7和11.3。4、分别用氢氧化钠、柠檬酸、磷酸对原始花生壳粉进行简单的酸碱处理，去掉其中的碱溶性和酸溶性物质，使花生壳粉中的活性基团暴露出表面以增加有效吸附位点，用FT-IR、XPS能谱对制备的吸附剂进行了表征。以溶菌酶为吸附对象进行了吸附条件的探索，实验结果表明，在pH7.0、25℃、吸附12h时，对溶菌酶的最大吸附容量表现为：磷酸活化>柠檬酸活化>氢氧化钠活化>原始花生壳粉。用经过活化后的叁种花生壳粉提取鸡蛋清中的溶菌酶，均得到了较高的活力收得率和纯化倍数。
卢艳敏[3]2012年在《聚合物或离子液体/柠檬酸钾双水相分离纯化蛋白质的研究》文中认为双水相萃取技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的、引人注目的、极有前途的分离技术。它作为一种新型的液-液萃取技术已被广泛应用于生物化工、生物化学和细胞生物学等领域,具有广阔的应用前景。本文选取了聚乙二醇、咪唑类溴盐/柠檬酸钾两种类型的双水相体系研究了蛋白质的分离纯化。论文的主要工作归纳如下：1.聚乙二醇(PEG)、咪唑类溴盐离子液体/柠檬酸钾双水相相平衡的性质研究用浊点滴定法测定了聚乙二醇、咪唑类溴盐/柠檬酸钾两种类型的双水相体系相图。结果表明,各PEG和离子液体的成相能力分别为PEG6000>PEG4000>PEG2000>PEG1000：[C2mim]Br<[C4mim]Br<[C6min]Br。对于PEG/柠檬酸钾体系,随着温度的升高系线的斜率和长度逐渐增大；外加中性盐对该体系的分相有一定的协助作用。对于咪唑类溴盐离子液体/柠檬酸钾体系,研究发现在浊点附近体系中柠檬酸钾的量对体系的R值和F值影响显着。本章研究为以后实验提供了基础数据和必要的理论指导。2.聚乙二醇/柠檬酸钾双水相体系萃取牛血清蛋白的研究首次采用聚乙二醇(PEG)/柠檬酸钾双水相体系实现牛血清蛋白(BSA)的萃取和反萃取。研究了聚乙二醇分子量(PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000)、聚乙二醇浓度、柠檬酸钾浓度、牛血清蛋白浓度、体系的pH和体系温度对萃取性能的影响。发现在PEG1000/柠檬酸钾双水相体系中,pH对牛血清蛋白分配的影响显着。BSA在该双水相体系中的分配系数Ka和萃取率Ye随pH增大而增大。当体系的pH和温度分别为7.0和30℃,体系组成为19%(w/w)PEG1000/20%(w/w)柠檬酸钾,BSA浓度为0.75mg/g时,牛血清蛋白在该体系中的萃取率高达99%。通过降低体系的pH值,我们实现了PEG相中牛血清蛋白的反萃取,其反萃取率为92%。反萃取过程不仅实现了牛血清蛋白与聚乙二醇的分离,而且能使聚乙二醇得以重复利用。最终,牛血清蛋白在整个过程中的萃取率(Ye+Ybe)为91%。3.离子液体双水相体系萃取分离细胞色素c的热力学研究研究了咪唑类离子液体双水相体系对细胞色素c(Cyt-c)的萃取。研究了离子液体阳离子的烷基链长度、柠檬酸钾浓度、温度、pH等因素对Cyt-c萃取率的影响。得出了萃取Cyt-c过程的相关热力学参数的值(△G°T,△H°T和△S°T)。热力学研究发现疏水作用和静电作用是该体系实现Cyt-c萃取的主导作用力。在最佳条件下,1-已基-3-甲基咪唑溴盐/柠檬酸钾双水相体系将Cyt-c萃取到富含离子液体的上相(萃取率为94%)。从UV-vis和圆二色谱(CD)表征结果可以看出Cyt-c与离子液体之间没有形成化学键并保持了Cyt-c结构特征。与传统液液萃取技术(含有大量的挥发性有机溶剂)相比,离子液体双水相萃取技术占有很大的优势。4.利用聚乙二醇(PEG)/柠檬酸钾双水相体系从鸡蛋清中分离纯化溶菌酶的研究双水相萃取技术适用于生物物质的分离,具有良好的发展前景。利用PEG4000/柠檬酸钾双水相体系研究了鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化。通过响应曲面法(RSM),确定了从鸡蛋清中提取溶菌酶的最优化条件并建立了溶菌酶回收率、纯化系数和活性产率的数学模型。部分析因实验分析结果显示,pH对溶菌酶的回收和纯化效果均有较大影响。在pH为5.5、温度为30℃的条件下,该体系萃取分离溶菌酶的最优体系组成为：18%(w/w)PEG4000,16%(w/w)柠檬酸钾,3.75%(w/w)KCl。在该条件下,纯化后溶菌酶的活性、纯化系数和活性产率分别为31100U/mg,21.11和103%。实验结果证明PEG4000/柠檬酸钾双水相体系在分离纯化溶菌酶的应用方面具有潜在的应用价值。5.从木瓜蛋白酶制剂中分离纯化木瓜蛋白酶的研究利用聚乙二醇(PEG)/柠檬酸钾双水相体系研究了从粗制木瓜蛋白酶制剂中提取木瓜蛋白酶的研究。考察了聚乙二醇分子量(PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000)、聚乙二醇的浓度、柠檬酸钾的浓度、外加中性盐(氯化钾)的浓度、pH和温度等因素对木瓜蛋白酶纯化的影响。实验结果显示木瓜蛋白酶倾向于分配到双水相体系中亲水性较强的下相(富含盐的相),且最优化体系为PEG4000/柠檬酸钾体系。在此基础上,我们通过响应面法建立了关于木瓜蛋白酶纯化的数学模型并确定了该体系纯化木瓜蛋白酶的最优化条件。在pH为5.0、温度为30℃的条件下,该体系纯化木瓜蛋白酶的最佳体系组成为：PEG4000浓度15%(w/w),柠檬酸钾浓度17%(w/w),KCl浓度5.0%(w/w)。在该条件下,纯化后木瓜蛋白酶的比活度、纯化系数和活性产率分别为1703.02U/mg,1.89和94%。SDS-PAGE电泳实验显示与酶制剂溶液的蛋白带相比下相溶液的蛋白带明显减少。该体系在木瓜蛋白酶的纯化方面有潜在的应用价值。
张永红[4]2013年在《修饰玉米芯亲和吸附剂的制备及对蛋白质的吸附研究》文中认为蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，人类对蛋白质的研究越来越多，而各种蛋白质的分离纯化工作也成为生物化学中的一项艰巨而繁重的任务。本文选用天然生物质—玉米芯作为研究对象，其表面含有丰富的羟基等官能团，易于交联、修饰，且玉米芯在我国来源广泛、价廉易得，降低了制备吸附剂的成本。但玉米芯作为一种生物吸附剂存在吸附选择性差、再生较困难等多种问题。很多文献报道了用酸化、碱化等简单的物理化学方法来改善玉米芯的吸附性能，结果均不理想。针对以上问题，本文以玉米芯为原料，通过交联、修饰反应，用不同金属离子螯合制得一批新的吸附剂。研究了吸附剂对溶菌酶、牛血清白蛋白、过氧化氢酶叁种蛋白质的吸附行为。具体工作如下：1、将玉米芯预处理得到玉米芯纤维素，通过环氧氯丙烷交联、亚氨基二乙酸修饰，再用金属铜离子螯合制得吸附剂，借红外光谱、XPS能谱对产物进行表征。以溶菌酶、牛血清白蛋白、过氧化氢酶为吸附对象进行了一系列吸附条件实验（包括溶液的酸度、蛋白质的初始浓度、离子强度等）。结果发现，吸附溶菌酶的最佳吸附条件为pH11.0、25℃、吸附12h，最大吸附容量为308.7mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟金属铜离子螯合亲和吸附剂吸附溶菌酶的吸附等温线（R~2>0.99），拟合的理论最大吸附容量为307.6mg.g~(-1)，与实验值接近。将金属螯合吸附剂用于提取鸡蛋清中的溶菌酶，用pH8.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为96.6%，活力收得率为72.1%，纯化倍数为28.6。用该吸附剂吸附牛血清白蛋白的最佳吸附条件为pH7.0、25℃、吸附12h，最大吸附容量为71.03mg.g~(-1)。吸附过氧化氢酶的最佳吸附条件为pH6.5、25℃、吸附24h，最大吸附容量为120.3mg.g~(-1)。Freundlich吸附模型更适合模拟吸附剂吸附过氧化氢酶的吸附等温线（R~2>0.98）。将该金属螯合吸附剂用于提取猪心肌中的过氧化氢酶，用pH9.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为52.85%，活力收得率为58.4%，纯化倍数为8.6。2、用金属锌离子螯合制得锌亲和吸附剂，以溶菌酶、牛血清白蛋白、过氧化氢酶为吸附对象进行了一系列吸附条件实验。实验结果表明，吸附溶菌酶的最佳吸附条件为pH9.9、25℃、吸附2h，最大吸附容量为344.4mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟金属锌离子螯合亲和吸附剂吸附溶菌酶的吸附等温线（R~2>0.99），拟合的理论最大吸附容量为346.96mg.g~(-1)，与实验值接近。将金属螯合亲和吸附剂用于提取鸡蛋清中的溶菌酶，用pH8.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为91.9%，活力收得率为50.4%，纯化倍数为26.6。吸附牛血清白蛋白的最佳吸附条件为pH3.0、25℃、吸附10h，最大吸附容量为121.3mg.g~(-1)。吸附过氧化氢酶的最佳吸附条件为pH8.0、25℃、吸附24h，最大吸附容量为30.4mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟吸附剂吸附过氧化氢酶的吸附等温线（R~2>0.99），拟合的理论最大吸附容量为31.7mg.g~(-1)，与实验值接近。将金属螯合吸附剂用于提取猪心肌中的过氧化氢酶，用pH9.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为66.9%，活力收得率为73.8%，纯化倍数为10.3。3、将螯合铁离子的吸附剂用于溶菌酶、牛血清白蛋白、过氧化氢酶的吸附并进行了比较。探索了溶液酸度、蛋白质的初始浓度、NaCl的浓度等因素对吸附的影响。结果发现，吸附溶菌酶的最佳吸附条件为pH8.5、25℃、吸附4h，最大吸附容量为283.1mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟金属铁离子螯合吸附剂吸附溶菌酶的吸附等温线（R~2>0.99），拟合的理论最大吸附容量为282.2mg.g~(-1)，与实验值接近。将金属螯合吸附剂用于提取鸡蛋清中的溶菌酶，用pH7.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为87.8%，活力收得率为64.6%，纯化倍数为33.5。吸附牛血清白蛋白的最佳吸附条件为pH3.0、25℃、吸附12h，最大吸附容量为99.4mg.g~(-1)。吸附过氧化氢酶的最佳吸附条件为pH7.0、25℃、吸附24h，最大吸附容量为139.9mg.g~(-1)。Freundlich吸附模型更适合模拟吸附剂吸附过氧化氢酶的吸附等温线（R~2>0.98）。将金属螯合吸附剂用于提取猪心肌中的过氧化氢酶，用pH9.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为55.9%，活力收得率为62.3%，纯化倍数为12.1。4、选用金属镍为螯合剂制得新的吸附剂，以溶菌酶、牛血清白蛋白、过氧化氢酶为吸附对象进行了吸附条件的探索，实验结果表明，吸附溶菌酶的最佳吸附条件为pH10.0、25℃、吸附8h，最大吸附容量为280.9mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟金属镍离子螯合吸附剂吸附溶菌酶的吸附等温线（R~2>0.99），拟合的理论最大吸附容量为279.0mg.g~(-1)，与实验值接近。将金属螯合吸附剂用于提取鸡蛋清中的溶菌酶，用pH7.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为88.1%，活力收得率为43.8%，纯化倍数为14.3。吸附牛血清白蛋白的最佳吸附条件为pH3.0、25℃、吸附12h，最大吸附容量为69.0mg.g~(-1)。吸附过氧化氢酶的最佳吸附条件为pH8.0、25℃、吸附24h，最大吸附容量为21.5mg.g~(-1)。Langmuir吸附模型更适合模拟吸附剂吸附过氧化氢酶的吸附等温线（R~2>0.91），拟合的理论最大吸附容量为21.7mg.g~(-1)，与实验值接近。将金属螯合吸附剂用于提取猪心肌中的过氧化氢酶，用pH9.0、1.0mol.L-1NaSCN溶液洗脱，洗脱率为75.4%，活力收得率为73.5%，纯化倍数为14.9。
余海芬[5]2010年在《蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究》文中研究表明本文采用多种现代分离技术对鸡蛋清中的溶菌酶进行了提取分离,比较了不同方法对分离效果的影响；并利用新兴的共振瑞利散射技术建立了溶菌酶的快速检测方法；另外对溶菌酶酶学性质及其体外抑菌活性进行了初步探讨。主要研究结果如下：采用离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶,考察了离子交换树脂种类、用量、吸附反应时间、洗脱液浓度和洗脱时间等对溶菌酶提取效果的影响,采用叁因素叁水平正交响应面组合设计进行实验,对提取工艺进行了优化,建立了树脂用量、吸附时间、洗脱液浓度叁个提取工艺参数间的数学模型Y=0.339667+0.041 X1+0.038375 X2-0.021375 X3+0.00925 X1X2-0.00425 X1X3-0.0105 X2X3-0.051583 X12-0.068833X22-0.039833 X32,得到最佳的提取工艺条件为：树脂用量占蛋清液体积的32%,吸附时间6.5 h,硫酸铵洗脱液的质量浓度为9.3%。在此条件下提取的溶菌酶得率为0.324%,酶活力为16300 U/mg。将离子交换法制得的溶菌酶粗品用超滤法除盐,选择截留分子量为10000的聚醚砜膜,跨膜压力设为0.2 MPa,搅拌速度为200 r/min,研究了超滤除盐过程中浓缩液体积、膜通量以及脱盐率的关系,得出当超滤至浓缩液体积为原始料液体积的10%左右时,脱盐效果最好,可以除去90%以上的硫酸铵,此时溶菌酶得率为0.275%,酶活力为21500 U/mg。此外,本实验还研究了超滤法直接从蛋清液中分离溶菌酶的工艺条件,探讨了跨膜压力、搅拌速度、料液稀释倍数及溶液pH值对膜通量和蛋白质渗透率的影响,得到最佳的超滤条件：0.1mol/L NaCl溶液以1：1(v/v)的比例稀释蛋清液,料液pH值6.5,跨膜压力0.2 MPa,搅拌速度200 r/min,在此条件下分离鸡蛋清中溶菌酶,得率为0.301%,酶活力为18200 U/mg。以金纳米粒子作探针,建立了共振瑞利散射光谱法定量测定溶菌酶的方法。研究了金纳米-溶菌酶体系的共振瑞利散射(RRS)光谱、非线性散射(SOS和FDS)光谱和吸收光谱特征,并探讨了金纳米粒子与溶菌酶反应的最适宜条件,包括：溶液pH值、金纳米粒子用量、试剂混合顺序以及共存离子等,确定了反应的最优条件,结果表明共存离子对共振瑞利散射法测定溶菌酶的影响很小。本实验还初步探讨了导致体系共振瑞利散射光强度显着增强的原因。该溶菌酶检测方法灵敏度高,检出限为30.1 ng/mL,且具有较好的选择性,应用于合成样品和新鲜鸡蛋清样品中溶菌酶含量的测定,结果令人满意。溶菌酶的酶学特性研究表明：其最适反应pH值约为6,最适反应温度为55℃；溶菌酶在pH值为6-7和温度为20℃-60℃范围内,能较好的保持酶活,且温度变化对酶活力影响很小；另外大部分金属离子能与溶菌酶产生良好的配伍作用,对酶活力影响不大,其中Na+、Ca2+、Mn2+对溶菌酶有一定的激活作用；几种表面活性剂都对溶菌酶活力有一定抑制作用,但抑制作用相对较弱。溶菌酶的体外抑菌实验表明：其对大肠杆菌、沙门氏菌有很好的抑制效果,在较高浓度下对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用,对叁种菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别是E.coli 0.313 mg/mL和0.625 mg/mL,S.aureus 1.25 mg/mL和5.0 mg/mL,Salmonella 0.625 mg/mL和1.25 mg/mL。
张文会[6]2003年在《从鸡蛋清中提取溶菌酶的研究》文中认为本论文研究了盐析法、离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶的工艺过程,优化了工艺参数。在盐析法中应用热变性技术除去盐析粗品中的杂蛋白,然后结晶得溶菌酶,提取重量收率达0.24%左右,酶活收率61%左右。此法操作简单,收率较高,适于小规模生产。在研究离子交换工艺过程中,发现混合H+型、Na+型的离子交换树脂,可起到调节蛋清pH的作用,不引入其他无机酸碱,减少了工艺过程带来的杂质,不影响剩余蛋清性质,有利于蛋清的综合利用。此法重量收率达0.4%,酶活收率90%左右。研究发现以丙酮为溶剂沉析溶菌酶,可以避免硫酸盐溶液易腐蚀设备、污染环境、生产周期长的缺点。此法溶菌酶重量收率0.41%,酶活收率87%左右,可降低生产成本,提高原料的综合利用率。研究了用乙醇代替丙酮作有机溶剂沉析剂,同时改用氯化钠溶液洗脱溶菌酶的过程。此法溶菌酶重量收率0.41%,酶活收率82%左右。研究了比色法测定溶菌酶酶活力的条件。实验表明,比色法在测定结果重现性上优于比浊法。此法具有简便、直观、专一的特点,适用于溶菌酶生产过程的检测监控。
韩朝晖[7]2012年在《改性磁性微球对蛋白质纯化和细菌分离的研究》文中认为纳米材料由于具有特殊的理化性能，在医药和生化领域有着广泛的应用，即利用表面修饰的微球对蛋白质和核酸进行分离纯化、细胞分离、细菌分离检测、靶向给药等。为了更好的实现复合微球在实际生活中的应用，纳米微球必须有良好的生物相容性、含有丰富的官能团、很好的磁响应性，易于磁分离等特点。本文以磁珠Fe_3O_4为磁核，制备了多种功能化的修饰纳米微球，并用于蛋白质的纯化和细菌分离。具体工作如下：1.以沉淀法制备正癸酸改性磁性纳米微球(MNP-CPAD)，并用透射电子显微镜、X射线衍射、红外光谱对改性前后磁性微球进行表征。将修饰微球用于溶菌酶的吸附，考察溶液的pH、溶菌酶的初始浓度、吸附时间、反应温度、离子强度等因素对吸附行为的影响。结果表明：正癸酸修饰微球基本呈球形，粒径在10nm左右.在pH为10.7时，实验最大吸附容量35.0mg·g~(-1)，微球重复3次后仍保持较好的吸附性能。吸附过程符合Langmuir模型，表明溶菌酶是以单分子层吸附为主。用1.0mol·L~(-1)NaCl对吸附溶菌酶的微球进行洗脱，两次洗脱后，洗脱率可以达到80％。并将正癸酸改性微球用从鸡蛋清中提取溶菌酶，纯化倍数为30.9，酶活力收得率为73.5％。2.制备2,2'-硫代二乙酸改性磁性纳米微球(MNP-TDGA)，并用透射电子显微镜、X射线衍射、红外光谱对改性前后微球进行表征。将修饰微球用于溶菌酶和卵清蛋白的吸附，考察溶液的pH，蛋白质的初始浓度、吸附时间、离子强度、吸附剂用量等因素对吸附的影响。结果表明：复合微球的粒径在12nm左右，磁响应性好，稳定性好且易于分散。2,2'-硫代二乙酸修饰微球吸附溶菌酶的最佳pH为10.7，实验最大吸附容量为120.0mg﹒g~(-1)，用1.0mol·L~(-1)的NaCl洗脱，洗脱率可以达到74.6％；吸附卵清蛋白的最佳pH为4.5，实验最大吸附容量为95.5mg﹒g~(-1)，用pH=11.0的Tirs-NaOH溶液进行洗脱，洗脱率为52.3％。修饰微球能从鸡蛋清中分离出溶菌酶和卵清蛋白，溶菌酶的纯化倍数为29.3，酶活力收得率为54.1％。3.通过共沉淀法制备了Fe_3O_4，以γ-氨丙基-3-乙氧基硅烷包覆自制的磁核Fe_3O_4，并将对革兰氏阳性菌有抑制作用的替考拉宁偶联在微球表面，制备出替考拉宁修饰纳米微球(MNP-APTES-Tei)，用透射电子显微镜、X射线衍射、红外光谱对改性前后微球进行表征。将替考拉宁修饰微球用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌及混合菌的吸附分离。探讨了溶液的pH、吸附时间、菌初始浓度、温度、离子强度、吸附剂用量等条件对细菌吸附的影响。结果表明，替考拉宁微球对金黄色葡萄球菌有很好的选择性，最大吸附容量可达到1.20×1011cfu·g~(-1)，而对大肠杆菌基本不吸附。4.用正硅酸乙酯和γ-氨丙基-3-乙氧基硅烷对Fe_3O_4进行双层包覆，再接枝上丁二酸酐，最后偶联上碱性品红，制备出碱性品红修饰复合微球(MNP-TEOS-APTES-SA-BF)。用透射电子显微镜、X射线衍射、红外光谱对改性前后微球进行表征。将碱性品红修饰复合微球用于分枝杆菌和大肠杆菌及混合菌的吸附分离。探讨了溶液的pH、吸附时间、菌初始浓度、温度、离子强度、吸附剂用量等因素对细菌吸附的影响。结果表明，碱性品红修饰微球对分支杆菌有很好的选择性，实验最大吸附容量可达到3.25×1010cfu·g~(-1)。将修饰微球用于对医院废水样中的分枝杆菌的分离吸附，检测出水样中分枝杆菌的含量1.37×106cfu·mL~(-1)。
朱德艳[8]2009年在《用食盐盐析和离子交换法从鸡蛋清中提取溶菌酶及其比较》文中进行了进一步梳理本文主要介绍从鸡蛋清中提取溶菌酶的原理、工艺流程、操作步骤及提取过程中的应注意的问题。其中以食盐直接盐析提取法和离子交换树脂提取法为例来阐述简单从鸡蛋清中提取溶菌酶的操作步骤,同时还分析了讨论操作过程中的注意事项,也对者两种提取方法作了比较。
张利[9]2011年在《羧基修饰啤酒废酵母菌吸附剂的制备及对蛋白质吸附性能的研究》文中研究表明蛋白质与酶等在生物体的各种生命活动中发挥着重要的作用,蛋白质的研究对指导工业生产,对了解生命的规律和医药实践也有重要的理论及实践意义,然而研究蛋白质的这些作用首先要成功的实现蛋白的分离纯化,因此蛋白质的分离纯化的研究具有重要意义。生物吸附法因方法简单、成本低等优点而被广泛关注。啤酒废酵母菌是酿酒产业产生的废弃物,但它和活菌体表面含有相同的官能团,是一种天然的生物吸附剂,由于自身粒径小、吸附容量较低且不利于两相分离等缺点,限制了其广泛应用。本文采用化学修饰的方法,将一系列含有羧基的小分子修饰到啤酒废酵母菌表面,制备了新的生物吸附剂,并对他们进行各种表征,研究了修饰菌对溶菌酶、牛血红和牛血清蛋白的吸附性能。具体工作如下:1.将丁二酸酐修饰到啤酒废酵母菌表面,通过改变投料比和反应介质,发现丁二酸酐修饰啤酒废酵母菌时用料比为1:3(酵母菌:丁二酸酐)且介质为吡啶时,接枝率高达41.3%,并通过红外和XPS谱对修饰菌进行表征,结果发现丁二酸酐已成功修饰到啤酒废酵母菌表面。丁二酸酐修饰菌对溶菌酶的最佳吸附条件为30℃、6 h、pH 7.0。在最佳吸附条件下,修饰菌和未修饰菌的最大吸附容量分别为848.0 mg g~(-1)和102.0 mg g~(-1),修饰菌是未修饰菌的8.3倍,用Langmuir和Freundlich模型对吸附等温线进行模拟,发现修饰菌对溶菌酶的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,属单分子层吸附模式。以1.0 mol L~(-1) pH 7.0的NaSCN溶液为洗脱液,洗脱率高达94.2%。将该吸附剂用于从鸡蛋清中提取溶菌酶,并对酶活力进行测定,得活力保持率为91.5%,总活力收得率为81.5%,纯化倍数为35.1。电泳分析表明纯化后的溶菌酶具有较高的纯度。2.以过硫酸钾为热引发剂,将聚α-甲基丙烯酸修饰在酵母菌表面,并通过扫描电镜、红外、XPS谱对修饰菌进行表征,用电位滴定法测定了菌体表面的官能团含量为1.4 m mol g-1,说明聚α-甲基丙烯酸已成功修饰到啤酒废酵母菌表面。将其作为吸附剂,以溶菌酶为吸附对象,确定吸附的最佳条件为30℃、6 h、pH 7.0。在最佳吸附条件下,修饰菌和未修饰菌的最大吸附容量分别为545.0 mg g~(-1)和102.0 mg g~(-1),前者是后者的5.3倍。用Langmuir和Freundlich吸附模型对溶菌酶的吸附等温线进行模拟,发现未修饰符合Langmuir模型,而修饰菌则不符合,可能是吸附剂表面聚合物大分子对吸附的影响所致。以1.0 mol L~(-1) pH 7.0的NaSCN溶液为洗脱液,洗脱率最高为96.9%。用于实际样品鸡蛋清中溶菌酶的提取,发现从鸡蛋清中提取溶菌酶的总活力保持率为79.6%,收得率为84.0%,纯化倍数为27.1。3.将丁二酸酐修饰啤酒废酵母菌用于吸附牛血红蛋白和牛血清白蛋白的研究,实验发现对牛血红蛋白的最佳吸附条件为10 h、pH 5.4、25℃,最大吸附容量为566.2 mg g~(-1),是未修饰菌(23.5 mg g~(-1))的24.1倍。用Langmuir和Freundlich模型对两种蛋白的吸附等温线进行模拟,发现修饰菌对牛血红蛋白的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,表明牛血红的吸附是以单分子层吸附为主。以pH 8.0,1.0 mol L~(-1)NaCl的Tris-HCl缓冲溶液为洗脱液,洗脱率达到60%,将其用于新鲜牛血的样品处理,发现通过二次吸附和洗脱可将洗脱率提高至98.4%,从牛血处理液中纯化牛血红蛋白,纯化前牛血处理液中BHb占总蛋白的百分比为36.3%,纯化后为91.5%,富集倍数为2.52。4.以聚α-甲基丙烯酸修饰啤酒废酵母菌为吸附剂,对牛血红蛋白和牛血清白蛋白的吸附进行研究,实验发现对牛血清白蛋白几乎不吸附,而在24 h、pH 5.4、25℃条件下,对牛血红蛋白的最大吸附容量为244.6 mg g~(-1),是未修饰菌的10.4倍,用Langmuir和Freundlich模型对两种蛋白的吸附等温线进行模拟,发现修饰菌对牛血红的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,表明牛血红的吸附是以单分子层吸附为主。以pH 8.0,1.0 mol L~(-1)NaCl的Tris-HCl缓冲溶液为洗脱液,洗脱率为62.1%,从牛血处理液中纯化牛血红蛋白时,二次洗脱率提高至88.6%,纯化前后牛血处理液中BHb占总蛋白的百分比分别为36.3%和78.7%,富集倍数为2.17。
陈中, 王荣民[10]1994年在《鸡蛋清中溶菌酶的提取》文中认为本文尝试了用新方法从鸡蛋清中提取溶菌酶，并采用了国外先进的随机质心映射优化程序，通过优化实验，确定了该方法的最佳工艺条件。在此基础上。本文还用差热扫描分析方法及溶菌酶的溶菌实验检测了产品。
参考文献：
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[2]. 用修饰花生壳粉吸附剂提取纯化蛋白质的研究[D]. 厉林静. 中南民族大学. 2012
[3]. 聚合物或离子液体/柠檬酸钾双水相分离纯化蛋白质的研究[D]. 卢艳敏. 山东大学. 2012
[4]. 修饰玉米芯亲和吸附剂的制备及对蛋白质的吸附研究[D]. 张永红. 中南民族大学. 2013
[5]. 蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究[D]. 余海芬. 华中农业大学. 2010
[6]. 从鸡蛋清中提取溶菌酶的研究[D]. 张文会. 北京化工大学. 2003
[7]. 改性磁性微球对蛋白质纯化和细菌分离的研究[D]. 韩朝晖. 中南民族大学. 2012
[8]. 用食盐盐析和离子交换法从鸡蛋清中提取溶菌酶及其比较[J]. 朱德艳. 食品与发酵科技. 2009
[9]. 羧基修饰啤酒废酵母菌吸附剂的制备及对蛋白质吸附性能的研究[D]. 张利. 中南民族大学. 2011
[10]. 鸡蛋清中溶菌酶的提取[J]. 陈中, 王荣民. 广州食品工业科技. 1994
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