（1第四军医大学学员旅 陕西 西安 710032）
（2第四军医大学西京医院骨科 陕西 西安 710032）
【摘要】 目的：建立一种简单、稳定、高效的新生大鼠背根神经节神经元原代培养方法。方法：摘取新生24h SD大鼠背根神经节，采用0.25%胰酶和0.1%Ⅳ型胶原酶消化，制成单细胞悬液，接种于Neurobasal/B27无血清培养液中。将培养3d的DRGn于倒置相差显微镜下进行形态学观察，扫描电镜行细胞形态学检测，应用β-tubulinⅢ进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞纯度。结果：体外培养的背根神经节神经元生长状态良好，纯度可达到(92±6)%。结论：本实验方法简单、稳定、高效，可以获得高纯度的背根神经节神经元。
【关键词】 背根神经节；动物实验；细胞培养；纯化
【中图分类号】R74 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0034-03
The dissection, purification and culture of dorsal root ganglion neurons from new born rats
Zhang Yuyao1, Liang Chen1, HU Xueyu(corresponding author)2
1 Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China
2 Department of orthopaedics, Xijing hospital,Fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China
【Abstract】Objective To establish an simple, efficient, reliable method for the purification culture system of dorsal root ganglion neurons derived from new born rats. Methods Dorsal root ganglions harvested from new born SD rats were digested with the mixture of trypsin and collegonease Ⅳ, then turned into single cell suspension and plated in neuralbasal media. The purified rate was evaluated according to cell count and β-tubulinⅢ immunocytochemistry stain. Results Cultured dorsal root ganglion cells could survive healthily. The purification rate of neurons was（92±6）%. Conclusion The method, which is used for culture and purification of DRGn, is a simple, efficient and reliable way. Using it could obtain highly purify neurons.
【Key words】Dorsal root ganglion; Animal experimentation;Cell Culture;Purification
背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）主要由感觉神经元组成，参与脊髓反射与感觉功能的调节，DRG因其细胞种类、生物学特性单一，越来越受到人们的重视。背根神经节神经元（dorsal root ganglion neuron,DRGn）被广泛地应用于观察神经元的死亡过程、突触生长、生长因子的信号传导途径、疼痛过敏的研究及相关神经机制的研究[1-3]。我们采用新生大鼠DRGn来作为研究对象分析电刺激对神经元突起再生的影响，进行轴突生长发育的研究，是经典而常用的方法之一[4]。
1.材料和方法
1.1 材料
新生24h SD大鼠，由第四军医大学实验动物中心提供。DMEM/F12(1:1)培养基、NeurobasalTM 培养基、B-27添加剂、胎牛血清等购自Gibco公司，Ⅳ型胶原酶、cy3山羊抗小鼠二抗购自Sigma公司，β-tubulin Ⅲ小鼠抗大鼠一抗购自 Millipore 公司。
1.2 方法
1.2.1培养原代DRGn 将新生鼠置于75%乙醇中浸泡3～5min，再泡于盛有预冷D-Hank’s液的大皿中。解剖显微镜载物台上置一冰袋，将新生鼠置于冰袋上盛有D-Hank’s液的小皿中。用显微镊剥离新生鼠背部皮肤及皮下组织，暴露脊柱及其两侧，由下至上纵行打开椎管；小心咬除部分椎板，可见在椎间孔旁有沿脊柱两侧排列的圆形、透亮的背根神经节，轻柔夹出神经节（去除与其连接的神经根），置于盛有预冷D-Hank’s液的小皿中。显微镜下尽可能剥离包绕神经节的纤维膜等，用预冷D-Hank’s 液小心冲洗2～3次，去除血液成分。将其充分剪碎后，转移至离心管中，加入0.25%胰酶和0.1%Ⅳ型胶原酶（等体积混合），细胞培养箱（37℃、5%CO2）中消化20～30min。期间隔5min观察消化情况并稍加震荡。加入3～5倍于消化液体积的DF12/20%FBS以终止消化作用，静置5min后，以1000rpm 离心5min，弃上清液。加入DF12/20%FBS培养液1～2ml（视细胞量）重悬，轻柔吹打成细胞悬液（吹打过程中不能吹出气泡），血球计数板计数。计数后以104/cm2的密度接种于培养皿内，置于细胞培养箱（37℃、5%CO2）中培养。
接种6h后，显微镜下观察细胞已完全贴壁，全量换成Neurobasal/B27无血清培养液，放入细胞培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养。以后每3～4d半量换液。
1.2.2细胞形态观察 将培养3d的DRGn于倒置相差显微镜下进行形态学观察，于镜下随机选取100倍、200倍及400倍视野并保存图像，观察其形态及生长状态。
1.2.3扫描电镜观察DRGn 将培养3d 的DRGn 从细胞培养箱中取出；用D-Hank’s液冲洗3次；加入2.5%戊二醛，4℃下固定2h，再以0.01M PBS漂洗3次、每次10min；置于1%四氧化锇中固定，4℃下固定1.5h；用0.01M PBS漂洗3次、每次10min；转入梯度乙醇中进行脱水后，进行醋酸异戊酯置换；CO2临界点干燥；种有细胞的表面喷金，扫描电镜下观察，保存图像资料。
1.2.4免疫细胞化学染色 将原代培养5d的DRGn从细胞培养箱中取出，吸除培养液，0.01M PBS清洗3次、每次5min；4%多聚甲醛室温下固定30min；用PBS洗3次，换入0.2% Triton室温作用10min，0.01M PBS清洗3次、每次5min，去除PBS；加入β-tubulin Ⅲ抗大鼠一抗（1:500，用0.01M PBS 稀释抗体），4℃过夜，0.01 M PBS 清洗3 次、每次5min，去除PBS；4) 在暗处加入cy3 荧光标记的抗小鼠IgG 二抗（1:500），37℃温箱作用1h，0.01M PBS 清洗3 次、每次5min，去除PBS；在暗处加入DAPI 染色液室温下作用5min，0.01M PBS 清洗3次、每次5min，去除PBS，甘油封片后于–20℃保存；于荧光显微镜下观察免疫细胞化学染色情况，发出红色荧光的为DRGn，发出蓝色荧光的为细胞核。在100倍下随机选择8～10个视野，分别记录DRGn、细胞核数目以计算神经元纯度（神经元纯度=β-tubulin Ⅲ阳性细胞数/DAPI 阳性细胞数×100%）。所得数据以均数±标准差（x-±s）表示。
2.结果
2.1 DRGn 的生长状态
运用改良的酶消化法（终浓度0.125%胰酶+0.05%Ⅳ型胶原酶）成功分离新生大鼠DRGn，利用Neurobasal/B27无血清培养液培养最大程度上减少胶质细胞数目，从而得到高纯度的神经元。
接种的细胞大部分在4～6h开始贴壁，贴壁细胞彼此分散，呈圆形，有明显光晕，其中主要有DRGn、雪旺细胞及成纤维细胞。1d 后胞体逐渐增大，细胞折光性好；其中，有粗长突起、胞体呈梭形且呈旋涡状或链状排列的细胞为雪旺细胞；胞体较小、呈梭形或多角形且无突起的，为成纤维细胞；而DRGn胞体大小不等、呈圆形或椭圆形，周围长出突起，体外培养的DRGn常见多极、假单极或双极突起。1～3d，发现培养液面漂浮的死亡细胞逐渐增多，主要为雪旺细胞和成纤维细胞。3d后，DRGn 胞体增大、突起细长并互相交织，形成稀疏网络（图1A、B、C）；通过扫描电镜观察DRGn 贴附生长，胞体两端发出细长突起，沿着表面走行，可见DRGn生长状态良好（图1D）。
图1. 光镜及扫描电镜下观察原代培养的DRGn
A．原代培养的DRGn（×100）；B．原代培养的DRGn（×200）；C．原代培养的DRGn（×400）；D. 扫描电镜下观察DRGn
2.2 免疫细胞化学染色及神经元纯度鉴定
将原代培养5d 的DRGn 经免疫细胞化学染色，置于荧光显微镜下观察。结果显示：发出红色荧光的是DRGn 胞体及突起，表现为β-tubulin Ⅲ染色阳性（图2A）；发出蓝色荧光的是细胞核，表现为DAPI 染色阳性（图2B）；A、B两图融合后（图2C），记录着红色的DRGn 胞体数及着蓝色的细胞核总数，然后利用前者除以后者，得到体外培养的DRGn 纯度为(92±6)%。可见，以Neurobasal/B27 无血清培养液进行DRGn原代培养，为DRGn 提供有利生长环境的同时，有效抑制了雪旺细胞及成纤维细胞的增生，从而获得高纯度神经元。
图2. DRGn 免疫细胞化学染色及纯度鉴定
A. β-tubulin Ⅲ阳性细胞表示神经细胞（×100）；B. 细胞核由DAPI 染色（×100）；C. A 与B 融合图（×100）
3.讨论
3.1 神经细胞的体外培养及其在研究中的重要性
体外培养神经细胞简化了细胞的生长环境及条件，使研究者可以对神经细胞施加各种实验因素，对神经微环境稳态造成影响。体外培养方法为研究神经元在分子和细胞水平所作出的应答反应提供了有力的实验模型，是严格意义上可控性强的原代培养方法，是神经科学研究中非常重要的研究手段[4]。
神经细胞（包括中枢神经元及外周节细胞）是永久性细胞，不具有再生、分裂能力。体外培养的神经元，其数量不会增加，然而在一定的培养条件下，这些神经元可能会有一定程度的分化，如神经突起再生及髓鞘形成，或者分泌神经营养因子、神经递质等[5,6]。
在不同部位来源的神经细胞中，背根神经节中的神经元胞体排列相对集中、密度大、纯度高，节内大多数是节神经元（另有少量卫星细胞），其表面覆盖的被膜主要由成纤维细胞组成，而延伸出来的神经突起表面主要由雪旺细胞组成。因此，体外培养背根神经节神经元，其细胞类型单一，是较为理想的研究模型，广泛用于多方面神经科学研究领域，如神经突起或轴突再生、突触形成、神经元存活、神经营养因子的运输和信号转导、神经递质释放、生长锥导向、细胞骨架研究、神经细胞电信号、胞内蛋白合成及运输、疼痛机理研究、膜片钳分析等[7-12]。其中，科学家们在研究临床中的周围神经损伤、周围神经病变后导致的轴突再生障碍时，最常用到的细胞模型是背根神经节神经元。
3.2 背根神经节神经元
周围神经包括感觉、运动和自主神经。传入神经分支，即感觉神经来自于背根神经节神经元。不像其他神经元那样有轴突-树突结构，背根神经节神经元是假单极神经元，由胞体发出单个轴突后分成两支，一支进入周围组织（即周围支），一支进入脊髓（即中枢支）。周围神经病变可累及其各个组成部分，而常常背根神经节神经元受损较早且较为严重[13]。在光镜下，观察到背根神经节神经元大小不一、形状多样；胞体直径大则光镜下染色浅，反之染色深[14]。
3.3 背根神经节神经元纯化培养方法
背根神经节神经元可以较容易地从胚胎、新生、成年实验动物获得，进行体外培养。目前有很多种培养方式，如组织块培养、分离细胞培养或与其他细胞联合培养。针对本研究的特点和目的，为了摒除其他因素可能造成的影响，我们采用分离细胞、纯化培养体系、获得高纯度神经元的方案来进行实验。然而，背根神经节神经元体外培养体系中主要有神经元、卫星细胞、成纤维细胞、雪旺细胞，如果不对该体系进行纯化，其他细胞会吸收大量养分并占据生长空间，神经元会逐渐死亡。因此，达到良好的神经元纯化效果，是研究神经元对干预因素做出复杂反应的重要前提。
主要的纯化培养体系方法有差速贴壁法、抗有丝分裂法、密度梯度离心法。但这些方法的纯化效果并不理想。目前，国际上较认可的方法是利用无血清Neurobasal/B27培养基进行神经元纯化培养[8,15,16]。该培养基由于不含血清成分，非神经元细胞的增殖便受到抑制；而其中含有的B27、谷氨酰胺等成分则有效地促进了神经元的存活[17]。除此以外，本实验还采用低密度接种细胞以降低神经元与非神经元之间的联系，有助于纯化。本实验结果显示，使用无血清Neurobasal/B27培养基、低密度培养的神经元生长状态良好，纯度达到(92±6)%，为后续深入探讨电刺激促进神经突起再生的分子机理提供可靠的实验模型。
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论文作者:张雨尧1,梁宸1,胡学昱2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第21期供稿
论文发表时间:2015/10/9
标签：神经元论文; 细胞论文; 神经节论文; 突起论文; 体外论文; 培养液论文; 血清论文; 《医药前沿》2015年第21期供稿论文;