余文彤[1]2000年在《维甲酸和紫杉醇对肺癌细胞端粒酶活性的影响及其抗癌作用的研究》文中认为前言 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在许多国家居恶性肿瘤之首。由于目前肺癌的病因和发病机理尚不完全清楚，使得肺癌的治疗仍很棘手。目前肺癌的治疗已形成了包括手术、化疗以及放疗在内的综合治疗体系。但即使如此，肺癌的预后仍较差。而化疗、放疗的毒副作用较大，病人难以耐受，且特异性较低。因此寻找一个肿瘤细胞所具备而又不存在于正常细胞的治疗靶子，是许多医学工作者一直探索的问题，近年来发现端粒酶（Telomerase）与人类肿瘤（包括肺癌）之间关系密切，使其成为近期生命科学领域研究的热点。 端粒对维持染色体的结构具有重要意义，端粒酶是维持肿瘤细胞无限增殖与分裂所必须，作为恶性肿瘤的共同生物学标志，可望成为癌症治疗的共同靶子。抑制端粒酶治疗将是一种切实有效、低毒副作用的抗肿瘤治疗方法。 维甲酸（retinoic acid，RA）是迄今研究最多的细胞分化诱导剂之一，文献报导，RA诱导早幼粒细胞白血病HL-6O细胞和大肠癌细胞时端粒酶活性明显被抑制，癌细胞的增殖明显受阻。紫杉醇是目前非小细胞肺癌化疗的一线药物，它通过促进微管的聚合，抑制解聚，使细胞的有丝分裂受阻，从而阻止肿瘤细胞的增殖。RA、紫杉醇对肺癌细胞端粒酶活性有无影响尚未见报导。二药联合用于肺癌的治疗亦未见报导。目的本研究选用RA和紫杉醇作用于肺癌细胞，旨在探讨RA、紫杉醇对肺癌细胞端粒酶活性的影D狗，同时探讨RA、紫杉醇单独及联合应用对体外培养的肺癌细胞及裸鼠肺癌皮卜移怕痫的影响，并从端粒酶角度探讨RA和紫杉醇的抗肿瘤机制及二者联用于临床的可能性。方法1．肺癌细胞活性及IC，。的检狈MTT法） 肺癌A549细胞培养1，3，5天后用酶标仪检测并打印吸光度A，。，，l；。算细胞活力及细胞抑制率，找出 RA、紫杉醇第卜 3、5大的u扣门C，；；表示抑制50％细胞生长的药物浓度人2．RA及紫杉醇对肺癌细胞的欲向（体外实验） 根据MTT法测得的RA、紫杉醇的仁川，分别采用 40umol／L RA、20umol／L紫杉醇及40umol／L RAo0umol／L紫杉醇处理肺癌细胞，培养3大后收集细胞定量检测端粒酶活性，并用MTT法测定不同处理组细胞活力和细胞抑制率。3．RA及紫杉醇对裸鼠肺癌皮下移植瘤的影1响（体内实验） 荷肺腺癌A549皮下移植瘤雄性Bal儿裸鼠40只随机分为 5组，分另腹腔注射生理盐水、溶剂、40mg／kg M、36mg／kg紫杉醇、40mg／kgRAo6mg呐紫杉醇。分别于接种时和停药24小时后称量鼠重，测量移棺瘤长短径。按公式T—扩b0…为短径，b为长径广·算瘤体积。移梢瘤部分用作HE染色常规病理学检查；部分用作端粒酶活性检测。4．端粒酶定量检测5．统计学方法：两组资料的均数比较用t检验，多组资料的均数比较用方 差分析。结果1．体外实验中趴、紫杉醇均能显著抑制肺癌细胞的生长，且呈时问和浓度 依赖性。40umol／L RA、20umol＊紫杉醇及 40umol／L RA＋20uuol＊紫杉 醇处理肺癌细胞3大后其细胞活力分别下降至46．55见48．10见13．04y （与对照组比较 Pm．01，二药联川组与 RA组、紫杉醇组比较 P州．of人 22．RA、紫杉醇均能有效抑制裸鼠肺癌皮下移权瘤的生扶。实验前各组痈体 积无差别。实验后各组比较：RA组u．66士I．57。勺、紫杉醇组伯 93 士2．21。m勺、合用组u．90I2．57。勺瘤体积均显著小于对照组门．15 士1．98皿）及溶齐对照组门．01士1．97＊）（p＜0．01），紫杉醇组及合 用组瘤体积小于 RA组u．01人3．裸鼠体重在实验前无差别。实验后体重，RA组门．05士 1．349X紫杉 醇组门6．41土 1．539人合用组门．50士 1．419）减轻明显于对照组＊2．43 上 1．60P）、溶剂对照组（22．55士 1．56P）＊（0 01）。RA组、紫杉醇组和 合用组三组间鼠重无差别。4．体外、体内实验中RA均能抑制肺癌细胞端粒酶活忖，而紫杉醇则无此 抑制作用。体外实验中RA组肺癌细胞端粒酶活件抑制率为％．93％卜勺 对照组比较P＜0．of），合用组为53．08％（－‘j对照组比较P＜0．01）。体内实 验中RA组肺癌皮下移植瘤细胞端粒酶活性抑制率为”．26％〔‘－）溶剂对 照组比较＊0．of），合用组为37．75％（与溶齐对照组比较＊0．01）。结论1．RA在体外、休内均能显著抑制肺癌细胞端粒腼活忖，而紫杉醇则对肺癌 细胞端粒酶活性无影【．他 二药联用对肺癌细胞端粒酶刀忖儿办同抑制作 用。2．RA、紫杉醇在体外均能显著抑制肺癌细胞的生长，此抑制作川与药物呈 作用时间和浓度依赖性。RA与紫杉醇联用对体外培养的肺癌细胞的生氏 具有协同抑制作用。3．RA抑制肺癌细胞端粒酶活性可能是其抗肿瘤效应的机制之一。紫杉醇则 不是通过抑制端粒酶活性而产生抗E。！J瘤效应。两种不同作川机制的药物 联用对体外肺癌细胞的生长有显著的协同抑制效应。4．lth、紫杉醇均能显著抑制裸鼠
姜山[2]2011年在《猫眼草活性成分提取物的肺癌抑制作用及其机制研究》文中研究指明肿瘤依然是人类尚未克服的严重威胁人类健康的疑难病症之一,其发病率和死亡率均居各类疾病之首。其中,肺癌发病率及死亡率高居首位。目前,肿瘤的防治仍然采取手术为主,放化疗为辅的策略,而药物学治疗是目前抗肿瘤防治研究最为活跃的领域。当前临床常用的抗肿瘤药约有七十余种,但仍不能有效控制肿瘤的发生与发展。尽管进入临床研究的抗肿瘤药物居高不下,但理想的高效低毒药物却寥寥无几。天然产物是抗肿瘤药物的重要来源。我国的药用植物种质资源丰富,中医药作为我国的国粹,中药的抗肿瘤活性已得到国际公认。猫眼草是中国传统中草药之一,其提取物抗肿瘤作用的研究已有部分报道,但关于其抗肿瘤活性的物质基础及其详细机制未有文献报道。本论文通过提取分离获得猫眼草中黄酮类物质的基础上,进一步观察了其体内对肺癌的作用,并探讨了其作用机制。1、猫眼草中黄酮类物质的提取工艺探讨采用均匀设计法研究从猫眼草中提取总黄酮的工艺,以乙醇为溶剂,考察了四个因素乙醇浓度(30%～90%)、乙醇用量((W/V):9～15倍)、回流时间(0.5～3.5小时)、回流次数(1～3次)对猫眼草总黄酮提取率的影响,以确定最佳的提取工艺条件。并按设计方法进行了验证试验。结果表明:以原药材14倍(W/V)的50%乙醇水溶液,加热回流提取2次,每次1小时的条件,从猫眼草中提取总黄酮的提取率最高(3.28%)。用该工艺提取猫眼草总黄酮工艺简单,提取率高,操作容易控制,稳定性好,适合于工业化生产。2、利用血清药理学手段,在细胞水平确定了猫眼草黄酮类粗提物的抗肿瘤作用在确定猫眼草黄酮类粗提物具有抗肿瘤作用的基础上,进一步采用血清药理学方法,利用体外细胞培养技术,结合Western Blot手段,研究了猫眼草黄酮类粗提物抗肿瘤作用的机制。结果发现,含猫眼草黄酮类粗提物兔血清可明显抑制肺癌细胞株A549的增殖,且其抑制作用具有一定的浓度和时间相关性,20%浓度下作用72h对A549增殖的抑制率为39.08%。采用流式细胞技术发现,猫眼草黄酮类粗提物兔血清可明显阻滞肺癌细胞株A549于G1期,并出现明显的细胞凋亡。进一步采用Western Blot手段观察了细胞周期相关及凋亡相关蛋白的变化,结果表明,含猫眼草黄酮类粗提物兔血清可以促进凋亡相关蛋白Caspase-9和Caspase-3蛋白切割,进而引起PARP蛋白活化,促进凋亡相关蛋白Bax表达升高,减少抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达及凋亡相关蛋白Bad磷酸化。表明含猫眼草黄酮类粗提物兔血清能够诱导肺癌细胞株A549的凋亡。3、确定了猫眼草黄酮类粗提物具有抗肿瘤作用利用荷Lewis肺癌小鼠肿瘤动物模型,通过观察肿瘤重量变化,评价了猫眼草黄酮类粗提物体内对肿瘤生长的影响,并通过观察动物一般表现、体重变化及用药后动物的胸腺和脾脏重量的改变,初步评价药物的潜在的一般毒性及其对动物免疫功能的影响。结果发现,猫眼草黄酮类粗提物在1和0.5g/kg剂量下连续服用19天,可明显抑制Lewis肺癌在小鼠体内的生长(与模型组比较,p<0.01和0.05),对肿瘤生长的抑制率分别为41.14%和40.40%;猫眼草黄酮类粗提物在0.25g/kg剂量下连续服用19天,对Lewis肺癌在小鼠体内的生长有一定的抑制作用,其对肿瘤生长的抑制率为21.31%,但与模型组比较无统计学意义。提示猫眼草黄酮类粗提物体内具有一定的抑制肿瘤生长的活性。猫眼草黄酮类粗提物在1和0.5g/kg剂量下连续服用19天,对荷Lewis肺癌小鼠的胸腺和脾脏重量均有一定的减轻作用,但仅1g/kg剂量下对脾脏重量的减轻具有明显的统计学意义(与模型组比较p<0.01),其他各组各指标虽有下降趋势,但与模型组比较无统计学意义。相应计算的脾指数和胸腺指数也表现出了同样的趋势。提示其本身可能具有一定的影响机体免疫功能的作用,但也有可能是其抑制肿瘤生长后表现出来的间接效应。实验期间的一般观察发现,除环磷酰胺组和猫眼草黄酮类粗提物高剂量(1g/kg)组动物略显消瘦外,各组动物的精神状态、饮食、饮水、大小便等均未见明显异常。猫眼草黄酮类粗提物在1 g/kg及环磷酰胺在30mg/kg剂量下连续给药19天可使荷Lewis肺癌小鼠体重明显减轻(p< 0.01),提示猫眼草黄酮类粗提物在高剂量下可能对小鼠具有一定的体重增长抑制作用。4、猫眼草中黄酮类物质的活性追踪及结构鉴定采用活性追踪的方法进一步对猫眼草黄酮粗提物中各馏分的抗肿瘤活性进行了研究,并针对黄酮类化合物特征紫外,对猫眼草50%乙醇提取物中的主要黄酮类结构进行分离纯化和结构鉴定。结果表明,从该提取物中分离出两个黄酮单体为quercetin-3-O-β-D-glucuronide(1)和kaempferol 3-O-β-d-glucuronic acid(2) ;提取物中的抗肿瘤活性成分为其中的脂溶性部分,但从脂溶性成分中获取的两个单体1和2均不具有细胞增殖抑制活性。该研究从猫眼草黄酮粗提物中分离出了两个黄酮类结构单体,并确定了该提取物中的抗肿瘤活性部位。5、利用激酶筛选及相关技术平台,在分子及细胞水平确定猫眼草活性部位的抗肿瘤作用利用激酶筛选平台及体外细胞相关技术,结合Western Blot手段,研究了猫眼草活性部位抗肿瘤作用的机制。结果发现,猫眼草活性部位可特异性抑制EGFR的磷酸化,且其IC50值为0.32μg/ml。采用人脐静脉微血管内皮细胞形成管腔模拟血管新生实验发现,猫眼草活性成分可明显抑制管腔形成,提示其具有抑制血管新生的作用。进一步采用Transwell观察了猫眼草活性成分对细胞迁移的影响。结果表明,猫眼草活性成分可明显抑制肿瘤细胞的迁移活动。相关信号通路研究表明,猫眼草活性成分可明显抑制EGFR的磷酸化,下调相关的AKT和ERK信号。本研究通过提取分离制备了猫眼草的活性部位,确定了该活性部位具有明显的抗肿瘤作用,并明确了其抗肿瘤作用的机制,为中药猫眼草的深入开发利用提供了理论依据。
吴志伟[3]2014年在《全反式维甲酸联合顺铂对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤影响及机制的研究》文中指出肺癌发病率逐年增高，死亡率居高不下是每个呼吸科医生面临的严峻问题。全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）是天然维生素A代谢产物,无论是在正常细胞还是在肿瘤细胞的增殖、生长、分化中发挥重要调节作用。自ATRA用于治疗急性早幼粒细胞白血病，取得了令人鼓舞的临床效果。全反式维甲酸不仅能维持正常上皮细胞的生长和分化，而且能对肿瘤细胞终末期进行诱导分化，逆转其恶型性。全反式维甲酸可以通过抑制肿瘤细胞的周期因素及相关蛋白的调节使肿瘤细胞周期的进程抑制，结果加快了肿瘤细胞的分化，使肿瘤细胞的增殖受到抑制，导致肿瘤细胞的凋亡[1]。近年来已经研究证实了ATRA在多种肿瘤如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤以及皮肤癌等方面取得了可喜的治疗潜力。研究表明全反式维甲酸能促进U87胶质瘤干细胞分化，增加其子代细胞中GFAP阳性细胞的比率，并能对细胞的增殖起到明显的抑制作用[2]。铂类联合第三代化疗药物如紫杉醇、吉西他滨、伊立替康的化疗方案是非小细胞肺癌的标准一线方案，研究称铂类药物与其他药物联合化疗可显著控制患者症状，延长中位生存期，改善其生活质量。治疗肿瘤的方法有许多种，诱导肿瘤细胞的凋亡是其中重要的途径之一，bcl-2家族是控制凋亡的重要基因，而bcl-2和bax基因是属于bcl-2家族的，bcl-2在大多数细胞中使细胞凋亡受到抑制，而bax与其功能相反，促进细胞的凋亡[3].研究表明应用ATRA和顺铂处理A549细胞后，ATRA主要作用在G1期和S期，G1期制造产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，S期是细胞DNA合成期，G1和S期比例减少，导致A549细胞周期阻滞，DNA合成发生障碍，进而抑制肺癌细胞的生长、代谢、增殖等过程，最后导致细胞凋亡[4]。但全反式维甲酸和顺铂联合作用于裸鼠肺腺癌A549细胞移植瘤的报道很少，而且全反式维甲酸和顺铂对肺癌细胞凋亡因子bax和bcl-2的作用，这些都值得去探索和研究。本实验拟通过ATRA联合顺铂（cisplatin,DDP）作用于肺腺癌A549细胞株的裸鼠移植瘤，探讨其对肺癌细胞增殖、凋亡的影响，同时检测不同药物干预后A549细胞移植瘤bcl-2及bax基因的表达情况，为全反式维甲酸应用于肺癌治疗提供理论依据。目的：通过动物体内实验，探讨全反式维甲酸联合顺铂对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的作用及相关机制的研究。方法：1．细胞培养：培养肺癌A549细胞。2．建立肺腺癌A549细胞移植瘤动物模型，注意观察裸鼠的精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况，并称体重。3．动物分组与给药，裸鼠接种A549细胞后成瘤裸鼠随机分为4组，每组6只。随机分为对照组、ATRA组、顺铂组、ATRA+顺铂组，共给药6次。观察裸鼠一般情况。4．采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色法观察化学药物治疗后裸鼠移植瘤组织的病理学变化特点。5．采用免疫组织化学方法检测化学药物治疗后裸鼠移植瘤组织蛋白bcl-2蛋白和bax蛋白的表达情况.脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TdT-Mediated dUTP-Biotin Nick End Labeling，TUNEL）染色法观察移植瘤细胞凋亡情况,细胞核被染为棕黄色，使用光学显微镜，在高倍镜下任选10个视野，每个视野计数100个细胞，得出凋亡指数。凋亡指数为毎计数为1000个肿瘤细胞中凋亡细胞所占的比例.结果：1．接种后6-7d，肉眼可见实体瘤，为不规则形状。移植瘤成瘤率：接种7-15d后，共28只裸鼠，有24只裸鼠背侧形成肿瘤，接种成瘤率为85.7%。随着时间的推移，对照组裸鼠进食及活动明显减少，肿瘤生长速度较快；ATRA＋顺铂组进食、活动基本正常，肿瘤生长较缓慢；ATRA组和顺铂组裸鼠状态及肿瘤生长情况介于对照组和联合用药组之间。2．与对照组比较，ATRA组、顺铂组以及ATRA+顺铂组移植瘤体积、重量明显下降，其中，ATRA+顺铂组下降幅度最大。方差分析比较显示，ATRA组、顺铂组和联合用药组肿瘤生长较对照组明显缓慢（P<0.05）;而联合用药组抑瘤率较ATRA组、顺铂组明显升高（P<0.05）。3．ATRA组、顺铂组及ATRA+顺铂组移植瘤细胞坏死、凋亡较对照组显著增加；ATRA+顺铂组细胞坏死、凋亡明显多于ATRA组与顺铂组。4．免疫组化检测全反式维甲酸和顺铂作用于裸鼠移植瘤组织，促进bax基因表达上调，抑制bcl-2基因表达下调，配对资料的关联性分析得出，肺癌组织中bcl-2基因和bax基因的表达存在关联性，且为负相关；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色法观察移植瘤细胞凋亡情况,通过直相关分析得出，bax与凋亡指数呈正相关（相关系数为r=0.578,p=0.000）;bcl-2与凋亡指数呈负相关(相关系数r=-0.772,p=0.000)，bcl-2基因抑制细胞的凋亡，bax基因促进细胞的凋亡。结论：1．全反式维甲酸与顺铂均能抑制肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长，促进移植瘤细胞凋亡，二者联合作用效果更明显。2．全反式维甲酸和顺铂作用于裸鼠移植瘤均能抑制肿瘤的生长，可能促进bax基因表达上调和抑制bcl-2基因表达下调，bcl-2基因抑制细胞的凋亡，bax基因促进细胞的凋亡。
佚名[4]2004年在《肺癌》文中研究指明18FDG PET在肺部占位性病变诊疗工作中的应用唐继鸣陈刚贲晓松杨学宁肖朴谢亮作者单位:广东省人民医院胸外科目的:评价18FDG PET在诊疗肺部占位性病变工作中的价值。方法:回顾性分析130例有病理诊断的住院病人的PET结果。结果:PET在肺部占位性病变恶性肿瘤诊断的灵敏度为88.2%,特异性为50%,准确率为80%;47例经手术病理验证,PET诊断为肺癌的患者,其对纵隔淋巴结转移诊断的灵敏度、特异性、准确率分别为69.2%、82.4%、78.7%。88例确诊为肺癌患者,经PET检查发现其中37例分期上调,从而改变
汤宇[5]2008年在《大黄当归木香的不同配伍抑瘤作用的药效学研究》文中认为目的观察大黄、当归、木香的不同配伍组合对Lewis肺癌、肉瘤-S180、艾氏腹水癌荷瘤小鼠抑瘤作用的影响,探讨大黄、当归、木香的最佳配伍关系。方法制备Lewis、肉瘤-S180、艾氏腹水癌荷瘤小鼠动物模型,随机分为模型组,大黄组,大黄当归组,大黄木香组,大黄当归木香组;通过测定荷瘤小鼠的瘤重、计算抑瘤率观察不同配伍组对肿瘤生长的影响。结果与模型组比较,大黄当归组对Lewis肺癌、肉瘤- S180、艾氏腹水癌抑瘤率分别达到78.52%、44.57%、64.95%。结论大黄当归组具有很好的抑瘤作用(P<0.05)。
黄暨生[6]2016年在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中认为恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段(如手术治疗、放疗、化疗等)后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能(GJIC)的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯(GJIC)功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP(tk+)细胞混合A375(tk-)细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果(一)人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。(二)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。(三)木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显著的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高(P<0.05),说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显著提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能(即缝隙连接机制)发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
张倩云, 任雯, 李潇, 祁赞梅[7]2011年在《组蛋白乙酰化影响肿瘤细胞多药耐药性的研究进展》文中进行了进一步梳理在临床治疗中,肿瘤细胞的多药耐药性(multi-drug resistance,MDR)已经成为化疗失败的重要原因之一。肿瘤细胞中组蛋白乙酰化异常与MDR的产生有关,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacety-lases inhibitor,HDACi)能够抑制肿瘤生长,避免肿瘤产生耐药性,已经作为一种新型的抗肿瘤药物应用于临床。HDACi可能通过阻滞细胞周期、促进细胞分化、诱导细胞凋亡等多种生物学效应发挥其抗肿瘤的作用,HDACi与其他药物联合应用在抗肿瘤方面也展现了良好的应用前景。
于蕾[8]2010年在《野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究》文中指出野西瓜(Capparis spinosa L)为山柑科山柑属植物,又称刺山柑、老鼠瓜、槌果藤等,味辛苦,性温,具有祛风除湿、止瘀消肿、止痛活血之功效。文献报道和前期实验显示,野西瓜具有抗肿瘤作用,且其活性成分为其生物碱类成分。本文对野西瓜生物碱的抗肿瘤活性组分进行了筛选,找出其敏感肿瘤细胞株为人胃癌细胞株SGC-7901,得到具有较强抑制肿瘤细胞增殖的组分——野西瓜极性生物碱A10组分,并应用HPLC法和UV法测定其含量。在此基础上,研究了野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞的细胞毒作用,通过MTT实验、SRB实验和集落形成率实验发现野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901具有生长抑制作用；然后利用凋亡形态学方法即荧光显微镜法和投射电镜法对SGC-7901凋亡形态进行定性研究；经PI单染法和AnnexinV-FITC/PI双染法,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定了野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡率和周期的影响；然后对野西瓜极性生物碱A10组分所诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的关键事件进行研究,包括MPTP孔开放程度、膜电位丧失、Cyt-c释放、Caspase-9及Caspase-3激活；在确定了其凋亡的线粒体途径后,又对线粒体凋亡调控因子如活性氧水平、Ca2+浓度进行检测,判断ROS积聚和钙超载是否参与野西瓜极性生物碱A10组分所诱导线粒体凋亡通路的调控。最后,对线粒体凋亡通路调控基因Bcl-2和Bax在蛋白表达水平和mRNA基因转录水平上分别利用Vestern Blot法、流式细胞术和RT-PCR法进行检测,以期揭示野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡的线粒体通路。1野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分的研究1.1野西瓜总生物碱含量测定的研究目的：测定野西瓜中盐酸水苏碱含量和总生物碱的含量。方法：HPLC方法和UV方法。结果：应用HPLC测定野西瓜中盐酸水苏碱的含量,得到盐酸水苏碱线性回归方程为Y=100.58X-9.3751(r=0.9999),说明其在1.5-30μg范围内呈良好线性关系,测得野西瓜中盐酸水苏碱的含量为8.2257 mg·g-’。同时以雷氏铵盐剩余比色法测定野西瓜中总生物碱(以盐酸水苏碱计)的含量,得到盐酸水苏碱线性回归方程分别为Y=0.621 7X+0.0108(r=0.9986),说明在其0.060-0.301 mg·mL-1范围内线性关系良好,测得野西瓜总生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为104.7749 mg·g-1。通过方法学考察证实两个含量测定方法准确可靠。结论：HPLC法测得盐酸水苏碱的含量为8.2257 mg·g-1,雷氏铵盐剩余比色法(以盐酸水苏碱计)测定野西瓜中总生物碱的含量为104.7749 mg·g-1。1.2野西瓜生物碱不同极性部位抗肿瘤活性的研究目的：寻找野西瓜抗肿瘤的活性部位。方法：采用渗漉法对野西瓜果实进行初提取,然后将渗漉液通过阳离子交换树脂,待树脂床饱和后,对树脂进行碱化,干燥,再进一步对树脂床进行溶剂分级萃取。萃取顺序为氯仿、正丁醇、70%乙醇萃取,得到三个部位氯仿层、正丁醇层和70%乙醇层。采用MTT法对三个部位进行活性筛选。结果：野西瓜生物碱的70%乙醇极性部位有明显的抗肿瘤作用,IC50为33.437μg·mL-1,为野西瓜生物碱抑制SGC-7901细胞的活性部位。野西瓜生物碱的氯仿萃取部位、正丁醇萃取部位对SGC-7901细胞也具有一定的抑制作用,但作用不如70%乙醇极性部位部位明显。因此野西瓜生物碱的70%乙醇极性部位初步确定为野西瓜生物碱抑制SGC-7901细胞的抗肿瘤活性部位。结论：人胃癌SGC-7901细胞是野西瓜总生物碱的敏感细胞株,野西瓜生物碱70%乙醇层是其抗肿瘤的活性部位。1.3野西瓜生物碱活性部位不同组分抗肿瘤活性的研究目的：对野西瓜生物碱抗肿瘤活性部位——70%乙醇极性部位进行进一步分离,继续采用MTT方法进行活性组分的追踪。方法：柱层析和MTT法。结果：采用硅胶柱对野西瓜生物碱抗肿瘤活性部位——70%乙醇部位进行进一步的分离,用氯仿-甲醇梯度洗脱,TCL跟踪合并,得到A1～A12共12个组分,经改良碘化铋钾显色实验证实A1-A5、A11和A12组分中不含有生物碱成分,而A6～A10组分含有生物碱成分。经MTT实验筛选A6～A10组分的抗肿瘤活性。结果显示,A6～A10组分对SGC-7901细胞增殖均具有一定的抑制作用,其中A10组分的抑制作用最强,IC50为31.529μg·mL-1。称之为野西瓜极性生物碱A10组分。结论：A10组分是野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分,称之为野西瓜极性生物碱A10组分。目的：测定野西瓜极性生物碱A10组分的含量。方法：HPLC法和UV法。结果：应用HPLC测定野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量,得到盐酸水苏碱线性回归方程为Y=1004.2X-5.3806(r=0.9999),结果表明：盐酸水苏碱在3-30μg范围内呈良好线性关系。测得野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量为367.7296 mg·g-1,方法学考察证明该含量测定方法准确可靠。采用本部分实验一所述UV法测得野西瓜极性生物碱A10组分中生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为784.2096 mg·g-1。结论：HPLC法测得野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量为367.7296 mg·g-1。UV法测得野西瓜极性生物碱A10组分中生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为784.2096 mg·g-1。2野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞的生长抑制和诱导凋亡作用2.1野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞生长的抑制作用目的：对野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞生长的抑制作用进行研究。方法:MTT法、SRB法和肿瘤细胞克隆原形成法。结果：MTT实验得出野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞IC50为31.529μg·mL-1。从SRB实验结果可以看出,低浓度的野西瓜极性生物碱A10组分通过抑制细胞生长而起到抗肿瘤作用,而高浓度时则主要通过杀死肿瘤细胞起到抗肿瘤作用,经计算GI50为31.785μg·mL-1,LC50为37.210μg·mL-1,TGI为45.864 gg·mL-1。肿瘤细胞克隆原实验结果显示,野西瓜极性生物碱A10组分可以剂量依赖性抑制SGC-7901细胞集落的形成,其IC50为37.47μg·mL-1。结论：三个实验结果基本一致,更加客观的说明野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞具有生长抑制作用。根据以上结果,选择野西瓜极性生物碱A10组分为后续药理实验的受试药,且低、中、高剂量分别为15、30、60μg·mL-1。2.2野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡的影响目的：观察野西瓜极性生物碱A10组分作用后SGC-7901细胞形态学的改变和细胞凋亡率的测定。方法：荧光显微镜观察法、透射电镜观察法、激光共聚焦显微镜、PI单染法和Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪进行检测。结果：荧光显微镜下、透射电镜和激光共聚焦显微镜下均可观察到典型的细胞凋亡形态,SGC-7901细胞随着给药剂量的增大,凋亡细胞特征性形态越明显。SGC-7901细胞经不同浓度的野西瓜极性生物碱A10组分作用48 h后,流式细胞仪直方图上出现亚二倍体峰,表明肿瘤细胞发生晚期凋亡。不同质量浓度的野西瓜极性生物碱A10组分作用24 h后,与空白对照组比较,各给药组SGC-7901细胞均发生不同程度的早期凋亡,且出现凋亡的比例逐渐增加。结论：野西瓜极性生物碱A10组分可以诱导SGC-7901细胞发生凋亡。3野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901凋亡线粒体通路的研究3.1野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡线粒体通路关键事件的影响目的：研究野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡线粒体通路关键事件的影响,判断是否启动了线粒体凋亡通路。方法：Reagent A染色、罗丹明123染色、Western Blot法和酶标仪法。结果：在经过野西瓜极性生物碱A10组分作用后,SGC-7901细胞膜孔道不同程度的开放,膜电位发生了明显下降,并导致Cyt-c由线粒体释放至细胞浆,活化Caspase-9并启动Caspase级联反应,激活下游的Caspase-3从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。结论：野西瓜极性生物碱A10组分诱导肿瘤细胞凋亡是由于启动了线粒体凋亡途径。3.2野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞凋亡线粒体通路调控因子的影响目的：探讨ROS和钙超载是否参与了野西瓜极性生物碱A10组分诱导的细胞凋亡过程。阐明Bcl-2和Bax基因对野西瓜极性生物碱A10组分所诱导细胞凋亡线粒体通路的调控作用。方法：DCFH-DA染色、Fluo-3/AM探针染色、Western Blot法、流式细胞术和RT-PCR法。结果：SGC-7901细胞内活性氧水平随着野西瓜极性生物碱A10组分质量浓度的升高而升高,细胞内钙离子浓度也相应的增大。给药组Bcl-2蛋白表达水平与对照组相比有所下降,而Bax蛋白表达量随之增加。野西瓜极性生物碱A10组分能够降低Bcl-2基因的mRNA表达,上调Bax基因的mRNA表达,并且具有一定的剂量依赖性。结论：经野西瓜极性生物碱A10组分作用后,活性氧的聚集和钙超载激活了细胞凋亡线粒体机制。野西瓜极性生物碱A10组分通过调节基因的转录水平下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达来调控线粒体凋亡通本论文通过HPLC法测得野西瓜中盐酸水苏碱含量为8.2257 mg·g-1,雷氏铵盐剩余比色法(以盐酸水苏碱计)测定野西瓜中总生物碱含量为104.7749mg·g-1。MTT法筛选出人胃癌SGC-7901细胞是野西瓜生物碱的敏感细胞株,野西瓜生物碱70%乙醇层是其抗肿瘤的活性部位,A10组分为野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分,称之为野西瓜极性生物碱A10组分。并经HPLC法测得野西瓜极性生物碱A10组分中盐酸水苏碱含量为367.7296 mg·g-1。UV法测得野西瓜极性生物碱A10组分中生物碱含量(以盐酸水苏碱计)为784.2096 mg·g-1。实验发现,野西瓜极性生物碱A10组分对SGC-7901细胞生长增殖具有抑制作用,并通过诱导细胞凋亡的方式发挥其抗肿瘤作用。野西瓜极性生物碱A10组分迫使MPTP孔开放,促使线粒体膜电位的崩溃,并促进Cyt-c的释放,触动Caspase-9,启动Caspase级联反应,并最终激活了凋亡执行分子Caspase-3而诱导SGC-7901细胞凋亡。野西瓜极性生物碱A10组分通过钙稳态失衡,ROS积聚来调控SGC-7901细胞线粒体凋亡。野西瓜极性生物碱A10组分通过调节基因的转录水平下调Bcl-2蛋白表达,上调胞浆内Bax蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax比例,进而调控凋亡的线粒体通路。本研究的创新点1.采用活性跟踪的方法进行野西瓜生物碱抗肿瘤活性组分的筛选2.从定性和定量两个方面揭示野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡。3.首次发现野西瓜极性生物碱A10组分通过启动线粒体通路诱导SGC-7901细胞凋亡。
参考文献：
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[8]. 野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究[D]. 于蕾. 北京中医药大学. 2010
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