李侠[1]2007年在《恶性肿瘤基因工程纳米疫苗抗肿瘤转移与复发作用的研究》文中指出恶性肿瘤危害巨大,但恶性肿瘤的叁大传统疗法-手术、放疗和化疗,治疗效果不尽人意。随着对肿瘤免疫理论的深入认识和一些新的实验方法的涌现,肿瘤疫苗已成为预防和治疗肿瘤转移、复发的有力手段。但由于机体免疫网络的复杂性、肿瘤异质性、疫苗生物利用度差等问题,使得现有肿瘤疫苗的免疫效果并不理想。黑色素瘤抗原(Melanoma Antigen,MAGE)是第一个被发现的人类肿瘤特异性抗原,MAGE3是MAGE家族的重要成员之一,在多种不同类型恶性肿瘤中均有表达,在正常组织细胞(除睾丸、胎盘外)不表达;且MAGE3可与人类白细胞抗原(Human Leukocytes Antigen,HLA)分子结合形成抗原复合物,此抗原复合物可被细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的T细胞受体(T cell receptor,TCR)所识别,诱导特异性CTL的杀伤作用,是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子。热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)具有分子伴侣作用,参与肿瘤抗原的加工递呈,在诱导肿瘤免疫反应中发挥着重要作用;本室研究表明,HSP70与MAGE3融合蛋白能提高MAGE3蛋白疫苗的免疫效果。纳米载药系统与传统载药系统相比有很多优点,可有效解决蛋白质药物的生物利用度差的问题,目前已经有许多深入而广泛的研究。本研究以纳米脂质体包裹肿瘤特异性抗原MAGE3与热休克蛋白HSP70的融合蛋白(MH),制备出纳米脂质体疫苗NL(MH),着重对其抗肿瘤转移与复发作用进行研究,为该纳米疫苗临床前研究奠定基础。一纳米脂质体疫苗制备目的:制备无明显毒性、高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法:纯化融合蛋白MH,薄膜分散-超声法制备包裹MH的纳米脂质体肿瘤疫苗NL(MH),并评价其粒径、包裹率及稳定性;观察NL(MH)免疫组小鼠的急性毒性反应,及重要脏器的病理学改变。结果:①成功制备出粒径为80±25 nm的纳米脂质体,其药物包裹率为30%,于4℃放置6个月后或3000rpm 10分钟离心后无分层,证明其稳定性良好;②与PBS对照组相比,免疫组小鼠未见明显毒性反应。结论:该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的理化性质,未见毒性反应。二纳米疫苗预防和治疗肿瘤转移和复发效应研究目的:在小鼠体内观察纳米疫苗预防和治疗肿瘤肺转移及预防肿瘤复发的作用。方法:以PBS、空白脂质体、MH、MH /NL、NL(MH)免疫C57BL/6小鼠3次后,IFN-γELISPOT和LDH杀伤试实验检测纳米疫苗激活小鼠特异性细胞免疫反应的情况;以实验性肺转移模型和自然肺转移模型评价纳米疫苗预防和治疗肿瘤转移作用;以肿瘤攻击实验和肿瘤切除后复发实验来评价纳米疫苗预防肿瘤复发作用。结果:与其它组相比,NL(MH)组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量明显增多(P<0.05),CTL对B16-MAGE3细胞具有显着的特异性杀伤作用;在预防和治疗肿瘤肺转移实验中,与其它组小鼠相比,NL(MH)免疫组小鼠B16-MAGE3肿瘤肺脏转移结节数明显减少(P<0.05);在肿瘤攻击实验中,NL(MH)组B16-MAGE3肿瘤成瘤时间长、成瘤率低;肿瘤切除后复发实验中,NL(MH)组B16-MAGE3肿瘤复发时间延迟,复发率明显降低。结论: NL(MH)能够刺激机体产生强烈的MAGE3特异性的细胞免疫反应,对表达MAGE3的肿瘤细胞具有显着的杀伤作用,能有效预防和治疗B16-MAGE3肿瘤转移及预防肿瘤切除后复发。综上所述,本研究成功制备出粒径为80±25nm的纳米脂质体疫苗NL(MH),其稳定性良好;NL(MH)能诱导机体产生强烈的MAGE3特异性CTL,对表达MAGE3肿瘤转移和复发具有良好的治疗和预防作用,对表达MAGE3肿瘤复发具有良好的预防作用。本研究为研制使用安全、高效的肿瘤疫苗展示了良好的前景,为本疫苗的临床前研究奠定了基础。
马鸣, 俞莉章, 那彦群, 耿凛, 李鸿伟[2]2004年在《肾及膀胱肿瘤组织中MAGE基因及其产物的表达》文中认为目的 :观察肿瘤特异性抗原MAGE 1、MAGE 3基因及MAGE 3抗原在肾及膀胱肿瘤组织中的表达状况 ,以评价这些基因或基因产物作为肾及膀胱肿瘤组织中的免疫学检测和免疫治疗、基因治疗分子标志物的可行性。方法 :应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)的方法分别测定 39例肾及膀胱肿瘤患者癌组织与 1 0例相应的癌旁组织MAGE 1、MAGE 3基因。应用免疫组织化学方法测定 1 2 1例肾及膀胱肿瘤患者癌组织与 1 0例相应的癌旁组织MAGE 3抗原表达。结果 :39例肾及膀胱肿瘤中有 2 3例MAGE 1mRNA呈阳性表达 (5 9.0 % ) ,有 2 2例MAGE 3mRNA呈阳性表达 (5 6 .4 % ) ,其中肾细胞癌 1 4例中MAGE 1mRNA及MAGE 3mRNA阳性表达均为 8例。肾盂与膀胱移行细胞癌 2 5例中MAGE 1mRNA及MAGE 3mRNA阳性表达分别为 1 5例及 1 4例。同时表达MAGE 1及MAGE 3的肾及膀胱肿瘤为 1 8例 (4 6 .2 % ) ,所有 1 0例癌旁组织均不表达MAGE 1及MAGE 3。免疫组织化学检测 1 2 1例肾及膀胱肿瘤中 5 6例MAGE 3抗原表达阳性 (4 6 .3% ) ,包括肾细胞癌 1 3例 ,MAGE 3抗原表达率为 30 .8% ;肾盂与膀胱移行细胞癌 1 0 8例 ,MAGE 3抗原表达率为 4 8.1 %。 1 0例相应的癌旁组织MAGE 3抗原均不表达。根据Logistic回归检验分析MAGE 3抗原的表达与患者的临床分期及
陈雪华, 刘炳亚, 张冬青, 张奕, 张轶[3]2004年在《MAGE-1、MAGE-3基因在胃癌和胃活检组织中的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的 :检测黑色素瘤抗原基因 1、 3(MAGE 1和MAGE 3)在胃癌中的表达 ,探索其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法 :采用RT PCR法 ,对 36例胃癌患者的癌组织和相应的癌旁“正常”黏膜 ,以及 37例慢性胃炎患者的胃镜活检组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因的表达进行研究 ,并对RT PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果 :36例胃癌组织中 ,MAGE 1基因的表达阳性率为 72 .2 2 % (2 6 / 36 ) ,MAGE 3基因的表达阳性率为 6 9.4 4 % (2 5 / 36 )。MAGE 1、MAGE 3的表达均为阳性者为 5 2 .78% (19/ 36 )。癌旁“正常”黏膜中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率分别为 4 7.2 2 % (17/ 36 )和4 4 .4 4 % (16 / 36 ) ;MAGE 1、MAGE 3基因表达双阳性者为 30 .5 5 % (11/ 36 )。在 37例胃慢性炎症患者中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率 ,分别为 2 9.73% (11/ 37)和 2 7.0 3% (10 /37) ;MAGE 1、MAGE 3基因的表达双阳性者为 8.1% (3/ 37)。胃癌组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因表达阳性率均高于癌旁和胃慢性炎症患者 ;在肿瘤组织中的表达阳性率与肿瘤浸润的深度和分化程度有关 (P <0 .0 5 ) ;而与临床病理分期及淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论 :基于MAGE 1和MAGE 3基因在胃癌中的高表达率 ,可利用这两种蛋白作为靶?
蔡胜利, 赵海涛, 冷希圣, 程继华, 龚顺友[4]2000年在《黑色素瘤抗原-3基因在肝细胞癌中的研究》文中研究指明目的 检测黑色素瘤抗原 3(melanomaantigen 3 ,MAGE 3)mRNA在肝细胞癌 (HCC)中的表达 ,探讨用MAGE 3基因编码蛋白作为疫苗对HCC患者进行免疫治疗在理论上的可行性。 方法 用RT PCR方法对 45例HCC患者癌组织和相应癌旁肝组织以及 16例肝硬化组织和 12例正常肝组织的MAGE 3mRNA表达情况进行研究 ,对 3例RT PCR扩增产物中目的基因片段进行DNA序列测定 ,并以测序证实为MAGE 3基因的cDNA片段为模板合成 [α32 P]标记的探针 ,进行Southern杂交。同时用ELISA方法对其中 43例HCC患者进行HLA 1 A及B位点分型。 结果 45例HCC患者中 ,35例 (78% )MAGE 3mRNA表达阳性 ,癌旁组织有 6例阳性 (13% ) ,病理检查证实这 6例癌旁组织中都有明显的异型增生 ,而非HCC患者的肝硬化及正常肝组织均不表达 ;DNA测序 ,3例PCR产物中的目的基因片段均证明为MAGE 3cDNA序列 ;Southern杂交结果和RT PCR电泳结果完全一致 ;HCC患者中常见HLA类型为A2 (5 3 5 % ) ,A11(2 5 6 % ) ,A2 4 (2 0 9% ) ,A33(2 0 9% ) ,B13(2 8 3% ) ,B35(2 3 2 % ) ;MAGE 3的表达与肿瘤直径 ,AFP水平等临床指标无相关关系。 结论 MAGE 3在肝细胞癌中呈高比例表达 ,这使得以此抗原用于HCC患者的免疫治疗成为可能 ;一些细胞有异型增生的癌旁组织中表?
张国俊, 赵国强, 胡军, 张世杰[5]2006年在《RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响》文中进行了进一步梳理目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响。方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化。用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响。结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示,MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显着下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显着性(P<0.05)。结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体,RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移。
孔毅荣, 付玲, 郭强, 于婷, 于长明[6]2006年在《LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究》文中研究说明目的:表达融合蛋白LFn-MAGE3,探讨无毒炭疽毒素用于治疗肿瘤的可能性。方法:将LFn的编码序列导入PET21a表达载体中,构建LFn融合表达载体PET21a-LFn。将全长MAGE-3基因插LFn融合表达载体中,构建了PET21a-LFn-MAGE3融合蛋白表达载体。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达LFn-MAGE3融合蛋白。表达产物用QsepharoseFF离子交换柱和PheHP疏水柱进行纯化。LF毒性抑制实验和细胞免疫荧光实验检测融合蛋白的生物学活性。结果:融合蛋白LFn-MAGE3在大肠杆菌BL21a获得胞内可溶性表达,经纯化后,获得一定纯度的LFn-MAGE3融合蛋白。细胞免疫荧光实验显示LFn-MAGE3能在PA(炭疽保护性抗原)协同下高效进入巨噬细胞。结论:表达纯化获得的LFn-MAGE3融合蛋白能在PA协助高效进入细胞,可以用于下一步的肿瘤免疫治疗的动物实验中。
刘杏娥, 孙晓东, 吴金民[7]2004年在《MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察》文中研究表明通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显着性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显着性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显着 (P <0 0 1)。说明MAGE 3重组质粒免疫小鼠可以诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答
刘庆伦, 张昌卿, 冯凯涛[8]2000年在《非小细胞肺癌MAGE-3基因产物的表达》文中研究说明目的 检测MAGE 3基因编码的抗原在非小细胞肺癌表达的情况 ,探讨MAGE 3抗原的表达与患者临床表现的关系 ,以及利用MAGE 3基因产物对非小细胞肺癌患者进行特异性免疫治疗的可能性。方法 用免疫组化LSAB的方法对石蜡包埋的组织切片进行MAGE 3抗原的检测。结果 10 4例非小细胞肺癌原发灶肿瘤组织切片中 ,MAGE 3抗原阳性者 31例 ,阳性率 2 9.8%。MAGE 3抗原阳性患者肿瘤转移率 (30 .0 % )明显低于阴性患者的转移率 (5 6 .1% ,P <0 .0 5 ) ,MAGE 3抗原阳性患者 18个月的生存率 (88.2 % )明显高于阴性患者生存率 (5 2 .9% ,P <0 .0 1)。结论 非小细胞肺癌有较高比例的MAGE 3抗原表达 ,并与患者的预后相关。对MAGE 3抗原阳性NSCLC患者 ,可以利用MAGE 3抗原作为靶分子进行免疫治疗。
马加海, 隋延仿, 叶菁, 黄亚渝, 陈广生[9]2004年在《肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达》文中指出目的 克隆肿瘤抗原MAGE 3基因 3’端 6 5 7bp片段 ,对其编码的蛋白羧基端 97～ 314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE 3基因全长cDNA的pUC19 MAGE 3质粒中经聚合酶链式反应 (PCR)扩增 3’端 6 5 7bp片段 ,并克隆入pGEX 4T 1载体 ,构建重组原核表达质粒pGEX MAGE 3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 6 6 0bp的条带 ,测序结果表明与GenBank公布的MAGE 3序列一致 ,成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基 β D 半乳糖苷 (Isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后表达Mr 为5 4 0 0 0的谷胱甘肽巯基转移酶 (GlutathioneS transferse,GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 8%。结论 成功地构建了pGEX MAGE 3原核表达质粒 ,获得了MAGE 3蛋白羧基端 97～ 314aa融合蛋白 ,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。
马加海, 隋延仿, 陈广生, 叶菁, 黄亚渝[10]2004年在《MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达》文中研究表明目的 扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法 采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果 从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论 成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 恶性肿瘤基因工程纳米疫苗抗肿瘤转移与复发作用的研究[D]. 李侠. 第四军医大学. 2007
[2]. 肾及膀胱肿瘤组织中MAGE基因及其产物的表达[J]. 马鸣, 俞莉章, 那彦群, 耿凛, 李鸿伟. 北京大学学报(医学版). 2004
[3]. MAGE-1、MAGE-3基因在胃癌和胃活检组织中的表达及意义[J]. 陈雪华, 刘炳亚, 张冬青, 张奕, 张轶. 细胞与分子免疫学杂志. 2004
[4]. 黑色素瘤抗原-3基因在肝细胞癌中的研究[J]. 蔡胜利, 赵海涛, 冷希圣, 程继华, 龚顺友. 中华外科杂志. 2000
[5]. RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响[J]. 张国俊, 赵国强, 胡军, 张世杰. 中华医学杂志. 2006
[6]. LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究[J]. 孔毅荣, 付玲, 郭强, 于婷, 于长明. 细胞与分子免疫学杂志. 2006
[7]. MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察[J]. 刘杏娥, 孙晓东, 吴金民. 生物工程学报. 2004
[8]. 非小细胞肺癌MAGE-3基因产物的表达[J]. 刘庆伦, 张昌卿, 冯凯涛. 中华肿瘤杂志. 2000
[9]. 肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达[J]. 马加海, 隋延仿, 叶菁, 黄亚渝, 陈广生. 免疫学杂志. 2004
[10]. MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达[J]. 马加海, 隋延仿, 陈广生, 叶菁, 黄亚渝. 免疫学杂志. 2004
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