马雪梅[1]1997年在《神经营养相关因子基因的克隆、表达及蛋白的纯化研究》文中研究表明神经营养因子是神经元在胚胎发育期发育或熟和存活所必需的一些分子。由于可能作为一种有效的药物用于治疗各类神经退行性疾病，对它的研究具有重要的理论和应用价值。存在两种类型的神经营养因子：一美为与神经生长因子(NGF)有同源性的神经营养因子，它们构成神经生长因子家族，如NGF，BDNF，NT-3等；另一类为无此同源性的神经营养因子，如GDNF，CNTF等。最近发现IL-6对促进体内损伤神经的再生也有重要作用。 由于这些因子在体内含量甚微，利用基因工程技术进行批量生产，将大大推进基础研究的进程，并为早日进入临床应用奠定基础。 本论文介绍了GDNF、BDNF和IL-6的如下工作。 第一．相关基因的克隆及表达载体的构建。通过PCR的方法分别克隆了GDNF、BDNF和IL-6成熟肽的基因，GDNF、BDNF序列与文献报道相同，IL-6基因与GenBank的序列相比有10个位点发生了突变，但对氨基酸序列没有影响，进一步证明氨基酸序列的保守性对蛋白维持正常功能的重要性。 分别将GDNF、BDNF、IL-6基因连接到E．coli高效表达载体pET30a或pET16。并构建了带有硫氧还蛋白基因(trxA)的表达载体pETR，将GDNF基因与其中的trxA基因相连，构建了表达融合蛋白Thio-GDNF的表达载体。 第二．高效表达基因工程菌株的构建。通过培养条件优化使IL-6、BDNF和GDNF基因在大肠杆菌中均获得高效表达，表达量分别占菌体总蛋白的52.6％、16.3％和16％。Thio-GDNF融合蛋白的表达量则占菌体总蛋白的50.4％，与天然蛋白16％的表达量相比有了大幅度提高，表明我们自己构建的表达载体在高效表达外源基因方面具有较大的优越性。 在工程菌诱导表达过程中，首次发现了二次生长现象，这一发现对进行外源基因的高效表达有重要意义。 第三．表达蛋白的纯化及生物活性测定。以pET16-GDNF的表达为例，用金属螯合亲和层析的方法得到具有较高纯度和活性rhGDNF。用鸡胚背根神经节的测定活性为16-30ng／ml。 在复性过程中，除了用常规GDNF氧化还原系统进行GDNF蛋白的复性，还用自己表达的并初步纯化的硫氧还蛋白进行了尝试，得到了较好的结果。
饶刚[2]2003年在《大熊猫和朱鹮神经营养因子基因家族的克隆、表达及活性鉴定》文中指出大熊猫和朱鹮是世界濒危野生兽类及鸟类的旗舰物种。多年来，由于猎杀和栖息地遭到严重破坏等原因，种群已濒临灭绝的边缘。为了拯救此二物种，我国政府主管部门相继制定了人工易地保护的物种保护策略，以期通过人工圈养条件下的自然繁殖和人工繁殖，达到增加种群的数量，促进野生种群恢复之目的。然而，在大熊猫种群中，癫痫的发病率占其总发病率的8％左右，且有3/4的患者为成年及老年雄兽，因此，多年来癫痫病已成为大熊猫非正常死亡的主要疾病之一。与此同时，在朱鹮的圈养种群中，由视神经病变导致的先天性弱视患者的发病率达到了3～5％，此类疾病已严重地威胁着朱鹮的生存。由于癫痫和视神经病变类疾病均属于遗传性疾病，因此，利用分子生物学技术，对因癫痫和遗传性弱视症导致的神经元损伤具有保护及再生作用，以及视神经通路的发育、分化和受损视觉通路具有修复作用的相关基因，开展克隆、表达和活性鉴定之研究，将为通过基因工程技术实现其疾病治疗之目标奠定基础。这对于促进大熊猫和朱鹮圈养种群之现有疾病治疗体系层次的提高，改善种群现有的健康状况，具有重要的理论意义和实用价值。 神经营养因子(Neurotrophic factors，NTFs)是一类由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的能促进中枢和外周神经分化、生长和存活的活性蛋白质。该蛋白在神经系统的发育和正常生理功能的维持等方面起着重要作用。目前，已知的神经营养因子有三个家族：神经生长因子(Neurotrophins，NTs)家族、胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)家族和睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)家族。研究表明，神经营养因子对癫痫造成的神经元损伤具有保护及再生作用，而对于视神经通路的发育和分化，以及受损视觉通路的修复也 饶刚：大熊独和朱赐神经营养因子基因家族的克隆、表达及活性鉴定起到关键作用。 本论文经引物设计与合成后，利用PCR技术分别自大熊猫和朱鹤的基因组中克隆了GDNF基因和NTs基因家族各成员成熟肽的完整编码序列。通过序列分析发现，这些基因在进化上是保守的。继后，将各成熟肽完整编码序列克隆至pGEX—4T—3表达载体，并经IPTG 诱导进行原核生物表达，获得了大熊猫神经生长因子（NGF）和神经营养素4（NT－4），以及朱鹤脑源性神经营养因子（BDNF）及此二动物GDNF的重组表达蛋白。利用SDS－PAGE、GST酶活性及Western 杂交等技术初步证明了所获得的重组表达蛋白为GDNF基因和NTS基因家族各成员之编码蛋白。最后，对重组表达蛋白经Glutathlone Sepharose 4B Microspin Column亲和纯化后，进行大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 （P 2）神经营养因子的活性鉴定，发现其能够诱导神经细胞分化产生突触，即具有预期的生物学活性，表明所获表达蛋白为大熊猫NT．4及朱鹦BDNF基因所表达的重组蛋白质。 目前，虽然对人之癫痛与视神经病变类疾病的基因治疗尚处于探索阶段，而动物在此领域的工作尚未起步，但本文所完成的大熊猫和朱鹤神经营养因子（NTFs）基因家族的克隆、表达及活性鉴定工作，无疑为后续的深入研究奠定了基础。 此外，利用神经生长因子NT－3及NT．4基因的保守性，结合线粒体DNA上的序列和其它传统分类学资料，对大熊猫及小熊猫的分类地位进行了探讨，认为应将小熊猫单独列为一科，大熊猫与小熊猫关系较远，应划入熊科。
曹雅男[3]2008年在《微生物来源36家族α-半乳糖苷酶的基因克隆与性质研究》文中认为α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶,是一种外切糖苷酶,催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面有着广泛的应用。在饲料工业中,α-半乳糖苷酶添加剂是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖类抗营养因子的首选方法。饲用α-半乳糖苷酶的生产目前尚未形成产业化,其中,性质优良的α-半乳糖苷酶的发掘是一个亟待解决的关键问题。本研究通过对菌种新颖性和产酶能力的评估,确定了根霉F78(Rhizopus sp. F78)、赤霉F75(Gibberella sp. F75)、链霉菌(Streptomyces sp.)S9和S27及耶尔森氏菌(Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001)为本实验的研究对象。根霉和赤霉都是重要的工业菌种,但未见这2个属中α-半乳糖苷酶基因克隆与表达的相关报道。链霉菌S9和S27是分离自火焰山的2个菌株,生长条件特殊。利用生物信息学的方法,对微生物来源糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶序列进行比对和分析,总结该家族的酶蛋白在分子量大小上的差异,进行分类、分析和简并引物设计,通过简并PCR扩增得到来源于研究菌株中编码α-半乳糖苷酶的基因片断,再结合不同的基因克隆方法最终获得这些基因的全序列。因此,基于这对保守基序设计的简并引物可以有效的扩增到糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。对5个实验菌株中获得的α-半乳糖苷酶基因进行BLAST比对,分析其编码的氨基酸序列与已报道的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列的相似性。结果表明来源于根霉F78的α-半乳糖苷酶Aga-F78最高相似性为45%,赤霉F75的α-半乳糖苷酶Aga-F75最高相似性为69%,链霉菌S9的α-半乳糖苷酶Aga-S9最高相似性为36%,链霉菌S27的α-半乳糖苷酶Aga-S27最高相似性为55%,耶尔森氏菌的α-半乳糖苷酶Aga-Y最高相似性为57%,而5个酶相互之间的相似性介于25-40%。因此,这5个α-半乳糖苷酶基因均具有很高的新颖性。5个α-半乳糖苷酶基因均在大肠杆菌中异源表达,并验证其基因功能,酶纯化后进行了详细的酶学性质研究。5个α-半乳糖苷酶的性质比较表明,真菌来源的α-半乳糖苷酶最适pH值偏酸性,在4.0-5.0间,而细菌来源的则在7.0-7.5的中性范围内;温度特性上,真菌来源的α-半乳糖苷酶最适温度在50-60℃,细菌来源的在35-40℃,Aga-F75-H、Aga-F78-H、Aga-S27-H热稳定性较好;Aga-F75-H和Aga-F78-H对多种蛋白酶有良好的抗性;Aga-Y-H具有一定适冷酶特性,这在其它α-半乳糖苷酶的研究中还未见报道。因此,获得的这些性质各异的α-半乳糖苷酶,不仅具有在不同领域的实际应用价值,也为研究其结构和功能提供了良好的材料。饲料添加剂中,α-半乳糖苷酶常需要与蛋白酶共同作用,以提高饲料中营养物的利用率。另外,酶蛋白对胃肠道内蛋白酶的抗性,可以延长其作用时间,提高其利用效率。所获得的α-半乳糖苷酶与胰蛋白酶共作用降解豆粕的试验显示,其中4种酶单独作用时都可较大幅度提高半乳糖的含量。Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H与胰蛋白酶共作用不影响α-半乳糖苷酶的降解能力。对于Aga-F75-H,单独作用时使半乳糖的含量增加了82.42倍,添加胰蛋白酶后降解量又进一步增加了约36%。这些酶学性质表明Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H,特别是Aga-F75-H具有很好的饲料工业应用前景。
阳燕[4]2007年在《人神经营养素-3成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性检测》文中认为神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)作为促进神经细胞存活、生长、分化的一类分泌型蛋白，一直被人们所关注，主要包括神经营养素家族、胶质细胞源性神经营养因子家族等几大类三十余种蛋白质。神经营养因子通过与其受体结合，激活细胞内信号转导途径，它们具有多种生物学活性，对中枢神经系统中的海马胆碱能神经元、黑质多巴胺能神经元、蓝斑去甲肾上腺能神经元、纹状体GABA能神经元以及外周神经系统中的运动神经元、感觉神经元、交感神经元等多种神经元均有作用，对非神经系统也有一定影响。研究表明，神经营养因子不仅可以减少神经变性，阻止疾病进程，而且还具有刺激轴突生长、促进其再生的功能，极有可能成为未来治疗阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓损伤和外周神经病变等神经系统疾病的重要手段。神经营养素-3(neurotrophin-3)是神经营养素家族(neurotrophin family，NTs)成员之一，其mRNA在中枢和外周神经系统中广泛表达，两种受体分别为低亲和力受体p75~(NTR)和高亲和力受体TrkB，促进神经元生长、发育、分化和存活，对损伤神经元的修复与再生也有作用。本实验以人胎脑RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增了人神经营养素-3 cDNA，并将其插入的质粒pGEM-T中，构建了克隆载体pGEM-T-hNT-3。应用酶切和PCR方法对阳性重组子进行了鉴定，并测定了阳性重组子的序列。结果表明，所克隆的入神经营养素-3 cDNA核苷酸序列为35bp，与已发表序列(GenBank MW002527)同源性为99.7％，其编码119个氨基酸。利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，从克隆载体pGEM-T-hNT-3中得到人神经营养素-3cDNA，并将其与线性质粒pGEX-6p-1相连接，构建了人神经营养素-3原核表达载体pGEX-6p-1-hNT-3。将经酶切和PCR鉴定的阳性重组子转化到宿主菌BL21(DE_3)PlysS中，用IPTG作为诱导剂，以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察重组人神经营养素-3融合蛋白在阳性菌的表达情况，并摸索其最佳诱导条件。实验发现，重组人神经营养素-3融合蛋白在37℃和28℃诱导培养时均主要以包涵体形式表达，且在IPTG浓度为1.0m mol／L的条件下，37℃诱导4hr时，重组人神经营养素-3融合蛋白表达量最大；阳性菌诱导表达的融合蛋白分子量分别约为39.6kD，其中谷胱甘肽S-转移酶标签蛋白分子量约为26 kD，人神经营养素-3分子量约为13.6 kD。实验过程中对表达的重组人神经营养素-3融合蛋白包涵体进行了裂解，并采用谷胱甘肽氧化还原系统复性了溶解后的重组人神经营养素-3融合蛋白。用GS4B树脂纯化了重组人神经营养素-3，并对纯化蛋白进行了浓缩。为了检测所获得的重组人神经营养素-3的生物学活性，进行了体外培养神经元的实验。实验选用了新生24小时内小鼠脑组织，用无血清培养基Neurobasal联合B27添加剂纯化培养神经元。结果表明重组人神经营养素-3具有促进体外培养的神经元突触生长，促进神经元的存活的作用。本实验在原核表达系统BL21(DE_3)PlysS成功表达了人神经营养素-3，并对重组人神经营养素-3融合蛋白进行了功能分析，为进一步研究它的生物学功能提供了良好的条件，并为研究其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了基础。
彭玉颖[5]2007年在《大鼠胶质细胞源性神经营养因子克隆及表达的研究》文中认为胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor GDNF)是1993年被发现的对多巴胺能神经元有特异性营养作用的一种神经营养因子，结构显示它是TGF-β超家族中的一个新的成员。自GDNF被发现以后，众多学者对其结构、分布、功能与作用进行了大量的研究，并取得了相当有意义的成果，同时GDNF在治疗神经系统疾病方面被广泛研究，包括对帕金森氏病(PD)、脊髓侧索硬化症(ALS)及其他神经变性疾病等领域的研究，其中PD的病理基础已经明确，是由于选择性多巴胺能神经元丧失导致多巴胺缺乏所致，目前认为，基因治疗可能是实现治疗PD这一目标的最佳途径，而对PD等疾病的治疗手段包括药物治疗和各种外科手术、脑组织移植等均只限于暂时的症状改善，不能从根本上延缓或阻止其病程进展，理想的治疗方法除了要纠正其脑内DA含量的不足，还要保护残存的DA能神经元。迄今为止，国内外的基因治疗研究探索主要集中于两个方向，一是通过给予各种神经营养因子或抗凋亡分子基因，研究其对DA能神经元的保护作用；二是通过给予酪氨酸羟化酶(TH)基因，提高DA的合成。国内外研究表明了GDNF是最强有力的保护因子，GDNF基因的有效表达可以减缓、阻止甚至逆转DA能神经元的退行性病变过程，为此我们克隆了大鼠GDNF全长基因，主要采用分子克隆、细胞培养和动物肌肉表达等研究方法，将GDNF基因分别构建入原核表达载体pET32a和真核表达载体pEGFP-C1，通过IPTG诱导法和离体细胞转染法研究证实其具有明确的转基因生物活性后，再将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF注射到小鼠后肢股四头肌内，初步了解其体内表达情况，以此寻找基因治疗的最佳途径。主要研究方法和结果如下：1．从2日内大乳鼠脑组织中提取总RNA，参照分子克隆指南稍作修改，合成cDNA第1、2链，加入引物通过PCR扩增目的基因，得到636bp的目的片段后，克隆到pMD18-T载体中，得到重组pMD18-T-GDNF。2．将GDNF克隆到pGEM-T载体中，得到重组pGEM-T-GDNF；将重组质粒pGEM-T-GDNF、pET32a原核表达载体及pEGFP-C1真核表达载体进行BamHI、XhoI双酶切，构建重组表达质粒，然后对重组表达质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定并测序验证。3．将鉴定正确的原核重组表达质粒转入BL21(DE3)中进行表达，并采用SDS-PAGE、Western-blot等方法对表达产物进行鉴定。4．以阳离子聚合物法将真核重组表达质粒转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达，通过RT-PCR、免疫细胞化学技术及荧光显微镜观察来确定转染效率。5．将pEGFP-GDNF注射入BABL／c小鼠后肢肌肉内，通过荧光显微镜和免疫组织化学方法观察体内表达情况。结果：①GDNF基因的克隆从新生大鼠脑组织中成功提取总RNA反转录cDNA后，PCR扩增的GDNF目的基因为636bp，与克隆载体连接构建克隆重组质粒，经酶切鉴定得到一条与目的基因大小一致的条带和一条载体带，测序后发现，目的基因序列与Genebank上发表的GDNF基因序列完全一致。②GDNF基因的原核表达为了获得GDNF基因的表达产物，成功将克隆质粒亚克隆至原核表达载体pET32a中，重组原核表达质粒经IPTG诱导后在蛋白电泳图谱可以看到明显的目的蛋白条带，Western-blot的特异条带也验证了这一点。③GDNF基因的真核表达成功将克隆质粒亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中，将真核重组表达质粒转染CHO细胞后，经RT-PCR鉴定和荧光显微镜观察发现，细胞液经扩增得到目的条带，在荧光显微镜下经蓝光激发，可以观察到CHO细胞胞浆内呈现绿色荧光，将小鼠后肢肌肉的石蜡切片进行胰蛋白酶抗原修复后，在荧光显微镜下观察到散在的绿色荧光，免疫组化染色可以看到肌纤维细胞周围有黄色的斑点，以上结果提示EGFP基因及GDNF基因的进一步表达，说明目的基因片段已成功表达。结论：①本研究利用分子生物学技术，成功的克隆了大鼠GDNF基因，测序结果证明与Genebank发表的序列完全一致。②将克隆至pGEM-T载体中的GDNF基因亚克隆至原核表达载体pET32a中，并在E．coliBL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析，表明目的基因获得了表达。③将重组质粒pGEM-T-GDNF中的GDNF基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中，成功的构建出真核重组表达质粒pEGFP-GDNF，以阳离子聚合物介导法将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF转染至CHO细胞中，通过RT-PCR检测法、荧光检测法和免疫细胞化学检测法证实GDNF基因在哺乳动物细胞中获得了表达。再将真核重组表达质粒pEGFP-GDNF注入BALB／c小鼠后肢肌肉中，同时设pEGFP-C1对照组，通过荧光检测法和免疫组织化学检测法证实了GDNF基因在小鼠肌肉中获得了表达。原核和真核重组表达质粒的成功构建，为进一步获得重组活性的GDNF蛋白和神经系统疾病的基础和临床的基因治疗研究奠定了基础。
毕华[6]2005年在《睫状神经营养因子突变体的克隆，表达，纯化及生物学活性的研究》文中提出睫状神经营养因子(CNTF)是分子量为22-26KD的酸性蛋白质。因为最初是从鸡的睫状体中提取出来，并可维持鸡副交感神经节的存活而得名。它与NTF(neurotrophic factor)家族明显不同，没有同源性，是非靶源性的营养因子，与白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素6(IL-6)等具有相似的螺旋框架结构，因而被认为属于IL-6家族。CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活，是第一个被发现的能维持在体和离体脊髓运动神经元的存活及突起生长的神经营养因子，CNTF还具有肌肉营养作用，在神经系统发育、分化和神经损伤修复中具有非常重要的作用。最近研究表明，睫状神经营养因子与位于丘脑部位的受体结合，能使缺乏leptin的肥胖小鼠(ob／ob mice)脂肪减少，体重降低；对于更能代表人类肥胖症实际情况的食物诱导肥胖小鼠(diet-induced obesity，DIO)模型，CNTF也能使之体重下降。与通过饮食减肥及其他的治疗方法相比，CNTF不会发生停药后过量摄入食物而引起的体重反弹。因此，CNTF具有广阔的临床开发前景，有望开发成为一种新型、高效的减肥产品。 CNTF受体在神经系统和骨骼肌中广泛存在，在运动神经系统以及与运动系统有关的部位大量表达。CNTF受体由CNTFRα、gp130、LIFRβ三部份组成，其中CNTFRα是CNTF特异性结合部位，决定哪些细胞对CNTF有反应，而gp130、LIFRβ与信号传导有关。CNTF的诸多生物学功能主要是通过激活CNTFRα，然后介导信号转导完成的。因此，通过对CNTF与CNTFRα相互作用的分子机制的研究，确定CNTF的关键
唐娟[7]2006年在《人类Neuritin在原核细胞中的克隆、表达及相关生物学功能的研究》文中进行了进一步梳理神经营养因子是一类促进神经细胞存活、生长、分化的多肽分子,在神经系统发育、分化和损伤修复过程中起着非常重要的作用。Neuritin是一种新近发现的与神经可塑性相关的神经营养因子。研究表明Neuritin在神经再生的领域中具有较广泛的生物学活性,可促进神经突起的快速生长和分支,并参与调节神经元突触活动,因而对多种因素引起的神经系统损伤后轴突和突起的生长具有潜在的治疗与预防作用。由于Neuritin体内含量低,提取与纯化困难,难以满足研究和临床治疗需要,因此以基因工程的方法制备重组人的Neuritin将是获取Neuritin有效的手段。本论文就Neuritin在原核表达、纯化及生物学活性测定等进行了研究,这为临床上用基因治疗神经系统疾病奠定了实验基础。本实验是以neuritin cDNA为模板, PCR扩增neuritin基因后,克隆于原核表达载体pET32a,分别用NocI和NotI双酶切鉴定。鉴定正确的重组子pET32-neuritin转化大肠杆菌BL21,测序正确的阳性转化子用IPTG诱导后获得了融合Neuritin蛋白;SDS-PAGE分析表明:大肠杆菌表达菌株经IPTG诱导后,可表达分子量为30kD的融合Neuritin蛋白质并且在4小时时表达量最大;Western blot检测表明该表达产物具有Neuritin免疫活性;经Ni-NTA纯化系统及尿素分步透析,表达蛋白得到了有效的纯化和复性。最后,对重组Neuritin的活性进行鉴定。结果表明:与阴性和空白组对照后,大肠杆菌表达的融合的Neuritin在体外能促进培养的pc12细胞和鸡胚背根神经节神经突起的生长并能延长它们的存活时间。本研究首次报道了重组人Neuritin在大肠杆菌的表达以及在体外实验中促进鸡胚神经节和pc12细胞突起的生长,这项工作为神经营养因子Neuritin在神经系统疾病的治疗的应用中奠定了良好的基础。
佚名[8]2002年在《作者索引》文中研究说明(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
张睿[9]2011年在《重组人酸性成纤维细胞生长因子—穿膜肽融合蛋白的克隆、表达及纯化研究》文中认为酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)是FGF家族的一员,具有广泛的生理药理作用,在组织和器官发育、血管发生、细胞的分化与凋亡、肿瘤发生和伤口愈合等方面发挥重要作用。然而aFGF作为生物大分子进入细胞发挥作用是通过激活其受体实现的,在没有受体存在的情况下,进入细胞发挥作用成了不可忽略的难题。因此将aFGF与穿膜肽(transcriptional activator protein, Tat)融合表达并使其进入细胞发挥作用具有一定的意义。本研究拟利用基因工程技术将aFGF_(19-154)-Tat与表达载体相连接后导入到适当的宿主细胞中,使其高效表达aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,分离纯化获得具有促细胞增殖活性的融合蛋白,为进一步开发基因工程药物奠定基础。目的：以大肠杆菌为宿主菌,利用基因工程技术表达重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)-穿膜肽(Tat)融合蛋白,建立aFGF_(19-154)-Tat中试规模的发酵、纯化工艺以及体外生物学活性测定方法,为进一步开发aFGF_(19-154)-Tat融合多肽创新药物奠定基础,并为相关基因工程药物提供实验依据。方法：从人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得aFGF的cDNA,并以aFGF的cDNA为模板,使用含有Tat片段的引物扩增出aFGF_(19-154)-Tat目的基因。将aFGF_(19-154)-Tat片段连接到原核表达载体pET3c中,构建重组原核表达质粒pET3c-aFGF_(19-154)-Tat,表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中,IPTG诱导表达,筛选高效表达的工程菌。工程菌的摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵,通过阳离子交换(CM-Sepharose FF)层析、肝素亲和层析(Heparin-Sepharose CL-6B)和凝胶排阻层析(Sephadex G-50)方法分离纯化目的蛋白aFGF_(19-154)-Tat。Western blotting和高效液相色谱分析纯化的aFGF-Tat融合蛋白,MTT法体外检测aFGF-Tat融合蛋白对NIH 3T3细胞的促增殖作用。结果:DNA测序结果证实成功构建pET3c-aFGF_(19-154)-Tat重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白。优化表达条件：37℃条件下培养,当A600为08时加入终浓度为0.8mmM的IPTG诱导4h,表达量达15%以上。高密度发酵结果显示,每升发酵液可获得菌体90g。菌体超声破碎,经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符,并且是可溶性表达,通过阳离子交换层析、肝素亲和层析和凝胶排阻层析纯化,获得aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,高效液相色谱分析显示融合蛋白纯度高于95%。Western blotting分析表明表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力。MTT法体外检测证实融合蛋白具有促进NIH 3T3细胞增殖作用,这与阳性对照组aFGF的生物学活性基本相同并显著高于空白对照组(P<0.01)。结论：成功构建表达质粒pET3c-aFGF_(19-154)-Tat,并得到重组人aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白工程菌,发酵纯化获得aFGF_(19-154)-Tat融合蛋白,体外试验证实了aFGF1g-154-Tat融合蛋白具有促细胞增殖活性,这对日后研究治疗损伤修复类药物提供了实验依据。
王丽梅[10]2003年在《GFRα1与GDNF结合位点的研究》文中提出GFRα1与GDNF结合位点的研究 胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元、肠道神经元等多种神经元具有促进存活及保护作用，它还能促进肾脏的发育和精原细胞的成熟，因此，极有希望用于治疗神经损伤和神经系统退行性病变。GDNF的神经营养作用主要是通过两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRαs)亚基和受体酪氨酸激酶RET亚基。GFRαs亚基靠其C-末端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜的外表面，属膜外蛋白，它不能直接转导信号。传统观点认为：GDNF首先与GFRα1结合形成GDNF-GFRα1复合物，此复合物再与RET结合形成三聚体复合物，引起RET的二聚化，并引起酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导。后来的研究发现，在某些细胞上，不用GDNF刺激，GFRα1与RET即有弱结合，RET的存在增强了GDNF与GFRα1的亲和力。关于GDNF分子中与GFRα1结合并产生生物学效应的位点目前已研究得比较清楚，但关于GFRα1分子中与GDNF结合并产生生物学效应的位点，目前尚未见报道。如果能阐明GFRα1分子中与GDNF结合的功能位点，也就明确了GDNF与GFRα1双向结合的分子与结构特征。这样，不仅可以深入认识GDNF神经营养作用的分子机制，也为设计具有神经营养作用的小分子多肽提供靶标，同时也将促进GDNF用于临床治疗帕金森病等神经退行性疾病的研究进程，并有助于深入了解其它神经营养因子的作用机制。 肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)是被广泛用于研究神经营养因子作用的细胞模型。不同的神经营养因子可引起PC12细胞增值或分化的不同表型变化，在完全培养基中，PC12细胞行有丝分裂呈肾上腺嗜铬细胞状；但在神经生长因子(NGF)或成纤维生长因子(FGF)作用下，细胞停止分裂并向神经元样细胞分化；而在胰岛素样神经生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)和表皮生长因子(EGF)作用下，细胞不分裂却出现增殖。PC12细胞不表达GDNF受体alphal(GFRα1)，而只表达低水平的RET。11中英文摘要 本研究采用RT一PCR、重组DNA技术，构建大鼠GFRol表达质粒，在大肠杆菌中实现大鼠GFRol的高效表达，并通过金属鳌和层析技术纯化重组蛋白;在此基础上，通过进化踪迹分析、同源序列联配及计算机软件模拟GFRal的二级结构，计算了氨基酸残基的保守性、亲疏水性和溶剂可及面积，选定了缺失突变的区域与突变位点;利用细胞转染技术，构建了PC12一GFR以l、PC12一RET、PC12一GFRol一RET及PC12一GFRa1Mn一RET(Mn:GFRal各突变体)等一系列的基因工程细胞株;通过观察GDNF对PC12各突变体基因工程细胞株存活和分化影响的不同并结合免疫共沉淀、Western一blot及蛋白磷酸化检测结果，确定GFRal中与GDNF结合并产生生物学功能的重要位点。 本研究主要结果如下: 1.GFRol基因的克隆、表达及活性蛋白的获得 从新生4d SD大鼠海马组织中提取总RNA，通过RT一PCR方法，扩增出GFR二一cDNA。将oFR。一eDNA克隆至含T7启动子的质粒pET一28a (十)中，构建表达质粒pET一GFRol，转化大肠杆菌BLZI(DE3)，获得表达菌株BLGFRal。表达菌株经lmM IPTG诱导3一sh后，SDS一PAGE检测GFRol蛋白表达，并形成包涵体。凝胶自动扫描分析表明，GFRol蛋白表达量占全菌总蛋白的21.5%，用NiZ气NTA树脂纯化并在NiZ十一柱上复性后，纯度达90%以上。复性的重组GFRal蛋白可显著介导GDNF促PC12细胞存活和分化作用。这为深入研究GFRal的生物学功能奠定了良好的基础。 2.GDNF的表达及其对PC12基因工程细胞的影响 用本教研室已构建好的表达质粒pET一GDNF转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经lmM IPTo诱导GDNF表达，并在NiZ气NTA柱上进行纯化，稀释复性后，纯度达90%以上。利用细胞转染技术，把pcDNA3.o一GFR以1、peDNA3 .0一RET及pCDNA3.0一GFRal+peDNA3.O一RET质粒分别转染入PC12细胞，G418筛选稳定克隆，构建PC12工程细胞株。用GDNF分别刺激工程细胞，3天后观察其存活和分化情况。纯化和复性后的重组GDNF蛋白，可显著增强PC12一GFRal一RET工程细胞的存活和分化;对PC 12一RET工程细胞没有任何作用;对PC12一GFRal的存活和分化作用11中英文摘要显著强于对PC 12一RET的作用，但也显著低于对PC 12一GFRal一RET细胞的作用。初步明确GDNF对PC12细胞的营养作用必须经GFRol介导并有RET参与。 3.GDNF家族及其受体GFRas家族的进化踪迹 利用Ben一Tal小组开发的Consurf和Landgraf等人发展的进化踪迹分析方法，对GDNF家族及其受体GFRa家族进行进化分析;利用ClustalX一V 1 .81构建该家族的多重序列联配和进化树;利用PHD预测GFRos的二级结构及其残基的溶剂可及性，从而绘出了GFRoS二级结构模式图，并进一步确定突变区域和突变位点的选定。 4.GFRol结构与功能分析 利用PCR和DNA重组技术，在GFRaS二级结构预测的基础上，对GFR以1分别进行了N一端、C一端、C一端a螺旋和中央区的缺失突变。在大肠杆菌中分别表达这四个突变体。NiZ十一NTA柱上纯化和复性后，利用PC12细胞的存活和分化情况，分别观?
参考文献：
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[5]. 大鼠胶质细胞源性神经营养因子克隆及表达的研究[D]. 彭玉颖. 吉林农业大学. 2007
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[9]. 重组人酸性成纤维细胞生长因子—穿膜肽融合蛋白的克隆、表达及纯化研究[D]. 张睿. 吉林农业大学. 2011
[10]. GFRα1与GDNF结合位点的研究[D]. 王丽梅. 第二军医大学. 2003
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