王金花[1]2004年在《毒死蜱降解微生物的筛选及其降解特性研究》文中指出本研究以有机磷杀虫剂毒死蜱为研究对象,对毒死蜱的测定方法,降解微生物的富集分离,微生物降解特性及降解酶的降解特性进行了比较系统的研究。主要内容如下:1.本文建立了液体介质中毒死蜱的提取测定方法。液体介质中毒死蜱的提取采用旋涡振荡提取法,提取溶剂为石油醚;毒死蜱的测定采用紫外分光光度法:用石油醚提取水体中的毒死蜱,以同样提取方法提取的无毒死蜱的石油醚作为参比,在293nm下测定。该方法操作简便;成本低;最小检出浓度为0.2 mg·L-1;测定结果的准确性与气相色谱法比较,没有明显差异。该方法可以用来测定水体中的毒死蜱,可以比较方便可靠的进行降解菌降解能力的测定。2.采用直接分离和富集培养的方法筛选毒死蜱的高效降解真菌。直接分离得到了5株能够降解毒死蜱的真菌,但是,降解效果不理想;富集培养法分离得到叁株以毒死蜱为唯一碳源生长的真菌,编号为WZ-Ⅰ、WZ-Ⅱ、WZ-Ⅲ;经过鉴定,叁株菌均属于镰孢霉属(Fusarium LK.ex Fx)。该叁株菌5d内对50mg·L-1毒死蜱的降解率分别高达93.5%、91.4%、83.5%。3.测定了1～5d内叁株真菌对毒死蜱的降解能力,通过降解常数和半衰期分析得出,叁株真菌对毒死蜱的降解速率为WZ-Ⅰ>WZ-Ⅱ>WZ-Ⅲ。测定了不同外加碳源浓度、pH、温度及毒死蜱浓度对真菌降解能力和生长量的影响。结果表明,以毒死蜱为唯一碳源,pH为6.5～9.0,温度为30～40℃,毒死蜱浓度为20mg·L-1～200mg·L-1时,真菌的降解效果较好;真菌的生长量随着外加碳源的增加而增加,在pH为6.5～9.0时生长量较大,温度为40℃,毒死蜱浓度为50mg·L-1时生长量最大。4.毒死蜱降解细菌也采用直接培养和富集培养两种方法,但是均没有找到降解效果理想的细菌。将实验室已有菌种进行驯化,培养基中毒死蜱的浓度由20到500mg·L-1逐步提高。降解实验表明,能够降解二甲戊乐灵的细菌WB-1-玫瑰色微球属(Mirococcus luteus)降解能力相对较高,48h内对50mg·L-1的毒死蜱降解率在66.7%。
李文华[2]2013年在《毒死蜱降解菌的分离、筛选及其降解条件的优化》文中指出尽管毒死蜱已经广泛的应用到经济作物的病害防治，但筛选出来的降解菌降解率都不是很高，而且表现出了抑制生物增强生物降解的现象。关于毒死蜱降解菌的报道从1965年毒死蜱投入使用以来，至今为止很少有关于提高微生物毒死蜱降解率的报道。本研究的目的是寻找高效降解毒死蜱降解菌株，对优势菌株进行降解特性研究，克服影响降解率限制因子，提高菌株对毒死蜱的降解率。本研究采用富集培养的方法从泰安周边苹果园中分离到了叁株对毒死蜱具有高效降解能力的降解细菌HP-1、HP-2和HP-3，对这叁株菌进行了形态学、生理生化及16SrDNA鉴定，选取降解能力较强的菌株HP-2为研究对象，研究了其对毒死蜱的降解特性，主要研究结果如下：（1）筛选获得叁株能高效降解毒死蜱的细菌HP-1、HP-2和HP-3，通过形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析，将其分别鉴定为人苍白杆菌（Ochrobactrumanthropi），硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens），微嗜酸寡养单胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）；其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号分别为KC961631、KC961632和KC961633。（2）在液体无机盐培养基培养条件下，运用紫外可见分光光度法（UV-Vis）测定了各菌株对毒死蜱降解性能。在pH7.2和28C条件下培养7d，细菌HP-1、HP-2和HP-3对100mg/L的毒死蜱降解率分别可以达到：50.6%、59.5%和45.6%。（3）通过单因子实验测定了不同碳源、不同氮源、不同磷酸盐浓度对降解菌HP-2降解效果和生长情况的影响。结果表明：适宜菌株HP-2降解毒死蜱的培养基组成份为：果糖0.1g/L、酵母提取物0.5g/L和磷酸盐1.5g/L。然后通过中心组合响应面分析对果糖、酵母提取物和磷酸盐浓度进行优化后，优化结果表明：果糖浓度为0.11g/L，酵母提取物浓度为0.60g/L，磷酸盐浓度为1.55g/L时，在pH7.2和28C条件下培养7d，毒死蜱的实际测得降解率为76.15%，细胞浓度为OD_(600)＝1.0765，与理论值76.28%和1.089非常接近，说明该模型能很好地预测毒死蜱的实际降解情况。（4）通过单因子实验对降解菌HP-2的降解条件进行了优化。结果表明：初始pH值为9.0、毒死蜱浓度100mg/L、接种量为15%（体积比，菌体密度：稀释到菌悬液（OD_(600)=0.7）所需菌体的1.5倍）、培养温度为28C时，培养7d，毒死蜱的降解率可以达到81.25%。（5）从高效降解细菌HP-2中提取了降解粗酶，初步研究了该降解粗酶对毒死蜱降的解特性。结果表明：其胞内酶粗酶液、细胞碎片和胞外酶粗酶液在30min对100mg/L的毒死蜱降解率分别为24.01%，13.63%和8.25%，由此可以推测降解菌HP-2的相关毒死蜱降解酶可能是胞内酶。HP-2的胞内酶粗酶液在0.5h，6h和12h反应时间内，对100mg/L的毒死蜱降解率分别可以达到为24.01%，50.25%和69.50%。
谢慧[3]2005年在《粗酶和固定化酶对毒死蜱降解特性研究》文中研究表明本研究以有机磷杀虫剂毒死蜱为研究对象,对毒死蜱的气相色谱测定方法,毒死蜱降解酶的提取,固定化酶的制备及其降解酶和固定化酶的特性进行了研究,并对降解酶在消除蔬菜表面的农药残留中的应用进行了系统的研究。主要内容如下: 1.介绍了毒死蜱的理化性质,国内外应用概况,生态毒理及生态风险特征,以及毒死蜱应用所带来的环境污染和残留问题;进而提出了作者要研究的问题。 2.建立了环境中毒死蜱的残留测定方法-气相色谱法。水样中毒死蜱的提取采用液液分配萃取法,用有机溶剂石油醚从水样中提取毒死蜱;蔬菜中毒死蜱的提取采用振荡提取法,液液分配净化等前处理方式,用气相色谱测定毒死蜱的残留量。条件为:GC-14C,FPD 检测器,内涂100%Dimethylpolysiloxane OV~(-1)01 大口径毛细管柱(30m×0.53mm i.d.);温度:进样口260℃,柱温230℃,检测器260℃;气体流量:载气50ml·min~(-1),尾吹30ml·min~(-1),氢气60ml·min~(-1),空气60 ml·min~(-1);不分流进样,进样量1μL。该方法简便、准确、分离度高,最小检知量为2.0×10-12g,在此条件下毒死蜱的保留时间为1.76min,线性范围在5.0×10-11～10-8g 之间。水样中毒死蜱添加量分别为0.01,0.1,1.0,5.0mg·L~(-1),回收率在98.05%~(-1)04.44%之间,变异系数小于3.14%;蔬菜样品中毒死蜱添加量为0.01、0.03、0.05、0.5、5.0 mg·kg~(-1),回收率在80.81%-87.68%之间,变异系数小于4.48%。缓冲液中毒死蜱的测定采用紫外分光光度法及气相色谱法。 3.从高效降解真菌镰孢霉属WZ-Ⅰ(Fusarium LK.ex Fx)中提取了降解酶,初步研究了该降解酶的分离条件及对毒死蜱的降解特性。研究表明,其胞内酶对毒死蜱的降解率高达60.8%,细胞碎片对毒死蜱的降解率为48%,但由(NH4)2SO4 沉淀提取的胞外酶液对毒死蜱的降解率仅为11.3%,经8次非诱导条件下培养后提取粗酶液,酶活力损失不显着,由此判断WZ-Ⅰ菌株的毒死蜱降解酶为胞内酶和组成酶。以牛血清白蛋白为标准蛋白测得粗提酶中可溶性蛋白的含量为3.36mg·mL~(-1);该酶对毒死蜱的酶促降解最适pH 为6.8,在pH 6.0～9.0 之间都有较高的活性;最适温度为40℃,在20～50℃条件下该降解酶均具有较好的降解活性,但在55℃时,酶活
徐刚明[4]2007年在《有机磷农药残留高效降解微生物的筛选、鉴定及降解机理研究》文中进行了进一步梳理有机磷农药毒死蜱是目前全世界生产和销售量最大的杀虫剂之一,由此带来的环境污染问题也受到人们的普遍关注。国内外对毒死蜱的微生物降解进行了较为广泛的研究,对于其主要降解途径有了初步的了解,但尚未有将毒死蜱完全降解或矿化的高效降解菌的研究报道。本研究应用微生物富集驯化方法,筛选分离到多株毒死蜱彻底降解细菌和真菌,对其降解特性和降解机理进行研究;并对毒死蜱降解菌的混合培养及其降解酶的降解特性进行了探讨。主要研究内容加下:1.从叁个农药厂的污水处理池活性污泥中筛选获得多株能高效降解毒死蜱的细菌DM、TRP、TCR和真菌TCF,通过形态学、生理生化和16S/18S rDNA序列同源性分析,将其分别鉴定为副球菌属(Paracoccus sp. DM/TRP)、沙雷菌属(Serratia sp. TCR)和丝孢酵母属(Trichosporon sp. TCF);其16S/18S rDNA基因序列在GenBank中的注册号分别EF070123、EF070124、EF070125和EF091819。2.在纯培养条件下,运用紫外可见分光光度法(UV-Vis)、气相色谱法(GC-FPD)和高效液相色谱(HPLC)法,分别测定了各菌株对毒死蜱及其降解中间产物叁氯吡啶酚的降解性能。在pH 7和30℃条件下,细菌DM和TRP都能同时将50mg/L的毒死蜱和叁氯吡啶酚在5天内完全降解;细菌TCR只能将毒死蜱转化为叁氯吡啶酚;真菌TCF能将50mg/L的叁氯吡啶酚在4天内完全矿化,也能将50mg/L的毒死蜱在7天内降解。测定了不同接种量、外加碳源、温度、pH及毒死蜱浓度对菌株降解能力和菌体生长的影响。结果表明:以毒死蜱为唯一碳源、接种量0.15～0.3g/L、温度15～35℃、pH 7～9、毒死蜱浓度25～200mg/L时,各菌株的降解效果较好;外加碳源会显着增强微生物对毒死蜱的降解。3.沙雷菌(Serratia sp.)TCR和丝孢酵母(Trichosporon sp.)TCF共培养后,能显着增强其对毒死蜱的降解能力,50mg/L的毒死蜱在18小时内即可被完全矿化;再与副球菌(Paracoccus sp.)TRP混合培养后,12小时可完全降解50mg/L的毒死蜱。在含50mg/L毒死蜱的液体培养条件下,混合培养菌的最适降解条件为:接种量0.15g/L、温度30℃、pH 8、外加碳源(蔗糖)0.5%。4.对毒死蜱降解的微生物代谢途径,通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)分析表明,叁氯吡啶酚是最主要的降解中间产物。细菌DM、TRP和真菌TCF都能以叁氯吡啶酚或吡啶为唯一碳源或氮源生长,表明降解过程中伴随着吡啶环的断裂,最终彻底矿化成二氧化碳和水。各菌株还可降解叁氯吡啶酚、吡啶、甲基对硫磷、克百威等,具有较为广泛的底物谱,显示出其在被污染环境修复中的应用潜力。5.运用SDS-PAGE和Native-PAGE对诱导和非诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳分析表明,毒死蜱降解酶在副球菌DM、TRP中可能为诱导型表达,而在沙雷菌TCR和丝孢酵母TCF中可能为组成型表达。各菌株粗酶活性分析表明,粗酶液能将50mg/L的毒死蜱快速降解为无毒物质;降解酶在pH 7～9和20～40℃活性较高,最适pH 8,降解酶最适温度细菌TRP为30℃、真菌TCF在35℃;此粗酶液可用于果蔬表面农药残留的快速解毒和清除。
段海明[5]2011年在《毒死蜱降解细菌的筛选、降解特性及其固定化研究》文中指出有机磷农药以其高效、廉价等特点而被广泛应用,但其对人体健康和环境等影响较大是不容忽视的问题。目前国内外已报道的甲基对硫磷降解菌有假单胞菌(Pseudomonas sp.)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)、产碱菌(Alcaligenes sp.)和节杆菌(Arthrobacter sp.)等;毒死蜱降解菌有阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)和玫瑰红红球菌(Rhodocouus rhodochrous)等。但是已报道的细菌由于环境适应性不强等原因,还未达到开发利用的要求,因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。另外,有关同一菌种的不同菌株对有机磷农药的降解差异性也鲜有报道。本研究旨在寻找高效降解有机磷农药的菌株,明确菌株的分类学地位,同时探讨环境条件对菌株降解有机磷农药的影响、单株菌的降解动力学和降解混合菌的构建。进一步提取降解酶,优化产酶条件,明确降解酶的酶促降解特性,进而研究优势菌株的固定化条件和特性。研究结果如下:1.采用直接分离与富集驯化培养相结合的方法,分离筛选出叁株能够降解有机磷农药的菌株HY-1、HY-2和HY-4,在形态特征和生理生化分析的基础上,又对其16S rDNA序列进行了分析,并研究了其对甲基对硫磷(Methyl-parathion)、毒死蜱(Chlorpyrifos)和叁唑磷(Triazophos)的降解特性。结果表明:叁菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的不同菌株,叁菌株在Genbank上的登录号分别为:eu915687、eu915686和eu915688。叁菌株在72 h内对初始浓度为50 mg/L甲基对硫磷的降解率分别达到91.7%、88.7%与92.4%,菌株之间无显着性差异(P>0.05);在毒死蜱初始浓度为50 mg/L和100 mg/L时,HY-1和HY-4降解毒死蜱的能力和HY-2有显着性差异(P<0.05),其中叁菌株在72 h内对100 mg/L毒死蜱的降解率分别达到64.8%、53.7%和59.5%;叁菌株在72 h内对初始浓度为100 mg/L叁唑磷的降解率分布在13.3%–20.7%之间,其中HY-2对叁唑磷的降解率较高,并和其余两菌株有显着性差异(P<0.05)。可以看出,蜡状芽孢杆菌的不同菌株对有机磷农药的降解存在差异性。2.以单因素试验探讨了叁菌株降解甲基对硫磷和毒死蜱的影响因素,得出了叁菌株降解有机磷农药的最适环境条件。结果表明:菌株HY-2能够利用甲基对硫磷和毒死蜱为唯一磷源降解农药。HY-2降解甲基对硫磷的适宜条件为:培养温度30°C–35°C、初始pH为6–8、甲基对硫磷初始浓度为10–50 mg/L、接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到菌悬母液(OD600=3.0)的0.8倍),添加葡萄糖不能促进菌株对甲基对硫磷的降解;HY-2降解毒死蜱的适宜条件为:葡萄糖浓度6 g/L、培养温度30°C–35°C、初始pH为7、毒死蜱初始浓度为80–200 mg/L、接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到菌悬母液(OD600=3.0)的0.8倍)。HY-1和HY-4两菌株降解毒死蜱的适宜条件为:葡萄糖浓度3 g/L、培养温度35°C、初始pH为7–8、毒死蜱初始浓度80 mg/L、接种量20%(体积比,菌体密度:稀释到所配菌悬母液(OD600=2)的0.5倍)。酵母膏含量对毒死蜱的降解影响表明,当添加3 g/L的葡萄糖时,最适的酵母膏含量为1 g/L,而不添加葡萄糖时,最适的酵母膏含量为5 g/L。在酵母膏试验浓度范围之内,不添加葡萄糖时菌株对毒死蜱的降解率最终也不能达到含有葡萄糖的水平。3.采用种子液培养基中定量添加毒死蜱和定时取样分析毒死蜱残留浓度的方法,明确了毒死蜱对蜡状芽孢杆菌的生长抑制动力学和菌株对毒死蜱的降解动力学,同时研究了降解菌对高浓度毒死蜱的耐受度和菌胶团的形成能力。结果表明:HY-1、HY-2和HY-4叁菌株最适种子液培养时间分别为10、19和15 h。含毒死蜱培养液和空白对照相比,HY-1和HY-2两菌株生长的适应期延长,对数期、稳定期顺序后延。随着培养液中菌体数量的增长,培养液的pH也随之升高。接菌量为8%(V/V)时降解率最高。HY-1和HY-2两菌株对不同浓度的毒死蜱表现出不同的降解规律。对于低浓度的毒死蜱,毒死蜱的浓度随着时间的推移而下降;当毒死蜱浓度较高时,毒死蜱的降解过程包括吸附、解吸和降解等几个阶段。一级动力学方程ln(C0/Ct) = kt可以用来拟合毒死蜱的降解动力学及确定降解动力学参数。研究发现,菌株HY-2比HY-1可以耐受更高的毒死蜱浓度,但HY-1的菌胶团形成能力要高于HY-2。4.为明确蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)混合菌株对毒死蜱的降解效果,本研究采用正交试验的方法构建混合菌。以混合菌对毒死蜱的降解率和菌株的生长量为依据,利用单一因素试验考察了不同因素对混合菌降解毒死蜱的影响。两菌株组合时研究发现,HY-1和HY-4两菌株的比例为1:1(V/V)时,对80 mg/L毒死蜱的降解率最高。添加葡萄糖有助于菌株的生长,但是不利于毒死蜱的降解。偏碱性环境对菌株的生长有利,对毒死蜱的降解也有利。菌株的降解动力学研究发现,两菌株混合对毒死蜱的降解和单菌的降解规律相似。两菌株混合时能够耐受20–70 g/L的NaCl浓度,且对80 mg/L毒死蜱的降解率都在41%以上。利用正交试验构建的叁菌株组合降解混合菌的体积比为:1:1:3。在含80 mg/L毒死蜱的基础培养基中,接菌量为8%(V/V)时降解率最高,降解最适pH值为7。在试验浓度下,叁菌株混合菌对毒死蜱的降解也符合一级动力学方程。混合菌对高盐具有很高的耐受度,当反应液中NaCl浓度在20–100 g/L之间时,叁菌株混合菌对80 mg/L毒死蜱的降解率仍较高,最高达61%。5.以从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1菌株中提取到的降解酶比活力为指标,进行产酶培养基和发酵条件的优化研究。通过单一因素试验和正交试验,对菌株HY-1的产酶培养基和发酵条件进行了优化。运用SPSS 13.0软件进行结果分析,所获优化培养基配方为:葡萄糖6.0 g/L、胰蛋白胨2.2 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 0.1 g/L和微量元素溶液2 mL/L。菌株发酵培养的优化条件为:种子液培养时间16 h、发酵培养时间18 h、接种量1%(V/V)、发酵培养基初始pH值为7.0。在NaCl浓度为0?30 g/L时,所产降解酶比活力不受影响。这是已报道的耐盐性最强的一株毒死蜱降解菌。6.为明确毒死蜱降解菌-蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1的粗酶液对毒死蜱的降解特性,采用测定粗酶比活力的方法,研究了不同环境因素对粗酶液降解毒死蜱的影响。结果表明:粗酶液中可溶性蛋白的含量为2.21 g/L,测得粗提酶其米氏常数Km为1.2356 mmol/L,最大降解速率Vmax为0.0226μmol/(mg·min)。酶促反应时间为1 h时,粗酶液对50 mg/L毒死蜱的降解率最高可达74%,粗酶液加入量为1 mL时的比活力最高。在20°C ?44°C的温度范围内,粗酶液都能保持较好的降解活性,其中最适温度为28°C;在pH 5?9之间时,粗酶比活力都能达最高比活力的66%以上,最适pH为6。进一步研究发现,该粗提酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,在温度为-20°C ?40°C,pH为4?8的条件下,暴露1 h仍能保持较高的比活力。该粗酶液在10?70 g/L的NaCl浓度下保持1 h仍能高效降解毒死蜱。该降解粗酶与国内外已报道的毒死蜱降解粗酶相比,其耐盐性是最高的,故进一步开发应用价值较大。7.以海藻酸钠为载体,采用注射器滴定方法将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1用海藻酸钠溶胶包埋,研究固定化菌对毒死蜱的降解效果。结果表明:海藻酸钠固定化菌能高效降解基础培养基中100 mg/L的毒死蜱。当培养时间为60 h时,固定化菌对100 mg/L毒死蜱的降解率最大。固定化菌颗粒接入量为160 g/L时,其对100 mg/L毒死蜱的降解率最高。固定化菌对毒死蜱的降解有着较宽泛的pH适应范围,在pH 5–10时都能高效降解毒死蜱。当毒死蜱初始浓度为80 mg/L和100 mg/L时,固定化菌对毒死蜱的降解率较高,达90%左右。固定化菌重复利用4次后,其对100 mg/L毒死蜱的降解率仍达47%。因此,固定化菌在毒死蜱污染的净化去毒方面有着重大的现实意义。
任明[6]2010年在《毒死蜱农药降解菌及其降解特性的研究》文中进行了进一步梳理当前,韭菜地下害虫韭蛆的肆虐,迫使菜农在韭菜生产中大量使用化学杀虫剂。毒死蜱是常用的有机磷杀虫剂之一,虽然具有高效、低毒、广谱、低残留和低抗药性等优点,但大量使用造成了韭菜农药残留超标,严重危害了人类健康并造成了土壤生态环境的日益恶化。众所周知,微生物在降低作物及土壤农药残留中发挥了重要作用,许多农药降解微生物已得到开发应用。针对上述现状,本文从韭菜植株和韭菜根际土壤中分离并筛选具有毒死蜱降解能力的生防菌株,对于韭菜的无公害生产具有重要的现实意义和实践意义。具体结果如下:1.从新鲜韭菜的根中分离到一株对多种蔬菜病原真菌有抑制作用的优势内生细菌W7,其拮抗机制与已报道的其它生防细菌不同,其胞外代谢物对病原真菌无抑制作用,而菌体经超声波破碎及有机溶剂沉淀得到的菌体多糖粗提液可明显抑制病原菌菌丝生长。而且,该菌能以100mg/L高效氯氰菊酯为唯一碳源生长,7d的降解率为51.3%,但不能降解毒死蜱。通过对其形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,将其鉴定为类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)。2.从受农药污染的韭菜根际土壤中获得了一株高效毒死蜱降解细菌D10,该菌能以毒死蜱为唯一碳源生长,6d内对100mg/L的毒死蜱降解率达59.7%。通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为不动杆菌(Acinetobacter.spp)。3.为进一步研究毒死蜱降解菌D10的降解特性,测定了外加碳源浓度、pH、温度、接种量及毒死蜱浓度对菌株降解率和生长量的影响。结果表明,当pH为8.0,温度为30～35℃,接种量在5%,毒死蜱浓度为200mg/L以下时,菌株D10的降解效果较好;在pH为8.0以上,外加碳源1%以上,温度为35℃,接种量10%,毒死蜱浓度为200mg/L以下时,菌株D10的生长量最大。4.采用超声波破碎、有机溶剂沉淀等方法从菌株D10中提取粗酶液,用于研究毒死蜱降解酶在细胞中的定位和性质。结果表明:毒死蜱降解酶主要位于胞内。该酶对毒死蜱的酶促降解最适pH为8.0,在碱性条件下相对稳定;最适温度为30℃,且具有较好的热稳定性。5.实验室模拟受污染土壤,研究菌株D10在土壤中的实际降解效果。结果表明,在添加了菌株D10的未灭菌土壤中,20d降解率达82.5%,而未灭菌土壤的自然降解率仅有26.7%,表明在土壤中添加菌株D10可明显降低土壤中的毒死蜱残留。6.由于韭菜优势内生细菌W7不能降解毒死蜱,为使其今后能通过转基因的方式获得毒死蜱降解能力,对菌株D10的毒死蜱降解酶基因进行初步研究。目前,已报道的有机磷降解酶基因位于质粒或者基因组DNA上。本研究对菌株D10多次进行质粒提取,电泳检测无质粒条带,从而可以判断菌株降解毒死蜱的相关基因位于基因组DNA上。根据已报道的甲基对硫磷降解酶(mpd)基因的编码区设计引物,PCR得到一条约900bp的片段。
肖艳萍[7]2017年在《复合微生物秸秆腐熟菌剂的筛选及其对毒死蜱残留的影响》文中研究指明中国是农业大国,每年有10亿t左右的种植业废弃物,60%以上的农作物秸秆被焚烧或是废弃,不仅严重污染环境,还浪费资源;毒死蜱(chlorpyrifos)是主要应用于害虫防治的一种广谱有机磷杀虫剂,作为全球应用最广泛的杀虫剂之一,其农业生产上的广泛应用在提高作物产量的同时也给食品安全带来了威胁,已对人类健康构成了严重危害。堆肥化生物修复有机污染技术,是利用功能微生物进行堆肥,同时再将农药等有机污染物降解,修复环境的一种工艺,该技术在修复农药等有机物污染环境中开始不断受到关注。采用微生物堆肥的方式将秸秆等农业废弃物制成生物有机肥料,同时将残留毒死蜱降解,不仅实现了毒死蜱残留污染环境的修复,也实现了农业有机废弃物的资源化和无害化,对农作物的食品安全也具有重要意义。本研究从自然生态环境中筛选到38株具有纤维素降解能力的菌株,从中筛选20株构建了25组复合微生物菌系。通过对25组复合菌系进行酶活研究,从中筛选到1组具有较好纤维素降解能力及环境耐受性的复合微生物菌系CM17,该菌系对毒死蜱也具有降解作用;将该菌系作为复合微生物菌剂接种到农业有机废弃物中进行堆肥,发现该复合菌剂不仅能促进堆肥,还能提高堆肥品质。该复合菌剂可应用于被毒死蜱污染的农业有机废弃物的堆肥化修复技术中,作为堆肥化生物修复毒死蜱污染技术的工程菌进一步深入探讨。本文主要研究内容如下:⑴采用纤维素限制性培养基,从腐殖土、湖泊底泥、粪土、牛粪4种自然生境中筛选到38株具有纤维素分解能力的菌株,利用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS)测定这些菌株在不同温度条件下的羧甲基纤维素(CMC)酶活,结果表明,38株菌在35℃、45℃和55℃条件下具有不同的CMC酶活,随着温度升高,菌株酶活呈现下降趋势,当温度为45℃时,各菌株的酶活较为活跃,随着温度升高到55℃,绝大多数菌株的酶活开始下降或是没有活性。⑵从38株菌中筛选出20株,分4组,按照4因素5水平正交组合,构建25组由4株菌组合成的复合微生物菌系,利用DNS法研究这些复合菌系在35℃、45℃、55℃、pH6、pH7.5、pH10的CMC酶活和在pH7.5,温度为35℃时的FPA滤纸酶活,结果发现CM17复合菌系在不同温度条件下和不同酸碱条件下的CMC酶活,以及其FPA滤纸酶活都较其他24组复合菌系表现活跃,其在35℃、45℃、55℃、pH6、pH7.5、pH10、FPA(pH7.5,温度为35℃)的酶活分别为130.260U/mL、107.747U/mL、95.429 U/m L、54.298U/mL、95.429U/mL、105.482U/mL、23.716U/mL。和其它24组复合菌系的酶活相比,CM17复合菌系具有较好的环境耐受性,能在不同温度、不同酸碱条件下保持较好的酶活特性,具有一定的酶活稳定性。⑶CM17复合菌系较单菌株更加有利于纤维素的分解,复合菌系菌株之间存在较好的协同降解作用。(1)在同等条件下崩解同等重量的滤纸,CM17复合菌系只要72h,CD53、LS14、TD21、CD52各菌株分别要7d、11d、15d、18d,复合菌系的纤维素分解效率至少是单菌株的2.33倍。(2)无论恒温还是变温培养,CM17复合菌系在培养过程中的p H变化不大,均在7-8之间;复合菌系在不同温度下的FPA酶活差异性不显着,温度变化对该菌系的纤维素降解能力影响不大,可能混合使得各菌株之间的协同作用加强了,从而降低了温度变化对其整体酶活的影响。(3)以滤纸作为唯一碳源,不同比例混合的CM17复合菌剂的72h滤纸崩解试验发现,当混合比例是1:1:1:1时,该复合菌剂具有最佳协同降解作用,也是制备该复合菌剂的最佳混合比例。⑷CM17复合菌系和CD53、LS14、TD21、CD52对毒死蜱残留存在影响。在p H7-8,35℃恒温振荡降解48h后,它们的降解率分别为73.78±16.74%、64.80±10.31%、73.07±9.13%、74.08±11.54%和74.73±8.30%。当初始毒死蜱含量为0.1μg/mL时,CM17复合菌剂、CD53菌剂、LS14菌剂、TD21菌剂和CD52菌剂对毒死蜱的降解率分别为91.58%、70.68%、79.25%、65%和66.6%;当初始毒死蜱含量为900μg/mL时,其降解率分别为70.53%、32.11%、61.04%、35.11%、52.10%。初始毒死蜱含量与菌株对毒死蜱的生物降解率之间呈负相关关系,初始毒死蜱含量越高,毒死蜱的生物降解率将会越低,较高含量的毒死蜱对菌株存在一定程度的毒害作用。CD53、LS14、TD21、CD52与CM17复合菌系对毒死蜱的降解的F-TEST差异程度分别为0.9523、0.1511、0.7952和0.1535,在对毒死蜱的生物降解作用上,CM17复合菌系各菌株之间协同作用关系不显着,其中CD52,LS14对毒死蜱都具有较好的生物降解作用。各菌株对毒死蜱降解作用强弱次序为CD52>LS14>TD21>CD53;复合菌系在降解毒死蜱时,各菌株对毒死蜱的协同降解作用不显着。⑸设叁个堆体(对照CK、接入CM17复合菌剂的堆体、接入市场常见菌剂NG的堆体),以农田蔬菜秸秆等有机废弃物作为原料,通过调节物料C/N在25:1~35:1之间、含水率在65%左右,pH在7-8之间,进行42d的堆肥发酵试验。结果发现相比于对照CK堆体,CM17堆体和NG堆体的全氮、全磷、全钾、容重,总孔隙度和持水孔隙度分别是CK堆体的126%、120%、119%、84%、115%、117%和140%、133%、119%、81%、121%、122%,并且升温较快,高温持续时间长,最高温度分别是61℃、63℃,CK堆体才53℃;在堆肥过程中,叁个堆体的酸碱变化值都在中性及弱碱性范围波动,EC值、TN值、NH+4-N、NO-3-N、游离氨基酸等的含量变化趋势基本相似,42d发酵结束时,腐殖酸含量分别为13.1%、14.9%、15.7%。上述结果表明CM17复合菌剂能有效地促进和优化堆肥过程,迅速提高堆体温度,延长高温期时间,缩短腐熟周期,并能提高堆肥品质,增加N、P、K等的含量。⑹CM17复合微生物菌剂是具有毒死蜱降解能力和纤维素分解能力的多功能复合微生物菌剂,可应用于毒死蜱污染的有机物及土壤的无毒化修复,也可用于有机废弃物的堆肥腐熟还田,对堆肥化生物修复有机污染技术的应用具有重要的研究意义。
钱博[8]2007年在《毒死蜱高效降解细菌的筛选及其降解特性研究》文中进行了进一步梳理本研究以有机磷杀虫剂毒死蜱作为研究对象,采用微生物的富集分离法筛选毒死蜱的高效降解细菌,最终选定XZ-3菌株作为研究对象,并对该菌株进行了形态学、生理生化及16S rDNA鉴定,对降解微生物的富集分离,环境条件对XZ-3菌株降解能力的影响以及该菌降解酶的降解特性等方面进行了系统的讨论,同时研究了土壤中蚯蚓对毒死蜱的降解效果以及毒死蜱对蚯蚓生理指标的影响,主要研究内容如下:1.介绍了毒死蜱的理化性质、国内外应用概况,以及由于其应用所带来的环境污染问题;在对前人工作总结分析的基础上,对毒死蜱在环境介质中的残留动态、降解代谢、生态毒理及微生物降解进行了综述;研究了蚯蚓对土壤中毒死蜱的降解效果;进而提出了作者要研究的问题。2.通过富集培养法和直接培养法筛选出数株毒死蜱的高效降解菌,同时研究实验室筛选出的其他降解菌对毒死蜱的降解效果,最终获得叁株毒死蜱的高效降解细菌:XZ-3、XZ-4、QZ-11,叁株菌在30℃、pH 7.0,48h内对50mg?L-1的毒死蜱均达到70%以上,其中以XZ-3对毒死蜱的降解率最高,经过对其形态、生理生化特征及16S rDNA的分析,鉴定为节杆菌属(Arthrobacter sp.),最终选定毒死蜱高效降解细菌XZ-3作为下一步深入研究的菌株。3.测定了不同碳源、pH、温度及毒死蜱浓度对细菌降解能力和生长量的影响。结果表明,该菌株24h内对100mg?L-1毒死蜱的降解率高达86.8%;在外加碳源浓度为0.3%时降解率最大;细菌的生长量随着外加碳源浓度的升高而增加;pH在偏酸和偏碱性的条件下降解率较大,pH 9.0时达到最大,细菌的生长量在pH 8.0～10.0偏碱性的条件下较大;在毒死蜱浓度为100mg?L-1时降解率最大;该菌具有较强的抗药性,当毒死蜱浓度达到1000mg?L-1时仍能生长,细菌的生长量在800mg?L-1时达到最大,绝对去除量随毒死蜱浓度的提高而增加;细菌的生长和降解需要适宜的温度,30℃培养时,降解率和生长量最大。4.从高效降解细菌XZ-3中提取了降解酶,初步研究了该降解酶的分离条件及对毒死蜱的降解特性。研究表明,其胞内酶对毒死蜱的降解率高达50.5%,细胞碎片对毒死蜱的降解率为34.9%,胞外酶液对毒死蜱的降解率为24.2%,经几次非诱导条件下培养提取粗酶液,酶活力损失较少,判断XZ-3菌株的毒死蜱降解酶为胞内酶且属于组成酶。以牛血清白蛋白为标准蛋白测得粗提酶中可溶性蛋白的含量为1.894mg?mL-1;该酶对毒死蜱的酶促降解最适pH为9.0;最适温度为30℃,在实验温度范围20～40℃内该降解酶均具有较好的降解活性。测得粗提酶中其米氏常数Km为0.8633mmol?L-1,Vmax为0.2411μmol? (mg?min)-1;该酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,对热和pH均具有较好的耐受力。5.设置两个处理,一个处理是加药不加蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓Eisenia foetida)的CK,另一个处理是向含农药毒死蜱的土壤中加入蚯蚓,研究土壤中加入蚯蚓对毒死蜱的降解效果同时考察毒死蜱对蚯蚓生理指标的影响。通过研究土壤中添加毒死蜱前后蚯蚓体重的变化得出,除了第10d的蚯蚓总体重大于第0d外,整体来说,蚯蚓的总体重是随着时间的增加而减少的。另一方面,随着时间的增加,由于蚯蚓的作用使得土壤中毒死蜱的降解率升高,说明通过在土壤中加入典型动物蚯蚓可以对毒死蜱的降解起到一定的促进作用。
李镜[9]2009年在《堆肥中毒死蜱降解菌的筛选及其产生物表面活性剂研究》文中认为本研究采用微生物富集分离方法,从农业好氧堆肥中筛选得到4株高效降解菌株,对菌株做了形态学及生理生化鉴定,系统的研究了环境条件对菌株降解能力的影响及各种降解特征。同时探讨了菌株产生物表面活性剂的性能,重点选取菌株BS-2为研究对象,找到了菌株的最佳培养条件,明确了所产生的表面活性剂的种类。主要研究内容如下:1.通过富集培养法筛选出4株毒死蜱高效降解菌株:BS-2、BS-4、BS-5、BS-6,4株菌在培养7d内对200mg·L~(-1)的毒死蜱的降解率分别为82.9%、73.7%、72.2%和71.9%,生理生化鉴定结果表明此4株菌分属为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),假单胞菌属(Pseudomomae sp.),哈夫尼菌属(Hafnia sp.)不动菌属(Azomonas sp.)。2.测定了不同外加碳源、氮源、接种量、pH、温度对菌株降解能力和生长量的影响,当对环境条件进行优化后,4株菌株对200mg·L~(-1)毒死蜱的降解率分别由82.9%、73.7%、72.2%和71.9%提高到89.7%、84.5%、85.4%和88.9%,说明环境条件对菌株降解能力有较大影响。3.通过发酵培养发现4株菌株都能将发酵液的表面张力降到40 mN·m~(-1)以下,选取菌株BS-2做进一步研究表明,该菌株对堆肥极端环境具有良好的耐受性;通过优化培养,得到该菌株的最佳培养条件为:可溶性淀粉25.0 g·L~(-1),NH4NO3 8.0 g·L~(-1),KH_2PO_4 2.0 g·L~(-1),K2HPO_4 2.5 g·L~(-1),KCl 1.1g·L~(-1),NaCl 1.1g·L~(-1) MgSO_4 0.15 g·L~(-1),FeSO_4·7H20 5×10-5 g·L~(-1),EDTA 1.0 g·L~(-1),酵母浸膏0.2 g·L~(-1),初始pH值7.0,温度30℃,摇床转速150r·min~(-1),发酵培养3d;对该菌株所提取的表面活性物质进行薄层层析(TLC)分析和红外光谱(FT-IR)分析表明,其所产生的生物表面活性物质为一环脂肽类似物。该脂肽类纯品能将纯水的表面活性由72.3mN·m~(-1)降低到29.9mN·m~(-1),水溶液的CMC值为0.139g·L~(-1),达到一般化学表面活性剂的水平,具有良好的表面活性及应用价值。
蒋秋悦[10]2015年在《毒死蜱降解菌的分离、鉴定以及联合植物促生菌对土壤的改良》文中指出土壤污染已经成为全球关注的热点环境问题之一,而农药污染又是土壤污染中的最为普遍的现象。毒死蜱是一种中等毒性的有机磷农药,它可以有效应用于农业与城市害虫的防治,但在土壤中残留时间较长,会造成土壤污染等一系列问题。本文借鉴国内外学者的相关研究经验,筛选得到了能高效降解有机磷农药的土壤细菌,并联合PGPR细菌进行了对污染土壤改良效果、促进植物生长等研究,这些研究初步证实复合土壤改良剂对农药污染土壤改良的可行性。从金山大田植物根际土壤和园艺土壤中,经过筛选排重后,共得到11株毒死蜱降解菌。经16S r DNA测序,BLAST比对,初步鉴定菌株属于伯克氏菌属(Burkholderia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、肠杆菌属(Enterobacter)。其中,伯克氏菌属CD5和CD7菌株能在培养基和土壤中高效降解毒死蜱。盆栽实验证实了CD5和CD7菌株对植物生长、土壤酶活性均具有促进作用,其中CD7菌株的促进效果较明显。菌株CD7与JD37按1:1配比时,可以促进植物生长,并能在25天内降解土壤中约66.43%毒死蜱。进一步研究发现,载体用量相同的条件下,蚯蚓粪比滑石粉吸附更多混合菌体,吸附率达77.43%,在室温保存1个月后仍能维持活菌数约为4.81×107cfu/g;载体和土壤1:1配比时对植物生长、土壤酶活性与土壤微生物数量的提高效果最明显。PGPR菌株JD37的全基因组测序与生物信息学分析表明,JD37菌株具有促生与生防作用,并能有效定殖在植物根际。对相关基因进行挖掘共找到5类金属抗性基因、2类温度-休克抗性基因、5类细菌运动基因和4类植物根际定殖基因;共预测到31个次级代谢合成基因簇,其中具有功能的占35.48%。将JD37、CD7菌株按1:1配比混匀后添加至含蚯蚓粪制备成固体剂型复合土壤改良剂应用于盆栽试验。数据显示,施用土壤改良剂之后,处理组Ⅰ(8周动态检测后播种小青菜)、处理组Ⅱ(直接播种小青菜)均具有促进植物生长,较好维持各时期土壤微生物数量,提高土壤酶活性等作用。2个处理组中毒死蜱浓度分别降至238.98mg/L和208.98mg/L。上述试验结果表明,将筛选得到的毒死蜱降解菌与PGPR菌株JD37联合,连同载体一起制备的复合土壤改良剂对植物生长具有促生效果,对土壤酶活性有提升作用,还能降低土壤中毒死蜱的含量,细菌全基因组测序与生物信息学分析验证了PGPR菌株在土壤改良剂中发挥的作用,这些研究为将该土壤改良剂应用于农药污染土壤修复、促进农作物生长奠定了基础。
参考文献：
[1]. 毒死蜱降解微生物的筛选及其降解特性研究[D]. 王金花. 山东农业大学. 2004
[2]. 毒死蜱降解菌的分离、筛选及其降解条件的优化[D]. 李文华. 山东农业大学. 2013
[3]. 粗酶和固定化酶对毒死蜱降解特性研究[D]. 谢慧. 山东农业大学. 2005
[4]. 有机磷农药残留高效降解微生物的筛选、鉴定及降解机理研究[D]. 徐刚明. 山东农业大学. 2007
[5]. 毒死蜱降解细菌的筛选、降解特性及其固定化研究[D]. 段海明. 山东农业大学. 2011
[6]. 毒死蜱农药降解菌及其降解特性的研究[D]. 任明. 山东师范大学. 2010
[7]. 复合微生物秸秆腐熟菌剂的筛选及其对毒死蜱残留的影响[D]. 肖艳萍. 云南农业大学. 2017
[8]. 毒死蜱高效降解细菌的筛选及其降解特性研究[D]. 钱博. 山东农业大学. 2007
[9]. 堆肥中毒死蜱降解菌的筛选及其产生物表面活性剂研究[D]. 李镜. 湖南大学. 2009
[10]. 毒死蜱降解菌的分离、鉴定以及联合植物促生菌对土壤的改良[D]. 蒋秋悦. 上海师范大学. 2015
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