（1贵阳中医学院药学院 贵州 贵阳 550002）
（2无锡市中医院 江苏 无锡 214000）
（3贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科 贵州 贵阳 550002）
【摘要】 目的：考察苗药啊咳知和黔产石韦不同提取部位的体外抗炎及抗血管生成的分子靶点。方法：对苗药啊咳知使用不同浓度的乙醇提取其化学物质，使用不同浓度提取物体外干预在类风湿性关节炎的病理发展中起到重要作用的NF-κb，TNF-α，TNFR1，VEGFR1四种重组蛋白，利用酶联免疫分析方法检测药物对蛋白的体外抑制作用。结果：本研究共提取分离出6种不同部位的提取物，每种提取物对NF-κb，TNF-α，TNFR1，VEGFR1均有一定的体外抑制作用。结论：两种石韦抗炎镇痛和抗血管生成的分子机制之一为直接对上述四种蛋白的抑制作用，两种石韦各有其选择性抑制的优势分子。
【关键词】 药物筛选；类风湿性关节炎
【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）26-0142-02
介绍
苗药啊咳知，即庐山石韦Pyrrosia sheareri（Bak.）Ching，黔产石韦Pyrrosia lingua (Thunb.) Farwell均为水龙骨科（Polypodiaceae）石韦属（Pyrrosia）植物。中药石韦具有抗炎镇痛等药理作用，但其具体作用于何种分子尚不明确[1]。石韦的主要化学成分芒果苷已有研究表明具有抗肿瘤作用[2]，其作用靶点亦不明确，肿瘤生长转移和传播过程中的一种基本活动即为新血管的形成[3]，提示石韦可能具有抗血管生成的作用。
1.药物制备
1.1 药物来源
实验药物啊咳知、黔产石韦于2013年3月采自贵州省安顺市紫云县候场镇。
1.2 仪器及试剂
JEOL ECX-500 500MHz超导核磁共振谱仪（日本电子株式会社）；5973 MSD质谱仪（安捷伦公司）；HP8453紫外可见分光光度计（惠普公司）；VECTOR22型傅立叶变换红外光谱仪（德国BRUKER仪器公司，KBr压片）；XT-4双目显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司，未校正)；J209A-4型植物粉碎机（河南黄骅齐家务科学仪器厂）；R-201型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；D101 大孔树脂(工业级，天津南开化工厂)；显色剂：10%硫酸乙醇溶液，改良碘化铋钾试液；其它试剂均为分析纯。芒果苷标准品购自上海永叶生物科技有限公司。
1.3 药物制备
石韦全草风干，粉碎，85%乙醇回流提取3次，每次1小时，第1次加5倍量的85%乙醇，浸渍1h，第2次、第3次各加4倍量的85%的乙醇，每次提取1h，滤过，合并提取液浓缩成浸膏，滤液回收乙醇，挥净残留乙醇至相对密度为1.01(80℃测)。采用文献[4]中的方法对D101大孔树脂进行预处理和装柱。浸膏用蒸馏水溶解后经用分别用蒸馏水、50%乙醇和90%乙醇洗脱得到的石韦水提取部分，50%乙醇部分和90%乙醇部分。啊咳知的提取分离方法同石韦，得到啊咳知水提部分，50%乙醇部分和90%乙醇部分。将上述各提取物挥净乙醇后，以二甲基亚砜为溶剂配制成高浓度2.40ug/ul、中浓度1.20ug/ul、低浓度0.60ug/ul。将芒果苷标准品配制成高浓度0.6ug/ul，中浓度0.3ug/ul，低浓度0.15ug/ul。
2.体外抗风湿活性研究
2.1 仪器及试剂
LD25-2自动平衡离心机(北京医用离心机厂生产)，DG5033A 酶联免疫检测仪(上海同舸工贸有限公司)，孵育箱(7601，GFL)；洗板机(130011，AT-828)。
重组人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）冻干粉，重组人肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）冻干粉，重组人核因子κb（NF-κb）冻干粉，重组人血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）冻干粉购自上海创赛科学仪器有限公司。TNF-α酶联免疫分析试剂盒，TNFR1酶联免疫分析试剂盒，NF-κb酶联免疫分析试剂盒，VEGFR1酶联免疫分析试剂盒均购自上海齐一生物科技有限公司。去离子水、0.1%PBS-BSA均购自上海如吉生物科技发展有限公司。
2.2 实验方法[5]
将上述四种蛋白的冻干粉高速离心(10，000rpm)30秒，用去离子水溶解成1.0mg/mL的溶液，再用0.1%的PBS-BSA溶液将各种蛋白配制成相应的浓度：TNF-α原倍浓度56pg/ml，TNFR1原倍浓度168ng/ml，NF-κb原倍浓度281ng/ml，VEGFR1原倍浓度56ng/ml，4℃保存。将每100μl的原倍浓度蛋白溶液与各浓度100μl的药物在常温下混合，放置1h，称为干预供试液。将每种原倍蛋白溶液100μl与0.1%PBS-BSA溶液100μl混合制成未干预供试液。按照酶联免疫分析试剂盒的说明书的步骤进行操作，使用酶标仪读出所有供试液的光密度值（OD值）。
抑制率计算公式：抑制率(100%)=(未干预供试液的OD值-干预供试液的OD值)/未干预供试液的OD值*100%。
2.3 结果
从以下4表可以看出，所有的药物都均可对NF-κb，TNF-α，TNFR1，VEGFR1产生体外的直接抑制作用，不呈明显的浓度依赖性。表1示，两种药物对NF-κb的抑制率在40%-70%，低于芒果苷。表2示，对TNF-α的抑制率，90%啊咳知部分的低浓度跟芒果苷的高浓度的抑制率相似，74%左右。表3示，对TNFR1的抑制率，啊咳知的抑制率略优于石韦，仍低于芒果苷。表4示，石韦90%提取物的低浓度抑制率达到77%。
2.4 讨论
TNF-α是一个具有多重功能的细胞因子，在免疫调节，炎症反应中起着关键的作用，根据不同的细胞微环境，TNF-α可以诱导凋亡，坏死，血管生成，刺激肿瘤细胞生长，增殖，侵袭，转移等多种反应[6]。TNFR1是TNF-α在细胞膜上的受体，二者结合后，激活细胞内NF-κb炎症信号通路，介导细胞增殖、活化及炎性反应，抑制TNF-α、TNFR1、NF-κb能明显减轻炎症反应[7]。VEGFR1为VEGF的垮膜受体，在众多的血管再生性因子当中，二者被公认为是介导肿瘤血管生成的关键因素和最强因子[3]，在类风湿关节炎（RA）滑膜血管增生和关节破坏方面起到重要作用[8，9]，在RA的滑膜关节炎症的情况下，滑膜巨噬细胞表面表达VEGFR1异常活跃，与VEGF结合后促进滑膜血管异常增生，抑制VEGFR1能有效抑制血管生成，甚至逆转关节炎小鼠模型的关节破坏[10，11]。以上四种蛋白均为抗炎，抗血管生成的分子靶点。高通量药物筛选(high throughput screening， HTS)是以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，采用自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，再通过计算机对实验获得的数据进行分析处理[12]。利用ELISA反应原理建立的筛选药物活性的方法，是一种经济、简单、快速、高效、敏感的筛选手段，得到许多天然药物研究者的认可[13，14]。
本研究结果显示，黔产石韦和苗药啊咳知的不同提取部位对四种蛋白均有抑制作用，对每种蛋白的抑制率均在55%-77%左右，二者的抑制率差别比较小，啊咳知对NF-κb和TNFR1的抑制作用略优于石韦，石韦对TNF-α和VEGFR1的抑制作用略优于啊咳知。芒果苷对NF-κb、TNF-α、TNFR1的抑制作用较好，但是对VEGFR1的抑制略弱。芒果苷的高浓度0.6ug/ul同其他药物的低浓度，对NF-κb、TNF-α、TNFR1的抑制率均优于其他药物，提示提取物中多种化学成分混杂，会影响抑制作用的效能。仅有90%乙醇提取物的低浓度部位对VEGFR1表现出明显的优势，芒果苷的抑制率却较低，提示该部位的提取物中含有某种化学物质对VEGFR1可能具有较好的抑制作用。
石韦抗炎镇痛和抗血管生成的分子机制之一为直接对上述四种蛋白的抑制作用，两种石韦各有其选择性抑制的优势分子。
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基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2013]2071,编号：黔科合J字[2015]2024）
论文作者:刘益臻1,何康1（通讯作者）,赵国青2,马武开3,
论文发表刊物:《医药前沿》2017年9月第26期
论文发表时间:2017/9/12
标签：石韦论文; 抑制论文; 乙醇论文; 浓度论文; 血管论文; 作用论文; 药物论文; 《医药前沿》2017年9月第26期论文;