高嘉[1]2002年在《家蝇中免疫及抗菌活性物质的分离与纯化》文中研究说明本论文对家蝇的养殖、血淋巴中抗菌及免疫活性物质凝集素的诱导及分离纯化进行了较为系统的研究，为进一步开发和利用家蝇凝集素及其他免疫活性物质提供了条件和依据。 确定了家蝇饲养的最佳条件。卵的饲料为麦麸：奶粉：水为100：1：200，温度为24～28℃，水分含量为60～70％；幼虫的饲料为麦麸：奶粉：水为100：1：200，温度24～28℃，水分含量为60～70％；蛹：温度26～30℃，湿度40～50％(空气)；成蝇的饲料为红糖：奶粉=1：1，温度26～30℃，湿度50～60％(空气)。 通过刺伤、超声波、大肠、紫外线四种诱导方式诱导叁龄幼虫和蛹。确定了针刺为最终诱导方案，并取诱导后48小时的蛹为实验材料。 凝集素的粗提确定提取溶液为昆虫生理盐水，提取时间为1hr，提取的料液比为1：2。 亲和层析法纯化凝集素。亲和层析所用的填料为琼脂糖4B，层析柱长为36cm，层析柱直径为1.1cm，上样量为2mL，用BIS缓冲液洗脱杂蛋白至A_(280)＜0.02，再用0.3M半乳糖溶液洗脱凝集素至A_(280)＜0.02，流速为3mL／10min。 戊二醛固定化兔血细胞纯化凝集素步骤：洗涤新鲜兔血得血红细胞→戊二醛固定兔血红细胞→兔血红细胞与蝇蛆粗提液混合，吸附，离心→沉淀物与半乳糖溶液混合，解吸，离心→上清液透析→冷冻干燥 采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为10％。 考马斯亮蓝染色后亲和层析法纯化的样品有4条蛋白带，它们的分子量分别为56.5KD，33.3KD，27.9KD，23.44KD，四条蛋白带可能为凝集素分裂的亚基。兔血红细胞吸附法纯化的样品有6条蛋白带，其中33.3KD的蛋白带与层析法纯化的蛋白带一致。因此本论文推论33.3KD的蛋白带为家蝇的凝集素，此结果与有关报道一致。 家蝇的凝集素对兔和小白鼠的红细胞有凝血现象，且家蝇凝集素对兔的凝血活力高于对小白鼠的凝血活力。凝集素对兔血红细胞的凝血效价为256。半乳糖对家蝇凝集素凝血有专一性抑制，半乳糖为家蝇凝集素专一性结合的糖。葡萄糖、蔗糖、果糖对家蝇凝集素凝血无抑制作用。
陈一[2]2003年在《工程蝇蛆中免疫活性物质的研究》文中研究说明开发功能性食品或新药用以增强机体的免疫功能是近年来食品生化领域的研究重点，当前的免疫调节制剂多从植物和哺乳动物的血液中提取，成本高且安全性难以保障，工程蝇蝇作为具有强大免疫功能的资源昆虫，具有养殖简单，繁殖迅速等特点，有望成为低廉且安全的免疫制剂来源。 本论文采用家蝇作为工程蝇种，对于家蝇免疫活性物质—凝集素的纯化和生理活性进行了系统的研究，首次采用戊二醛固定化红细胞吸附法粗提凝集素，以及研究了家蝇凝集素的抗菌和免疫调节功能，为开发家蝇凝集素这一新型免疫制剂提供了理论依据。同时，为了保证资源的综合利用，研究了家蝇中所含的另一类免疫活性物质—甲壳素与壳聚糖的提取工艺。 采用戊二醛固定化红细胞吸附法结合Sepharose-4B亲和层析纯化凝集素。戊二醛固定化红细胞吸附法为第一步粗提，红细胞浓度为15％，将红细胞与血淋巴混合吸附，离心后得到红细胞—凝集素混合物，再用半乳糖解吸附，所得粗提物血凝比活力提高了533倍，可用于其性质的初步研究。进一步用Sepharose-4B亲和层析柱(1.1cm×30cm)纯化，加样量2ml，样品浓度1g/L，所得纯化产物比活力提高到血淋巴的1066倍。 亲和层析后的家蝇凝集素电泳表现为单一糖蛋白，其分子量为84KD，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(考马斯亮蓝G-250染色)表明家蝇蛹凝集素含有叁个亚基，分子量分别为16KD，18KD，和50KD。对凝集素用shiff's试剂进行糖蛋白染色，表明分子量为16KD和18KD的两个亚基含有糖结构。同时用SephadexG-200凝胶过滤柱(1.1cm×30cm)测定纯化产物的纯度和分子量，结果凝胶过滤图谱上表现为单一峰，通过标准曲线测得家蝇凝集素分子量为86KD。 本纯化方法得率为1.5mg凝集素/30g蛹，用苯酚—硫酸法所得凝集素含有12.3％中性糖。 血凝活力和糖结合实验表明家蝇凝集素专一性识别D-半乳糖，最低结合浓度为100mmol/L，不识别D-葡萄糖、D-甘露糖、果糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、乳糖、麦芽糖、蔗糖和D-核糖，其血凝活力对热不稳定，不依赖Ca~(2+)，在pH6～9之间稳定。 家蝇凝集素对Escherichia coli，Bacillus subtilis和Salmonella typhi有不同程度的抑制作用。利用平板计数测得家蝇蛹凝集素对叁种菌的抑制比率为39.8％，45.3％和66.2％。 对小白鼠的T淋巴细胞转化实验表明家蝇凝集素具有促进哺乳动物细胞免疫功能的作用在浓度大于 15石 n g／ml时，作用显着，溶血空斑实验表明家蝇凝集素具有同时促进体液免疫功能的作用。 通过对不同盐酸浓度，不同反应时问的除灰分的测定，确定以 2 molth为盐酸浓度，在室温下反应 lh即可。以 1：10的比例门 ig蛆粉刊 mol／L盐酸）进行反应。 通过对不同碱浓度，不同反应时间，不同温度及不同实验方法，确定除蛋白的反应条件为，在沸水浴中，先用 2．smol／L NaOH与样品反应 4h后，过滤，再用 1．5 mol／L NaOH与样品反应 4h，则蛋白能够基本脱除。 通过对不同碱浓度，不同反应时问，不同温度及不同实验方法，确定脱乙酚的反应条件为，加以浓度为40％的NaOH，在电炉上直接加热（40％NaOH沸腾温度为 118℃），反应 4h后，过滤，再加相同浓度的碱液，同样反应 4h，可得脱乙酚率较高的壳聚糖。
王土连[3]2017年在《蝇蛆耐高温抗氧化肽的发现及生物信息学分析》文中研究指明抗氧化肽因其分子量小、易吸收,效果显着而成为了研究的热点。目前获得的许多抗氧化肽都没有得到广泛的应用,主要是受限于其不稳定性。本研究利用高温筛选的方法在蝇蛆中发现了一种耐高温多肽,并从多角度证明了其高效的抗氧化活力及在多种应用环境中的稳定性。通过分析该多肽的基本性质及其空间结构特点,初步明确了蝇蛆耐高温抗氧化肽的基本特性及应用条件,并在蛋白质一级和高级结构水平上对该多肽的耐高温抗氧化机制进行了探讨。主要研究结果简述如下:1.筛选并证明了蝇蛆耐高温抗氧化蛋白:利用SPSS21软件分析叁种测定抗氧化方法(NBT,DPPH,FRAP)之间的相关性,结果表明它们之间既有正相关也有负相关,显示为了全面评价蛋白的抗氧化性必须采用叁种方法综合衡量。通过分析50℃,80℃和100℃水浴加热25 min蝇蛆提取液的抗氧化性以及蛋白SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)结果表明,100℃处理10 min能高效清除杂质并保留较稳定的抗氧化性。通过分析蛋白含量与抗氧化的相关性证明了该抗氧化物质为蛋白质,NBT染色确定抗氧化肽分子量约为10 KD。2.确定了蝇蛆耐高温抗氧化蛋白的分离纯化色谱条件:1)采用DEAE纤维素串联羟基磷灰石方法;DEAE-纤维素色谱流动相为0.02 mol·L~(-1)pH=7.0磷酸缓冲液+NaCl,NaCl洗脱梯度为5%NaCl洗脱时间12 min,流速为3ml·min~(-1)。羟基磷灰石色谱法流动相pH=7.0磷酸钠缓冲液,洗脱梯度0.02 mol·L~(-1),洗脱时间12 min,流速为3 ml·min~(-1)。结果显示分子量约为20 KD的蛋白被分离开,纯化到的蛋白分子量约为10 KD。3.综合评估了耐高温抗氧化肽在高温、极端酸碱、紫外线照射以及消化酶处理条件下的抗氧化活力稳定性。实验结果显示耐高温抗氧化蛋白在100℃和120℃长时间处理仍能保持较高的抗氧化活力;在酸性条件下,抗氧化肽的稳定性较好,总还原力的最适pH为2,DPPH自由基清除能力的最适pH为3;在长时间的紫外辐照下,超氧阴离子清除率保持不变,DPPH自由基清除率维持在84%左右,而还原力下降了46%;此外,胃蛋白酶消化处理显着降低超氧阴离子的清除率,而糜蛋白酶消化却显着升高其清除率,DPPH自由基的清除率不受影响,还原力显着升高。4.对目标蛋白电泳条带质谱学及结构功能分析结果:筛选出耐高温抗氧化蛋白8种,分别为动物血红素过氧化物酶(Animal heme peroxidase)、血淋巴保幼激素结合蛋白(Hemolymph juvenile hormone binding protein)、还原酶(Redoxin)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)和四种超氧化物歧化酶(Cu-Zn Superoxide dismutas)。对蛋白进行理化性质、疏水性、蛋白质跨膜结构域、信号肽、高级结构等生物信息进行分析。结果显示蛋白普遍含有较高的甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸,较低的色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸;蛋白的不稳定系数低,含有特定的保守结构域;普遍是亲水蛋白,不含有跨膜区域,多肽结合位点上都含有谷氨酸;α螺旋含有较多的丙氨酸基本不含有半胱氨酸,靠近肽链的N末端或者C末端分布,但是α螺旋数目比β折叠要少;肽链的C、N末端含有很短的链或者是不含有链状结构,但蛋白普遍有比较长的不规则环。
贺继东, 夏文水[4]2002年在《工程蝇蛆的开发利用和深度加工》文中指出人工养殖家蝇生产的蝇蛆具有很高的营养价值,又有特殊生物活性成分,值得大力开发。本文对国内外这方面的开发研究进行了综述,提出了工程蝇蛆深度开发的研究方向:利用蝇蛆开发新资源食品、保健食品、功能性食品添加剂;提取甲壳素,制备壳聚糖,应用于食品、医药、化妆品;提取抗菌肽、凝集素到转基因家蝇生产生化药物。
霍哲[5]2009年在《家蝇幼虫凝集素的分离纯化及其抑制MCF-7细胞活性的研究》文中研究说明家蝇幼虫血淋巴粗提液经过亲和层析,分离出3种与D-半乳糖特异性结合的蛋白,经高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离出分子质量为38 ku的家蝇幼虫凝集素(MLL-2),该组分具有明显的凝血活性,并且MLL-2是一种热敏感型凝集素。圆二CD色谱结果表明,MLL-2的二级结构主要是以β折叠和无规卷曲的构象存在。MTT实验结果显示,MLL-2对人乳腺癌MCF-7细胞的生长具有明显的抑制作用,其抑制效果具有时间和浓度依赖性。通过HE染色、Hochest33258染色和吖啶橙染色从形态学上表明,MLL-2处理过的人乳腺癌MCF-7细胞出现凋亡小体、染色质浓缩等典型的凋亡现象。MLL-2处理过的人乳腺癌MCF-7细胞经TNUEL检测出DNA链断裂,证明发生凋亡现象。经流式细胞仪分析人乳腺癌MCF-7细胞被阻遏在G_2/M期,并且凋亡细胞随作用时间的延长而增加。在人乳腺癌MCF-7细胞凋亡过程中,作为线粒体途径信使的Ca~(2+)明显增加,并且线粒体途径上游的p53蛋白、中游的Bcl-2/Bad也发生改变,抑癌基因Bad升高,原癌基因Bcl-2略有降低。而且与对照组比较,线粒体途径下游的Caspase-3酶活性表达率明显增加(P＜0.01)。因此,MLL-2通过诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡,从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用,并且线粒体途径是诱导其发生凋亡的主要途径之一。
李小波[6]2013年在《家蝇幼虫粉作为饲料添加剂在鲫鱼养殖中的应用》文中指出一、研究背景和目的在资源昆虫中,家蝇(Musca domestica)的研究和开发利用一直受到国内外研究者的重视。家蝇幼虫(蛆)除含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、矿物质等营养物质外,还含有甲壳素、抗菌肽、凝集素、溶菌酶等生物活性物质,在生物医药、食品和饲料开发等方面有着广泛的应用价值。在畜禽和水产动物养殖研究中,因家蝇幼虫的蛋白质含量较高,一般认为它是鱼粉的优质替代物,可作为饲料蛋白质源组分。也有研究认为,蝇蛆所含有的优质脂肪、矿物质等营养物质和抗菌肽、凝集素等生物活性物质具有促进动物生长,增强动物免疫力的作用。相对于其它几种活性成分,甲壳素在家蝇幼虫蛆壳中的含量较高,可达20%-30%。蝇蛆中的甲壳素以蛋白聚糖的形式存在,并伴生着碳酸钙,直接添加于饲料中难以被消化,没有营养作用,有研究认为蝇蛆中的甲壳素可机械性地阻碍肠道吸收蛋白质等营养物质,是一种抗营养因子,影响动物的消化和吸收功能。作为一种新型的饲料酶制剂,甲壳素酶可降解甲壳素为水溶性寡糖,消除其抗营养因子作用,甲壳素寡糖的生物活性与甲壳素类似或更高,既可作为一种免疫增强剂也可作为一种营养性多糖利用。因此,可以把甲壳素酶作为一种消除抗营养因子的饲料酶制剂添加于含蝇蛆组分的饲料中,降解其中的不溶性甲壳素以提高动物对其它营养物质的吸收和利用。目前,通过基因重组技术将特定酶基因转移到适宜宿主菌内发酵已成为生产饲料酶的有效途径。作为一种新的蛋白质表达技术,酵母表面展示系统可以把各种生物活性酶表达并固定于细胞表面,产生具有活性的酵母全细胞酶,而利用全细胞酶作为饲料添加剂可避免胞外表达饲料酶制剂生产过程中的纯化和载体吸附等繁琐的下游程序。因此,为了消除家蝇幼虫中甲壳素的抗营养因子作用,充分发挥其生物活性,本课题利用公认安全的酿酒酵母作为表达宿主,在其表面展示一种耐热甲壳素酶,制备出具甲壳素降解活性的全细胞酶,通过鲫鱼养殖试验评价其作为饲料酶添加剂降解蝇蛆中甲壳素后对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响,以期研制出一种具有消除甲壳素抗营养因子作用并可促进动物生长、增强动物免疫力的饲料酶制剂,同时进一步提高家蝇蛆粉作为饲料添加剂的利用价值。论文包括五个部分：(1)序言(研究背景、目的和思路)(2)蝇蛆常规营养成分分析及所含甲壳素的提取与制备(3)蝇蛆粉对鲫鱼的生长性能和非特异性免疫能力的影响(4)利用酵母表面展示技术研制一种具甲壳素降解活性的热稳定的全细胞酶(5)酵母酶作用于家蝇蛆粉后对鲫鱼的生长性能和非特异性免疫能力的影响二、研究方法在对家蝇蛆粉的主要营养成分(水分、蛋白质和脂肪)含量进行测定的基础上,用蝇蛆粉按不同比例取代鱼粉对鲫鱼进行12周饲养试验,观察蝇蛆粉对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响。在综合分析上述实验结果的基础上,针对蝇蛆粉中具有的甲壳素可能作为一种影响动物摄食和消化的抗营养因子的情况,研制一种表面展示甲壳素酶的全细胞酵母酶作为降解抗营养因子的饲料酶制剂,并按不同比例添加于含有蝇蛆粉的饲料中,对鲫鱼进行12周饲养试验,观察添加酵母酶作用于蝇蛆粉中的甲壳素后对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响。具体研究方法如下：1.采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分别测定鱼粉和蝇蛆粉的水分、蛋白质和脂肪含量；采用酸碱法和微波加热法提取蝇蛆壳中的甲壳素。2.按照试验要求选择96尾鱼苗,随机分为4组,每组24尾,每组3个重复,每个重复8尾,其中,第1组为对照组,投喂基础饲料；其它3组为试验组,分别投喂含蝇蛆粉为5%、10%和15%的试验饲料,进行12周养殖试验,观察蝇蛆粉对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响：(1)通过鱼体的初始、终末体重和饲料消耗量计算各生长指标(体重增加、相对增重率、特异生长率和饲料系数),统计成活率。(2)采用稀释法计数鲫鱼单位容积内的红细胞和白细胞数,采用Wright-Giemsa复合染色法进行白细胞分类计数。(3)应用硝基四氮唑蓝还原法检测血液中嗜中性粒细胞的杀菌功能；以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑蓝还原法检测白细胞的呼吸爆发活性。(4)分别采用比浊法、黄嘌呤氧化酶法和铁还原能力测定法测定血清和肝胰脏中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力。(5)分别采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法检测肠和肝胰脏中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。(6)测定鲫鱼的含肉率；采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分别测定鲫鱼肌肉的水分、蛋白质和脂肪含量。3.利用酵母表面展示技术研制一种热稳定的具甲壳素降解活性的全细胞酶(1)根据GenBank公布的粘质沙雷氏菌甲壳素酶C基因(Serratia marcescensChiC)编码序列设计引物,从粘质沙雷氏菌基因组DNA中克隆出ChiC基因,经测序鉴定和生物信息学分析后构建表面展示载体pYD1-SMChiC,利用a-凝集素受体系统把SMChiC锚定于酵母细胞的细胞壁,构建具有甲壳素降解功能的酵母细胞,并采用Western blot对纯化的表达产物进行鉴定,采用细胞免疫荧光染色检测目的蛋白在细胞表面的锚定情况。(2)优化酿酒酵母表面展示SMChiC的表达条件,采用SDS-PAGE酶谱法鉴定纯化酶的甲壳素降解活性,采用琼脂平板培养法和二硝基水杨酸比色法对酵母细胞的甲壳素降解活性进行定性和定量测定。(3)测试温度和pH对酵母细胞或纯化产物的甲壳素降解活性的影响。4.按照试验要求选择96尾鱼苗,随机分为4组,每组24尾,每组3个重复,每个重复8尾,其中,第1组为对照组,投喂基础饲料；其他3组为试验组,分别投喂含酵母酶为0.5%、1.0%和1.5%的试验饲料,进行12周养殖试验,观察酵母酶作用于蝇蛆粉中的甲壳素后对鲫鱼生长性能和非特异性免疫能力的影响：(1)通过鱼体的初始、终末体重和饲料消耗量计算各生长指标(体重增加、相对增重率、特异生长率和饲料系数),统计成活率。(2)采用稀释法计数鲫鱼单位容积内的红细胞和白细胞数,采用Wright-Giemsa复合染色法进行白细胞分类计数。(3)应用硝基四氮唑蓝还原法检测血液中嗜中性粒细胞的杀菌功能；以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑蓝还原法检测白细胞的呼吸爆发活性。(4)分别采用比浊法、黄嘌呤氧化酶法和铁还原能力测定法测定血清和肝胰脏中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力。(5)分别采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法检测肠和肝胰脏中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。(6)测定鲫鱼的含肉率；采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分别测定鲫鱼肌肉的水分、粗蛋白质和粗脂肪含量。(7)采集鲫鱼肝胰脏、脾脏、肾脏、肠样本制片并进行苏木素-伊红染色,观察酵母酶对鲫鱼组织结构的影响。4.实验数据均以均数与标准差(x±sd)表示,应用SPSS13.0统计软件分析处理实验数据。其中,蝇蛆粉和鱼粉的蛋白质含量采用独立样本T检验,P<0.05为差异有统计学意义(n=3)。鲫鱼的生长指标、各类血细胞比例或含量、NBT还原能力和呼吸爆发活性、相关酶的活性和总抗氧化能力、肌肉含肉率及主要营养物质含量等指标(n=3)的组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),满足方差齐性和方差分析显着的情况下,采用Bonferroni法进行组间差异的多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。叁、研究结果1.对家蝇蛆粉和鱼粉的常规营养成分测定结果：蛋白质含量分别为61.51±1.08%和60.32±1.10%,蝇蛆粉和鱼粉之间的差异无统计学意义(t=1.337,P=0.252)。水分分别为6.95±0.11%和8.74±0.13%；脂肪含量分别为13.71±0.13%和7.32±0.11%。以蝇蛆壳提取的甲壳素占干壳重的27.62±0.26%。2用蝇蛆粉按不同比例取代鱼粉对鲫鱼进行12周喂养试验,结果显示：(1)鲫鱼的体重增加(F=7.735,P=0.009)、相对增重率(F=7.143,P=0.012)、特定生长率(F=7.141,P=0.012)和饲料系数(F=7.208,P=0.012)在四组间的差异均具有统计学意义,10%蝇蛆粉组的上述各指标效果与对照组之间的差异具有统计学意义(对应的P值分别为0.009、0.012、0.012和0.012)；5%蝇蛆粉组(对应的P值分别为0.261、0.349、0.353和0.184)和15%蝇蛆粉组(对应的P值分别为0.069、0.099、0.094和0.063)和对照组之间的差异无统计学意义。(2)鲫鱼的白细胞呼吸爆发活性(F=53.138,P<0.001)、嗜中性粒细胞的吞噬功能(F=17.817,P=0.001)、血清SOD酶活性(F=10.593,P=0.004)、肝胰脏SOD酶活性(F=4.972,P=0.031)、血清总抗氧化能力(F=9.042,P=0.006)、肝胰脏总抗氧化能力(F=9.343,P=0.005)在四组间的差异均具有统计学意义。其中,以10%蝇蛆粉组的上述各种指标均显着高于对照组(P值分别为0.001、0.001、0.004、0.046、0.015和0.006)；鲫鱼血清中溶菌酶活性有增强的趋势,但差异无统计学意义(F=0.118,P=0.947)。(3)中性粒细胞分数(F=0.612,P=0.626)、嗜碱性粒细胞分数(F=0.225,P=0.876)、淋巴细胞分数(F=0.387,P=0.766)、单核细胞分数(F=0.409,P=0.751)、红细胞含量(F=0.354,P=0.788)和白细胞含量(F=0.248,P=0.861)在四组间的差异无统计学意义。(4)肠组织淀粉酶活性(F=0.273,P=0.844)、肝胰脏淀粉酶活性(F=1.698,P=0.244)、肠组织胰蛋白酶活性(F=1.815,P=0.222)和肝胰脏胰蛋白酶活性(F=3.301,P=0.079)在四组间的差异无统计学意义。(5)鲫鱼含肉率(F=3.272,P=0.080)、肌肉的水分(F=0.284,P=0.836)、蛋白质含量(干重%)(F=1.714,P=0.241)和脂肪含量(干重%)(F=0.026,P=0.994)在四组间的差异无统计学意义。3.从Serratia marcescens AS1.1652菌株基因组中扩增得到了ChiC基因编码序列,测序结果分析表明,AS1.1652ChiC基因含有1443bp,推导的Serratia marcescens AS1.1652chitinase C含有480个氨基酸,预测该蛋白的等电点为5.36,分子量约为52kD,且该蛋白不含信号肽。Serratia marcescens AS1.1652chitinase C和其他菌株(stain2170, strain141, strain xd1, stain BJL200)在DNA水平上的相似性分别为96%、96%、96%、98%；在蛋白质水平上的相似性分别为99%、98%、98%、99%。构建的酵母表面展示质粒pYD1-SMChiC中,ChiC基因通过(Gly4-Ser)3Linker编码序列融合于Aga2gene的C端,C端V5表位或6xHis标签可用于融合蛋白质的检测。4.经免疫荧光染色鉴定,证实甲壳素酶已经表达并固定于酿酒酵母细胞表面。表达产物(Aga2-SMChiC融合蛋白)经Western Blot鉴定,大小约67kD；应用琼脂平板法和SDS-PAGE酶谱法检测证实甲壳素酶在酵母中成功表达,且对α-型和p-型甲壳素均具降解活性。对甲壳素酶的表达和展示条件进行了优化,其最佳诱导时间、温度和pH分别为72h、22℃和6.0。5.酵母酶在20℃-80℃之间均具有甲壳素降解活性,在80℃仍然能够检测到初始活性的9%,其最适反应温度为52℃。热稳定性测试表明,70℃处理4h后酵母酶保留其初始活性的88.6%,把酶煮沸1h后其活性仍然保留一定活性,纯化酶的酶谱检测结果也证实在一定高温下酶具有热稳定性。酵母酶在pH2.2-8.0条件下均可显示活性,最适pH为5.0,在酸性条件下,全细胞酵母酶保持一定的稳定性。6.以不同比例的酵母酶添加于含10%蝇蛆粉的饲料中,对鲫鱼进行12周喂养试验,结果显示：(1)鲫鱼的体重增加(F=37.289,P<0.001)、相对增重率(F=33.053,P<0.001)、特定生长率(F=31.435,P<0.001)和饲料系数(F=47.163,P<0.001)在四组间的差异均具有统计学意义。0.5%酵母酶组(P值分别为0.004、0.006、0.008、0.001)、1.0%酵母酶组(P值分别为0.001、<0.001、<0.001、<0.001)、1.5%酵母酶组(P值分别为0.001、0.003、0.003、<0.001)的体重增加、相对增重率和特定生长率均显着高于对照组,而饲料系数均显着低于对照组。(2)鲫鱼的嗜中性粒细胞吞噬功能(F=36.935,P<0.001)和白细胞呼吸爆发活性(F=96.737,P<0.001)在四组间的差异均具有统计学意义。0.5%酵母酶组(P值分别为0.014、<0.001)、1.0%酵母酶组(P值分别为<0.001、<0.001)、1.5%酵母酶组(P值分别为0.037、<0.001)的上述指标均显着高于对照组。(3)鲫鱼血清中的溶菌酶活力(F=34.057,P<0.001)、SOD酶活力(F=33.490,P<0.001)、总抗氧化能力(F=20.579,P<0.001)和肝胰脏中的溶菌酶活力(F=35.497,P<0.001)、SOD酶活力(F=16.673,P=0.001)、总抗氧化能力(F=24.374,P<0.001)在四组间的差异均具有统计学意义。其中,0.5%酵母酶组(P值分别为0.001、0.001、0.002、<0.001)、1.0%酵母酶组(P值分别为0.001、P<0.001、0.001、<0.001)、1.5%酵母酶组(P值分别为0.001、0.001、0.001、<0.001)的血清溶菌酶活性、SOD酶活性、总抗氧化能力和肝胰脏溶菌酶活性均显着高于对照组。1.0%酵母酶组的肝胰脏SOD酶活性显着高于对照组(P=0.001)。1.0%酵母酶组(P<0.001)和1.5%酵母酶组(P=0.004)肝胰脏匀浆中的总抗氧化能力显着高于对照组。(4)中性粒细胞分数(F=1.590,P=0.266)、嗜碱性粒细胞分数(F=0.277,P=0.875)、淋巴细胞分数(F=0.877,P=0.492)、单核细胞分数(F=1.923,P=0.204)、红细胞含量(F=0.344,P=0.795)和白细胞含量(F=0.061,P=0.979)在四组间的差异无统计学意义。(5)肠组织淀粉酶活性(F=0.240,P=0.866)、肝胰脏淀粉酶活性(F=1.285,P=0.344)、肠组织胰蛋白酶活性(F=1.110,P=0.400)和肝胰脏胰蛋白酶活性(F=2.043,P=0.187)在四组间的差异无统计学意义。(6)鲫鱼含肉率(F=0.478,P=0.706)、肌肉的水分(F=1.706,P=0.243)、蛋白质含量(干重%)(F=0.016,P=0.997)和脂肪含量(干重%)(F=0.076,P=0.971)在四组间的差异无统计学意义。(7)病理切片镜检结果表明各酵母酶组饲养鲫鱼主要脏器器官未见异常改变,实验过程中未对鲫鱼脏器造成不良影响。四、结论蝇蛆粉和鱼粉的蛋白质含量相近,但蝇蛆壳中含有的甲壳素不溶于水,可能具有抗营养因子作用。蝇蛆粉部分取代鱼粉能促进鲫鱼生长,提高饲料利用效率,增强鲫鱼白细胞吞噬功能和呼吸爆发能力,并可增强鱼体抗氧化能力,从而增强其非特异性免疫功能,且对鱼肉品质无不良影响。结果表明蝇蛆粉可以部分取代鱼粉作为优质的饲料蛋白质源。表面展示Serratia marcescens ChiC的酿酒酵母全细胞具有甲壳素降解活性,是一种具有热稳定性的耐高温酶,且在较低pH条件仍保持一定的稳定性。具有甲壳素降解活性的酵母酶可消除甲壳素的抗营养因子作用,促进鲫鱼生长,提高饲料利用效率,提高白细胞吞噬功能和呼吸爆发能力,提高鱼体溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力和总抗氧化能力,增强鱼体非特异性免疫功能。添加酵母酶对鲫鱼血液内环境、主要脏器组织结构均无不良影响,不影响鱼肉品质。表面展示Serratia marcescens ChiC的酿酒酵母可作为一种降解抗营养因子的全细胞饲料酶制剂添加于饲料中。
边海旭[7]2017年在《蝇蛆蛋白凝胶制备、质量标准建立与药效学研究》文中提出背景烫伤是由物理、化学等因素造成的皮肤损伤性疾病,也是生活中经常遇到的外伤之一。不同于普通外伤,烫伤存在创面疼痛、组织坏死、易并发感染、愈合后创面易留疤痕等难题。烫伤首先破坏皮肤屏障,而皮肤功能的丧失可引发一系列的应激反应,产生全身性病理生理、代谢、免疫等复杂变化,从而引起一系列并发症,比如脓毒血症、全身炎症反应综合症、多器官功能障碍综合症等。临床常用西药、中药、中西药联合治疗,但疗效并不理想,创面易反复感染、破溃,令患者苦不堪言,预后也容易形成疤痕,影响美观。因此,开发新型抗烫伤药物,迫在眉睫。蝇蛆,中医学称为五谷虫,是丽蝇科,丝光绿蝇、大头金蝇或其它近缘昆虫的幼虫,多部中医古籍中均有其用于治疗感染性外科疾病的记载。临床研究表明蝇蛆疗法在清创过程中对正常组织无损伤且同时发挥抗感染、促愈合的作用。从蝇蛆中分离的活性成分蝇蛆蛋白,除具有抗菌活性外还具有抗病毒、提高免疫力、清除氧自由基、减缓衰老、抗癌等多种作用,但蝇蛆蛋白对皮肤烫伤的治疗作用及其制剂研究目前少有报道。因此,将蝇蛆蛋白开发成安全、有效的制剂,对于治疗皮肤烫伤具有重要意义。目的1.分离提取蝇蛆中的蛋白质成分,并进行初步的药效学评价;2.制备蝇蛆蛋白凝胶;3.建立蝇蛆蛋白凝胶的质量标准;4.研究蝇蛆蛋白凝胶治疗大鼠烫伤的药效学作用。方法1.蝇蛆蛋白的提取及初步药效学评价:采用无菌饲料对丝光绿蝇虫卵进行人工饲养,采用虫卵、虫体“双重消毒法”,获得无菌蝇蛆,并做细菌和病毒学检查。采用研磨、加热、离心等方法制备蝇蛆蛋白。用热水在大鼠背部造成深Ⅱ度烫伤模型,每个创面给予0.2g蝇蛆蛋白,每日换药1次,连续用药14天。观察创面的愈合情况,记录愈合率和愈合时间,测定创面组织内羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。在明确药效的基础上,对蝇蛆蛋白进行分离,具体方法为根据蝇蛆蛋白在280nm处的吸收情况,用交联葡聚糖G-50柱分离蝇蛆蛋白内的不同片段,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法检测各组份分子量范围。测定P6组份的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),以P6的MIC为标准测定P1-P7的体外抑菌活性。最后,评价P1-P7对创面愈合情况及HYP含量的影响。2.蝇蛆蛋白凝胶的制备:综合考察了凝胶常用基质卡波姆-940、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium,CMC)、高取代羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose,H-HPC)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose,HPMC)和蝇蛆蛋白提取物混合后的性状,并初步确定蝇蛆蛋白处方。制定凝胶筛选评分标准,对蝇蛆蛋白凝胶进行评分。通过单因素实验和正交设计实验,以卡波姆-940、丙二醇的用量及pH为考察因素,考察各因素对凝胶剂稳定性的影响。最后,按照正交实验所得凝胶剂最佳处方和工艺,用评分标准对3份凝胶进行综合评分,确定处方。3.蝇蛆蛋白凝胶质量标准建立:根据2010版《中国药典》的有关规定,分别测定了叁个批次蝇蛆蛋白凝胶的外观性状、pH值、粒度、无菌、装量差异、蛋白含量等项目,根据实验结果,制定了相关质量标准。另外,分别测定蝇蛆蛋白凝胶在离心、高寒和高热环境下的稳定性。4.蝇蛆蛋白凝胶的药效学研究:在大鼠背部用热水造成深Ⅱ度烫伤模型,给予蝇蛆蛋白凝胶(0.2g/创面),治疗14天,观察并记录各组创面变化情况,将大鼠处死后收集血液、创面组织。观察创面组织病理学变化,用试剂盒测定样本中HYP、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等指标的含量和水平,用免疫组化法测定创面表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达。结果1.蝇蛆蛋白的提取及初步药效学评价:细菌和病毒学检测结果显示虫卵虫体双重消毒法处理的蝇蛆未见细菌病毒感染,可以进一步应用。烫伤大鼠创面给予蝇蛆蛋白治疗后,可明显缩短创面愈合时间,提高愈合率,促进创面HYP的生成。根据蝇蛆蛋白不同紫外吸收特征峰,从中分离出7个组份(P1-P7),在相同条件下,P6组对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为50mg/ml,抑菌环直径显着大于对照组和其他组份,而且在提高烫伤创面HYP含量方面,活性也明显优于其他组份。因此,将蝇蛆蛋白P6组份应用于下一步实验。2.蝇蛆蛋白凝胶的制备:通过考察不同基质和蝇蛆蛋白提取物混合后的性状,选择卡波姆-940作为凝胶剂基质。根据MIC实验结果,确定处方中蝇蛆蛋白P6组份的剂量为5g。根据单因素实验和正交设计实验确定凝胶剂最佳处方,取P6 5.0g、卡波姆-940 0.6g、丙二醇10.0g、吐温-80 0.2g、羟苯乙酯0.1g按工艺制备凝胶,通过调节叁乙醇胺的用量将凝胶的pH值调整为6.5,验证实验结果表明凝胶稳定。3.蝇蛆蛋白凝胶质量标准建立:将pH值控制在6.50-6.65之间,粒度控制在180μm以内,不得检出细菌,将标示装量暂定为20g。建立蝇蛆蛋白凝胶中蛋白含量的测定方法,考察线性关系,相关系数r=0.9990,表明蛋白质量浓度在40.4~404.0μg/mL范围内,吸光度与质量浓度呈良好的线性关系;6次测定的吸光度RSD值小于2%,说明仪器精密度良好;30min内,7次吸光度值的RSD值小于2%,表明溶液在30min内稳定性好;将吸光度测定结果带入线性方程,求出6份供试品溶液蛋白含量,通过计算,RSD值小于2%,说明方法重复性好;将吸光度测定结果带入线性方程,求得9份供试溶液的蛋白含量,由测得量和加入量计算得加样回收率为99.56%(RSD<2%),符合98%-102%的要求。最终,根据测定结果确定蝇蛆蛋白凝胶中的蛋白含量应在4.41%-4.87%之间。稳定性考察结果表明,蝇蛆蛋白凝胶在离心、高寒和高热环境下,性状均稳定。4.蝇蛆蛋白凝胶的药效学研究:创面给予蝇蛆蛋白凝胶,通过形态学观察发现,蝇蛆蛋白凝胶在创伤早期就可以减轻炎症反应,加速结痂过程,还可显着缩短创面愈合时间,提高创面愈合率。病理学检查结果提示,蝇蛆蛋白凝胶组创面皮肤附属器和新生上皮组织覆盖较模型组明显加快,且可见大量新生毛细血管和成纤维细胞生成,胶原排列整齐,粒细胞浸润明显较少。蝇蛆蛋白凝胶还可显着提高创面组织中HYP含量,增加EGF、bFGF表达和SOD活力,降低MDA含量,减少TNF-α和IL-6表达。结论蝇蛆蛋白具有良好的抗感染、促愈合作用,对从蝇蛆蛋白中分离获得的7个主要组份进行活性筛选,获得活性最强的蛋白组份P6;以该组份为主药制备的蝇蛆蛋白凝胶性质稳定、质量可控,且对大鼠烫伤具有良好的治疗作用,其机制可能与其促进创面胶原合成,抗炎和抗氧化作用有关。通过本课题的研究,对蝇蛆蛋白及其凝胶治疗烫伤的整体药效有了更深入的认识,为未来的药物开发及进一步的机制研究奠定了坚实的实验基础。
王土连, 柯德森[8]2015年在《蝇蛆免疫增强物质研究进展》文中研究说明开发功能性保健食品用以增强机体的免疫功能是应用生化领域研究的热点。家蝇蝇蛆具有强大的免疫功能,且养殖简单、繁殖迅速,尤为研究的大热门[1],但至今未见关于蝇蛆免疫增强物质研究的综述总结。本文从蝇蛆体内的免疫增强物质的种类、作用机理、生理实验以及在保健品上的应用这四个方面综述了目前蝇蛆体内免疫增强物质的研究进展。
吕丰喆[9]2016年在《蝇蛆对粪中养分的转化及蝇蛆对粪中养分利用率的研究》文中认为本研究为了探究蝇蛆对粪中物质转化规律和对养分的利用率,采用完全随机化设计。使用3×3的方式进行随机试验设计进行分组,将3个蝇卵量分别接种于叁种不同猪粪中,共9个处理,每处理内设3个重复,每个处理互为对照,进行蝇蛆饲养试验。根据粪中干物质含量接种不同数量级蝇卵量。控制时间为蝇蛆的一个生长期,即蝇卵发育到变蛹前停止培育并收集。培养期过后对粪中残留的各营养指标进行测定,对各处理中的成蛆体内富集的营养物质进行检测并分析。研究结果如下：1.生长猪粪和育肥猪粪接种0.15g/kg蝇卵,仔猪粪接种0.1g/kg蝇卵可使粪中干物质减少量达到最大值。2.仔猪粪、生长猪粪、育肥猪粪接种0.15g/kg的蝇卵干物质达到的转化率最高。分别为8.33%,7.66%,8.65%。3.0.05g/kg和0.1g／蝇卵接种量时,仔猪粪中干物质减少量显着高于生长猪和育肥猪粪中干物质减少量(p<0.05)。0.15g/kg接种量对不同种类猪粪中干物质减少量影响不显着(p>0.05)。4.仔猪粪、生长猪粪和育肥猪粪分别接种0.05g//kg、0.10g/kg、0.15g/kg接种量,干物质、粗蛋白、有机物和能量均在接种量为0.15g/kg时达到最大利用率。5.0.1g/kg接种量时候,仔猪粪中能量减少量显着高于生长猪粪和育肥猪粪,在0.05g/kg和0.15g/kg蝇卵接种量时,不同粪中能量变化量不显着。6.接种相同蝇卵量时,仔猪粪中粗蛋白的减少量显着高于生长猪粪和育肥猪粪,但蝇蛆育肥猪粪中粗蛋白的利用率显着高于生长猪粪和仔猪粪。
陆婕[10]2005年在《家蝇蛆抗菌肽的分离纯化和性质研究》文中认为家蝇(Musca domestica)属昆虫纲,双翅目,环裂亚目、蝇科,是我国大部分地区最常见、数量最多的一种蝇类。家蝇中存在大量抗菌活性物质,对抗菌药物的开发具有重要的意义。但家蝇中抗菌肽的种类较多,成分复杂,很难分离纯化出一个单一抗菌肽,目前国内外对其研究较少。本研究从家蝇干蝇蛆中分离纯化出了一个新抗菌肽Muscatoxin并测得其氨基酸序列,也深入开展了生理功能的研究。完成的工作主要包括以下几个方面:1、利用短时沸水处理、稀醋酸低温浸提、海藻酸吸附、稀盐酸低温洗脱、盐析、凝胶过滤、CMC23弱阳离子交换柱层析、反相高效液相色谱层析等方法,从家蝇蛆中分离纯化出一组蝇蛆抗菌肽,具有抗菌谱广,最低杀菌浓度低,耐热、耐冻融能力极强等特点。其杀菌活性高低依次为:枯草杆菌＞苏云金芽胞杆菌＞金黄色葡萄球菌＞铜绿假单孢菌＞大肠杆菌,最低杀菌浓度依次为:0.039、0.078、1.25、5.0、20.0μg/μl。蝇蛆抗菌肽不是凝集素类物质,对G~+菌的杀灭作用比对G~-菌强,对抗菌药物的开发有重要意义。此外,蝇蛆抗菌肽中存在的大量弱酸性蛋白也有杀菌活性。2、结合反相高效液相色谱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和电洗脱回收等方法,首次在蛋白质水平上,从蝇蛆抗菌肽中分离纯化出一个高纯度的新抗菌肽Muscatoxin,分子量7095 D,等电点8.88,肽质量指纹谱(PMF)分析表明其为一新肽,Edman降解测得其N端40个氨基酸序列为SQLGDLGSGA GKGGGGGGSI REAGGAFGKLEAAREEEYFY,N端有六联体的Gly、二联体的Gly和叁联体的Glu结构域,可归类于富含Gly的抗菌肽。Muscatoxin可能存在蛋白质翻译后修饰。3、经GeneBank数据库查询,Muscatoxin是一个未曾报道过的新肽,其基因在原核生物和真核生物中都有。此序列与基因库中由果蝇Drosophila melanogaster的NM_166597和AY071315基因推导拟蛋白的24～63aa同源性达97.5%,序列高度一致,仅第叁位Val变成了Leu(这两种氨基酸的疏水性质很相似):果蝇中该拟蛋白的序列是从基因序列推导而来的,我们首次从蛋白质水平上分离纯化出了该多肽。4、采用扫描电镜技术,发现蝇蛆抗菌肽Muscatoxin能破坏G~+菌(枯草杆菌、苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌)和G~-菌(铜绿假单孢菌、大肠杆菌)的细胞膜,使其形成穿孔,原生质泄漏而死亡;5、蝇蛆抗菌肽Muscatoxin能杀灭单核白血病癌细胞(THP-1)。经Muscatoxin(2mg/ml)处理后,白血病癌细胞的贴壁性很快被破坏,大量细胞悬浮并死亡。扫描电镜观察发现,悬浮细胞的细胞间质明显减少,细胞形态发生变化,细胞膜出现大量穿孔、原生质泄漏,细胞破裂死亡。Muscatoxin对癌细胞和细菌的杀灭机制相同:6、蝇蛆抗菌肽Muscatoxin有一定的哺乳动物细胞毒性。在高浓度(2 mg/ml)情况下能破坏小鼠全部血细胞的细胞膜,而在低浓度(0.08 mg/ml)情况下仅杀死白细胞,对小鼠的红细胞影响不大,但红细胞的形态变得更圆;7、采用膜片钳技术,发现mM级浓度的蝇蛆抗菌肽Muscatoxin能在胰腺β-细胞上形成阳离子通道,而在原生受体和离子通道少的人胚胎肾细胞(HEK293)上不能形成通道。说明Muscatoxin能与β-细胞上特定的受体相互作用后再使细胞膜穿孔形成离子通道,而且这种穿孔效应不依赖于胞外Ca~(2+)的作用;8、采用胞内荧光测钙技术,发现mM级浓度的Muscatoxin使胰腺β-细胞膜穿孔后外钙内流,使得胞内钙浓度升高,这种作用与Muscatoxin的剂量无关,具有累积效应。Muscatoxin的作用浓度降低到fM级后仍有明显的效果,Muscatoxin对细胞膜的穿孔作用很强。9、从黑果蝇的蝇蛆中分离纯化出另一个新抗菌肽SK84,并测出其全部蛋白序列。SK84与Muscatoxin属于同一抗菌肽家族,并与其它种类的果蝇假蛋白有很高的同源性。SK84在1-100μM范围内无溶血活性。SK84对单核白血病(THP-1)、肝癌(HepG2)、乳腺癌(MCF-7)等细胞有抑制作用,但对人胚胎肾细胞(HEK293)、仓鼠卵巢(CHO)细胞无影响。
参考文献：
[1]. 家蝇中免疫及抗菌活性物质的分离与纯化[D]. 高嘉. 天津科技大学. 2002
[2]. 工程蝇蛆中免疫活性物质的研究[D]. 陈一. 天津科技大学. 2003
[3]. 蝇蛆耐高温抗氧化肽的发现及生物信息学分析[D]. 王土连. 广州大学. 2017
[4]. 工程蝇蛆的开发利用和深度加工[J]. 贺继东, 夏文水. 食品工业科技. 2002
[5]. 家蝇幼虫凝集素的分离纯化及其抑制MCF-7细胞活性的研究[D]. 霍哲. 天津科技大学. 2009
[6]. 家蝇幼虫粉作为饲料添加剂在鲫鱼养殖中的应用[D]. 李小波. 南方医科大学. 2013
[7]. 蝇蛆蛋白凝胶制备、质量标准建立与药效学研究[D]. 边海旭. 第四军医大学. 2017
[8]. 蝇蛆免疫增强物质研究进展[J]. 王土连, 柯德森. 广州化工. 2015
[9]. 蝇蛆对粪中养分的转化及蝇蛆对粪中养分利用率的研究[D]. 吕丰喆. 沈阳农业大学. 2016
[10]. 家蝇蛆抗菌肽的分离纯化和性质研究[D]. 陆婕. 华中科技大学. 2005
标签：轻工业手工业论文; 凝集素论文; 蛋白质结构论文; 细胞免疫论文; 蛋白质纯化论文; 凝胶层析论文; 酵母细胞壁论文; 凝胶色谱论文; 蛋白质合成论文; 聚丙烯酰胺凝胶论文;