（南京军区福州总医院350025）
【摘要】目的：探讨丹参酮IIA改善脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的作用及可能的机制。方法：采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型（CLP），给予丹参酮IIA（TanIIA）腹腔注射处理。分析治疗6-24h后脑组织TNF-α、IL-1β、MDA、SOD的水平、病理学变化、细胞凋亡率、促凋亡基因（Bax、Fas、P53和Caspase-3）和抑制凋亡基因（Bcl-2）的表达情况。结果：①脓毒症大鼠中TNF-α和IL-1β水平显著升高（P<0.05），而丹参酮IIA可以抑制脓毒症大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β水平的升高（P<0.05）；②脓毒症大鼠中MDA水平明显升高（P<0.05），SOD水平显著降低（P<0.05）；丹参酮IIA干预后，MDA和SOD的异常水平显著改善（P<0.05）；③脓毒症组大鼠造模后6h脑组织已出现病理学的异常改变，细胞凋亡指数显著高于假手术组（P<0.05）；给予Tan IIA处理之后，病理学的异常改变得到明显的改善，凋亡指数显著降低（P<0.05）④Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平下降（P<0.05）；P53、Bax、Fas和Caspases-3蛋白和mRNA表达水平升高（P<0.05）；丹参酮IIA干预可以使上述蛋白和mRNA的异常表达水平部分恢复（P<0.05）。结论：丹参酮IIA 具有改善脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的作用，可能机制是通过其抗炎（TNF-α、IL-1β）、抗氧化（MDA、SOD）的作用，并调控凋亡相关基因（Bcl-2、Bax、p53、Fas、Caspase-3）的表达来实现。
【关键词】丹参酮IIA； 脓毒症；作用
【中图分类号】R-332 【文献标识码】A 【文章编号】
【Abstract】Objective:To investigate the effect of tanshinone IIA improve tissue injury and apoptosis and the possible mechanisms of brain in rats with sepsis.Methods:The rat cecal ligation and puncture sepsis model preparation technique (CLP),give Tan IIA (TanIIA) by intraperitoneal injection process. Analysis of brain tissue treatment 6-24h TNF-, IL-1, MDA,SOD levels,pathological changes,apoptosis rate,pro-apoptotic genes(Bax,Fas,P53 and Caspase-3)and inhibition of apoptosis gene (Bcl-2) expression.Results:①sepsis rat TNF-αand IL-1βlevels were significantly increased (P<0.05),while Tan IIA can inhibit the increase of brain tissue in rats with sepsis TNF-α and IL-1β levels (P<0.05);②septic rats MDA levels were significantly increased (P<0.05),SOD levels were significantly lower (P<0.05);after Tan IIA intervention, MDA and abnormal levels of SOD significantly improved (P< 0.05);rat brain tissue after modeling 6h③sepsis group has appeared abnormal pathology,apoptosis was significantly higher than the sham group (P<0.05);after treatment to give Tan IIA,pathological abnormalities change has been significantly improved,the apoptotic index was significantly lower (P<0.05)protein and mRNA expression levels of④Bcl-2 decreased (P<0.05);increased P53,Bax,Fas and Caspases-3 protein and mRNA expression levels (P<0.05);tanshinone IIA interventions can make the above-mentioned abnormal protein and mRNA expression levels of partial recovery (P<0.05).Conclusion: Tanshinone IIA has improved cerebral tissue damage and apoptosis in septic rats,the possible mechanism is through its anti-inflammatory (TNF-α,IL-1β),antioxidant (MDA,SOD) the role and regulation apoptosis-related genes(Bcl-2,Bax p53 Fas Caspase-3,) to achieve expression.
【Key words】tanshinone IIA;sepsis;the role of
材料与方法
1 动物、药物及试剂 SPF级雄性Sprague Dawley大鼠54只，体重为280g~300g（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），丹参酮IIA磺酸钠注射液(诺新康；2ml:10mg；上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022558)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）以及TNF-α和IL-1βElisa试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝塞生物技术有限公司。蛋白抗体购于CellSignaling Technolgy公司。PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成; 其余试剂为国产分析纯（武汉康盛医药科技有限公司）。
2实验分组 根据实验设计随机分为3组：假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）、脓毒症+丹参酮ⅡA治疗组（CLP+TanⅡA组），每组18只；CLP+TanⅡA组术后于腹腔注射40mg/d的丹参酮IIA磺酸钠注射液（Tan IIA），其余两组均给予生理盐水对照；3组大鼠均于同一环境下饲养。模型制成后，每组分别于6、12、24h断头处死，取脑组织进行实验指标检测。
3方法
3.1模型制作 采用盲肠结扎穿孔手术（CLP）制作脓毒症模型；四组大鼠均在术前禁食12h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/kg），充分麻醉后置于仰位,消毒腹部皮肤,于中下腹部做3cm纵切,打开腹腔,通过钝性分离及游离操作，充分暴露盲肠，仅CLP+Saline组和CLP+Tan IIA组于距盲肠末端1cm处采用3号缝合线环形结扎，保证肠道通畅，并据结扎处5mm位置采用9号针头贯穿盲肠2次，并轻挤压确保粪便溢出，并进行后续的关闭腹腔手术。Sham组仅做盲肠探查术。
3.2大鼠脑组织中TNF-α、白介素-1β、MDA含量及SOD活性的测定 取脑组织制备组织匀浆，取上清液备用。酶联免疫吸附法测定TNF-α、IL-1β的含量，羟胺法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，操作步骤按相关试剂盒说明书进行。
3.3 HE染色光镜检查 常规石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯，Harris苏木精染核，0.1mol·L-1盐酸乙醇返蓝，至水洗，入0.1mol·L-1伊红水溶液染色，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片镜检。
3.4透视电镜检查 将每个大脑冠状切片再进一步分成大小为1㎜×1㎜×2㎜的4～5块，经2.5%戊二醛及1%锇酸双重固定后，丙酮逐级脱水，树脂包埋，做超薄切片，厚度为50nm，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，JEM 1200-EX 型透视电镜观察并照相。
3.5细胞凋亡检测 细胞凋亡检测采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)，具体操作严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。凋亡的细胞核被染成棕黄色,未凋亡的细胞核为深蓝色。高倍镜下每张切片随机选取10个视野,计数凋亡阳性细胞,以凋亡指数（Apoptosis Index,AI）反映各组心肌凋亡的情况,AI=(视野内凋亡细胞个数/视野内所有心肌细胞个数)×100%。
3.6促凋亡基因（Bax、p53、Fas和Caspase-3）、抑制凋亡基因（Bcl-2）的蛋白水平检测 采用Westernblot法。具体步骤见Zhu等[10]的报道，简述如下：待提取好的将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸后，进行10% SDS-PAGE电泳，采用半干转进行蛋白转膜，根据要求分别加入Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2的一抗孵育过夜，待完成二抗孵育后进行ECL显示处理，将数据进行Gel-Pro analyzer分析光密度，最终结果以Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。
3.7促凋亡基因（Bax、p53、Fas和Caspase-3）、抑制凋亡基因（Bcl-2）的mRNA水平检测 采用RT-PCR检测。具体方法参见Alaaeddine的报道，采用ΔΔCt法分析Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2的扩增效果，并与β-actin做标准化处理，结果均以2-ΔΔCt来表示。
Bax引物1(forward)5’-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTCTC-3’引物2(reverse)5’-AGTTGCCATCAGCAAACATGTCA-3’
Caspase-3：引物1(forward)5’-TACCCTGAAATGGGCTTGTGT-3’引物2(reverse)5’-GTTAACACGAGTGAGGATGTG-3’
Bcl-2：引物1(forward)5’-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3’引物2 (reverse) 5’-CAGGATGC- GTCCACCAAGAAGCTG-3’
p53：引物1(forward)5′-GTGGCCTCTGTCATCTTCCG-3’引物2(reverse)5′-CCGTCACCATCAGAGCAACG-3′扩增产物长度291bp；
Fas：引物1(forward)5′-CCAAATGCAGAAGATGATTGTGTG-3’引物2(reverse):5′-TGCCACTGTTCAGGATTTAAAGGTTG-3′扩增产物长度258bps
β-actin：引物1(forward)5’-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3’引物2(reverse)5’-TAGAGCCACCAATCCACACA-3’
3.8 统计学分析 应用SPSS16.0软件包处理，各指标均以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用为SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
1大鼠心肌组织中炎性、氧化因子水平
与假手术组6、12、24h三个时间点比较，脓毒症组大鼠心肌组织中6、12、24h对应时间点测得的TNF-α、IL -1β和MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)，且呈时间依赖性，Tan IIA可改善脓毒症导致的心肌组织TNF-α、IL-1β、MDA含量和SOD活性的异常改变(P<0.05)。（见表1）。
注：三组6、12、24h时间点之间的比较，*P<0.05vsSham；#P<0.05vsCLP
2脑组织HE染色 假手术组脑组织结构完整，胞核、胞浆染色均匀，无明显异常改变（图A-C）。脓毒症组于术后6h处死时，HE染色可见神经元及细胞间隙发生水肿，组织结构疏松，少量的炎症细胞浸润（图D）。术后12h可见神经元胞体明显肿胀，少量胶质细胞增生，炎症细胞浸润明显，病灶周围组织疏松水肿，细胞间隙增宽（图E）。术后24h可见脑组织高度水肿，液化坏死，大量炎症细胞浸润，神经元明显变性坏死，核结构模糊，胶质细胞增生（图F）。与脓毒症组比较，丹参酮ⅡA干预后神经细胞也可见水肿，但细胞层次较清楚，排列较紧密，细胞结构较完整，神经细胞肿胀、变性明显减轻（图G-I）。
注：A-C为假手术组造模后6-24h原始图；D-F为脓毒症组组造模后6-24h原始图：G-I为脓毒症+丹参酮ⅡA治疗组造模后6-24h原始图。
3 脑组织电镜 假手术组脑组织神经细胞核大而圆，染色质均匀分布，核仁明显，核膜完整清晰，胞质内见高尔基器分布于核周，粗面内质网、线粒体散在分布，表面附着核糖体，线粒体呈圆形、椭圆形，内嵴清晰可见，基质均匀（图A-C）。脓毒症组术后6h细胞皱缩变小，核固缩呈不规则形状，核内染色质分布欠均匀，形成染色质块，分布于核膜周边部，电子密度高于正常，核仁消失，核膜完整（图D）；术后12h核膜尚完整，染色质更加致密、均质无结构，电子密度更高（图E）；术后24h细胞染色质凝聚、移动，分布于核周，进而裂解成几个碎片，出现各种形态，如花瓣状、马蹄形等（图F）。与脓毒症组比较，丹参酮ⅡA干预后，细胞核结构尚完整，核膜结构尚清晰，染色质轻度浓缩边集化；内膜系统部分扩张或成空泡状，部分线粒体水肿，嵴排列紊乱，有的空泡化（图G-I）。
注：A-C为假手术组造模后6-24h原始图；D-F为脓毒症+丹参酮ⅡA治疗组造模后6-24h原始图；G-I为脓毒症组造模后6-24h原始图；J为凋亡指数；与Sham组比较，*P<0.05；与CLP组比较，＃P<0.05。
5 三组凋亡相关基因蛋白水平比较 与假手术组相比，CLP 处理可导致脑组织神经细胞的Bax、fas、p53以及Caspase-3的蛋白水平上升（P <0.05），Bcl-2的蛋白水平下降（P<0.05），丹参酮IIA处理后可使上述凋亡相关基因的蛋白水平部分恢复（P<0.05）。见图4。
注：A-E分别为Bcl-2、Bax、、p53、Fas、Caspase-3标准化后的mRNA水平；与Sham组比较，*P<0.05；与CLP组比较，＃ P<0.05。
3讨论
传统中药丹参的有效成分丹参酮IIA具有抗炎、抗氧化以及清除自由基等作用，对多种脑血管疾病具有保护作用。我们的研究发现，脓毒症组大鼠造模后6h脑组织已出现病理学改变，并随着炎症反应的持续呈逐渐加重趋势（HE染色光镜下显示细胞水肿、组织结构疏松、炎症细胞浸润，电镜下显示细胞核细胞高度水肿、胞体不规则突起，可见核固缩、核裂解、核溶解），光镜下脓毒症组可见较大量凋亡细胞（细胞核内可见棕黄色颗粒,图3: G-I），较假手术组明显增多，细胞凋亡指数显著高于假手术组（P<0.05,图3:J）；给予Tan IIA处理之后，上述病理学改变得到明显的改善，凋亡细胞较脓毒症组明显减少（图3:D-F），凋亡指数显著降低（P<0.05，图3:J）。提示通过早期给予丹参酮ⅡA干预能减少脓毒症脑组织的损伤和细胞的凋亡。
炎性、氧化反应是导致细胞损伤和凋亡的重要因素[1]；TNF-α是参与脓毒症全身炎性反应的重要细胞因子[2]，可激活核因子κB介导其他细胞因子（如IL-1、IL-6、IL-8）的合成与释放，启动炎症级联反应，从而导致炎症反应失控[3]。本实验观察到，脓毒症大鼠中TNF-α和IL-1β水平显著升高（P<0.05），并随着炎症反应的持续呈逐渐上升趋势（P<0.05），而丹参酮IIA可以抑制脓毒症大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β水平的升高（P<0.05），提示其可以通过抑制脓毒症大鼠脑组织中炎症因子TNF-α和IL-1β的浸润发挥抗炎作用。此外，氧化应激是炎症反应中的重要环节，在炎症反应过程中可产生大量氧自由基，诱导细胞凋亡。我们发现脓毒症大鼠脑组织中，作为膜脂过氧化最重要产物之一的MDA水平明显升高（P<0.05），而生物体内重要的抗氧化酶SOD水平显著降低（P<0.05），随着炎症反应的持续也呈逐渐恶化趋势（P<0.05）；丹参酮IIA干预后， MDA和SOD水平显著改善（P<0.05）；提示丹参酮IIA具有抗氧化作用，通过抗膜脂过氧化抑制炎症引起的脑组织损伤和细胞的凋亡。
综上所述，丹参酮IIA 具有改善脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的作用，可能机制是通过其抗炎（TNF-α、IL -1β）、抗氧化（MDA、SOD）的作用，并调控凋亡相关基因（Bcl-2、Bax、、p53、Fas、Caspase-3）的表达来实现。
参考文献
[1]Chen H,Zhu W,Feng J,Li S.Protectiveeffectofdiallyltrisulfideonli.JHuazhongUnivSciTechnologMed Sci.2012Oct;32(5):657-62
[2]Cao YZ,Tu YY,Chen X,Wang BL,Zhong YX,Liu MH. Protectiveeffectof Ulinastatinagainst murine models ofsepsis:inhibitionofTNF-α.Exp Toxicol Pathol.2012 Sep;64(6):543-7.[3]JessenKM,LindboeSBPetersen AL,Eugen-OlsenJ,BenfieldT.CommonTNF-alpha,IL-1 beta,PAI-1,uPA.BMC InfectDis.2007Sep18;7:108
论文作者:王建军 王小玲 张冬梅
论文发表刊物:《解放军预防医学杂志》2015年第5期供稿
论文发表时间:2015/11/25
标签：凋亡论文; 细胞论文; 引物论文; 组织论文; 水平论文; 大鼠论文; 炎症论文; 《解放军预防医学杂志》2015年第5期供稿论文;