田露[1]2003年在《小分子与核酸、蛋白质作用过程的压电传感研究》文中进行了进一步梳理压电体声波传感器作为一种有前途的传感装置，具有灵敏度高、响应谱广、操作简单和方便适时的优点。本论文将压电传感技术用于生物化学和生物医药领域，就DNA、蛋白质在固-液界面上的物理化学过程以及它们与小分子的相互作用方面开展了一系列探索性工作，取得了一些创新成果。本论文的主要研究工作如下： 1．基于质量响应的压电石英晶体阻抗(PQCI)技术具有过程分析的特点，首次实时监测了活化博莱霉素诱导DNA的断裂。在H_2O_2和Fe~(3+)存在下，DNA修饰的压电传感器和博莱霉素溶液接触。根据实验确定了体系的pH、离子强度、博莱霉素溶液浓度和Fe~(3+)的浓度等最佳的反应条件。其它抗生素，如头孢拉定、链霉素、青霉素G、强力霉素、乙酰螺旋霉素的实验结果表明它们没有表现出和博莱霉素同样切割DNA的行为。 2．压电石英晶体阻抗分析用于抗癌抗生素，如丝裂霉素、博莱霉素，和DNA之间相互作用的动力学研究。实验结果表明抗癌抗生素的浓度在相互作用中有一定影响。理论推导出一种适合抗癌抗生素和DNA之间相互作用的准一级动力学模型以描述该过程。通过把实验数据对模型进行拟合，分别得到了两个体系的动力学参数k_(MMC)为4.56(±0.02)×10~(-3)(mM)~(-1)·s~(-1)和k_(BLM)为9.11(±0.02)(mM)~(-1)·s~(-1)。 3．应用石英晶体微天平技术对左旋延胡索乙素(L-THP)与人血清白蛋白(HSA)的反应进行实时监测。通过叁步法将HSA修饰在金电极表面。根据实验确定了体系的pH、离子强度、L-THP溶液浓度等最佳的反应条件。将不同温度下的频移数据对已导出的模型进行拟合，并分别得到其动力学参数k'，g_r和△f_(0,max)。根据阿仑尼乌斯公式，我们计算得出该过程的活化能(19.57 kJ·mol~(-1))。 4．应用石英晶体阻抗分析对人血清白蛋白在羟磷灰石修饰银电极上的吸附过程进行原位监测。用等价线路参数变化说明吸附过程。首次运用残差分析将一级动力学模型与二级连续步骤的动力学模型相比较，并最终确定二级模型以描述该过程，将频移的实验数据对该模型进行拟合并得到了动力学参数k_1，k_2，ψ_1，ψ_2和q_r的值。根据阿仑尼乌斯公式，得到了吸附过程两步的活化能(7.19 kJ·mol~(-1)。和22.89 kJ·mol~(-1))。
毛友安[2]2002年在《核酸、蛋白质物化过程和聚合物性质压电传感研究》文中研究表明压电石英晶体体声波传感器具有响应谱广、灵敏度高、易实现数字化等独特优点。本论文将压电传感技术用于生物分析化学和聚合物科学领域，在DNA、蛋白质在固-液界面上的物理化学过程研究和聚合物分析表征方面开展了一系列探索性工作，取得了一系列很有价值的研究成果。本论文的主要研究工作如下。 1．提出了用压电石英晶体阻抗分析技术(PQCI)实时监测小分子诱导DNA与蛋白质交联形成过程的新方法，并用这种新方法监测了甲醛诱导下DNA与溶菌酶的交联反应过程。基于对PQCI技术提供的多维信息的分析，定量研究了交联过程的动力学，首次报道了交联反应过程的动力学参数，如交联结合过程的结合速率常数和解离速率常数，以及交联反应的平衡常数。 2．提出了用PQCI技术实时监测以DNA为靶标的药物分子与DNA结合过程的新方法，并用这种新方法监测了抗癌药物米托蒽醌与固定在压电传感器表面上的双股小牛胸腺DNA的结合过程。DNA的固定采用逐层自组装方法。基于对PQCI多维信息的分析，定量研究了结合过程的动力学。得到的结合平衡常数与文献值合理地一致。首次报道了结合过程的结合速率常数和解离速率常数。 3．从理论上推导出了一个描述蛋白质在固一液界面上吸附过程的动力学的压电响应模型，用PQCI技术监测了人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)从pH 7.4的缓冲溶液(PBS)中吸附到裸银电极和聚苯乙烯修饰电极表面的过程，以及溶菌酶吸附到裸银电极和巯基乙酸修饰电极表面的过程。利用压电响应模型拟合了吸附过程中频移响应的实验数据。结果表明，HSA和溶菌酶的吸附过程可以用包含两步反应的动力学方程来描述。对BSA吸附过程而言，在其浓度较低时，吸附只涉及第一步反应；浓度较高时，在聚苯乙烯修饰表面上的吸附过程包含两步反应。通过数学拟合，本文得到了这些吸附过程的反应速率常数。所得到的数据显示出这些蛋白质在不同条件下吸附过程动力学上的差别。 4．提出了用PQCI技术实时监测药物小分子与蛋白质结合过程的新方法，并用这种新方法监测了盐酸小檗碱与BSA的结合过程，定量研究了结合过程的动力学，首次报道了该结合反应过程的动力学参数，如结合速率常数、解离速率常数和结合反应平衡常数。 5．提出了用串联式压电石英晶体传感技术(SPQC)研究离子型表面活性剂与蛋白质之间相互作用过程的新方法，并用这种新方法研究了溴化十六烷基叁甲基铵和十二烷基磺酸钠与溶菌酶在水溶液中的相互作用过程。与表面张力法、 湖 南 大 学 博 士 学 位 论 文FTJR法和圆二色性法相比，新方法优点在于实验装置和实验操作简单，分析成本低；与电导法相比，新方法具有较高的灵敏度。 6，提出了一种测定聚合物粘均分子量的新方法一流过式压电石英晶体粘度传感技术，构建了带有流动检测池的实验装置，并用这种新方法测定了未知聚乙烯醇（PVAL）试样的分子量。结果表明，新方法较之传统的毛细管粘度计法，具有明显的优点，如简便快速、仪器价廉便携、可用于连续测定等。 7．基于压电传感器对与其接触的聚合物稀溶液的粘度变化的动态电阻响应，提出了一种研究聚合物分子间热力学相互作用的新方法，并用这种新方法研究了聚乙二醇（PEG）与 PVAL之间的相互作用，得到了该聚合物共混体系的热力学系数之值。结果表明，这两种聚合物分子间存在吸引性相互作用。新方法的一个重要特征是可以用于连续测定。
陈欢[3]2008年在《基于脂质体纳米粒子的生物传感器在生化分析中的应用》文中进行了进一步梳理霍乱是一种严重的传播广泛的流行性疾病,大多数霍乱病例发生在不发达国家,已成为世界上亟待解决的一个严重公共卫生问题。霍乱毒素是霍乱弧菌分泌的一种蛋白质肠毒素,是霍乱弧菌的一个典型生物标记物,所以对霍乱毒素的快速、超灵敏检测对霍乱流行病的防疫、控制和治疗具有十分重要的意义。近年来,前列腺癌已经成为成年男性群体中一项常见癌症,且危害严重。目前临床上对癌症标记物的检测方法普遍操作复杂、仪器昂贵且需要专业技能。从而需要开发更加简便、灵敏、定量准确且易于临床推广的生物传感技术。此外,地中海贫血又称海洋性贫血,是由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致的一组遗传性溶血性贫血。该病以地中海沿岸国家和东南亚各国多见,我国长江以南各省均有报道,以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高,是非常严重的遗传性疾病。故开发灵敏、准确的基因单碱基突变检测方法,对地中海贫血症的诊断有很大意义。利用化学与生物传感技术检测疾病标志物,进行临床疾病的准确、快速诊断以及流行病的现场筛查与群体监控,是当前医学上既新颖又极具吸引力的热门研究课题之一。近年来,纳米材料得到广泛的研究与应用,研究表明将纳米材料应用于生物传感器的制备可以较大的提高传感器的响应性能。脂质体是一种在水相中由磷脂双分子定向排列而成的直径几纳米至几微米的超微粒子。脂质体纳米粒子可以通过内部包埋或表面修饰方法成为多功能团分子的通用载体且具有良好的生物相容性,本论文将不同功能化的脂质体用作生物传感界面的构建和信号放大探针,并与相适宜的检测手段联用,构建了一系列基于脂质体的新型生物传感器。纳米金制备简单,比表面积大,生物相容性好,是固定生物分子常用的有效载体。有文献报道,电极表面通过自组装纳米金层固定抗体,可以大大增加电极表面积和抗体固定量,同时保持抗体活性,是很好的传感界面修饰方法。另外,碳纳米管具有隧道效应、特殊的电化学、光化学等物化性质,是目前科研领域中最热门的一维纳米材料之一。碳纳米管的功能化修饰是将其应用于生物体系必须解决的一个关键问题。DNA修饰碳纳米管的研究为碳纳米管在基因检测中的应用提供了科学基础和强有力的技术支撑。本论文以霍乱毒素,甲胎蛋白,前列腺特异性抗原等重大疾病标志物为检测对象,构建了一系列基于脂质体纳米颗粒的生物传感器(第1部分)。具体内容包括:(1)首次研制了一种基于脂质体的压电免疫凝集检测(PEIA)技术用于对人免疫球蛋白(hIgG)和甲胎蛋白(AFP)的直接定量检测。以脂质体替代传统胶乳颗粒标记抗体,并采用牛血清白蛋白修饰压电探针,直接对脂质体颗粒免疫凝集所引起的溶液粘弹性变化进行响应。其定量检测hIgG的浓度范围为0.05～6μg mL-1;将之用于临床样品分析,定量能力与经典的ELISA法相接近。用所构建的生物传感器对AFP实际临床样品检测,结果证明该方法应用于临床医学检测的可行性。与经典的质量型压电免疫检测技术相比,这种基于脂质体的压电免疫凝集检测(PEIA)无需在石英晶振表面固定抗原或抗体,具有简单、快捷、可再生的检测优势。(2)开发了一种基于神经节苷脂(GM1)识别和脂质体界面凝集的压电生物传感技术对霍乱毒素进行快速、定量检测。石英晶振传感界面修饰含GM1的支撑磷脂膜,检测介质中含有GM1修饰的脂质体颗粒,这两者构建了压电界面凝集生物传感器。目标物霍乱毒素会引起检测介质中GM1修饰的脂质体在含有GM1的传感界面上发生特异性凝集,同时引起晶体表面巨大的质量负载和溶液粘弹性的变化,结合了压电质量效应和非质量效应,与传统模式的压电频率响应信号相比放大了数倍,具有响应快速、可再生的优势。其定量检测霍乱毒素的浓度范围为0.1～5?μg mL-1,检测下限达到25 ng mL-1。(3)提出了一种以脂质体为信号放大载体的酶催化增强化学发光传感技术对霍乱毒素的超灵敏检测。用含GM1的支撑磷脂膜为生物传感界面检测目标物霍乱毒素,再用表面修饰了GM1受体和辣根过氧化物(HRP)酶的脂质体为检测探针对目标物夹心检测。最后利用HRP酶为催化剂,对碘苯酚为增强剂的增强化学发光法对霍乱毒素进行定量检测。本传感器实现了对霍乱毒素的超灵敏检测,检测下限可达到0.8 pg mL-1,同时具有简单、可再生的优势。将传感器用于血清样品分析,其检测结果与ELISA试剂盒检测结果相一致。(4)发展了一种基于包酶脂质体的化学发光生物传感技术对前列腺癌特异性抗原的超灵敏检测。以表面修饰了抗体、内部包被HRP酶的脂质体替代传统酶标抗体对界面识别的抗原夹心检测,并采用表面活性剂释放所固定脂质体中的酶分子,用增强化学发光试剂盒放大酶催化化学发光强度,间接检测前列腺特异性抗原。实现了对目标物的超灵敏检测,检测下限可达到4 pg mL-1。在第一部分中,不同形式和性能的功能化脂质体被合理运用,并结合使用多种检测方法,提高了生物传感器的分析性能。此外,我们还构建了几种基于其他纳米粒子的电化学生物传感技术,其中纳米粒子被用于生物分子的固定或检测探针的制备(第2部分)。纳米金比表面积大,生物相容性好,是固定生物分子常用的有效载体。具体内容包括:(5)构建了一种以纳米金颗粒为固定化材料和多步信号放大探针的电化学阻抗免疫传感器对hIgG的超灵敏检测。将纳米金颗粒自组装于己二硫醇修饰的金电极表面,利用纳米金层吸附抗体,构建了一种纳米金界面吸附的生物分子固定化方法。信号放大步骤为:用纳米金标记的抗体做为第一步放大探针,然后分别用纳米金标记的二抗和纳米金标记的抗体交替反应,进行多步信号放大。基于纳米金界面固定抗体,具有抗体固定量大、免疫活性强、操作稳定性高等优点。基于纳米金的信号放大技术极大的提高了传感器的灵敏度,对目标物hIgG的线性检测范围为15.3～328.3 ng L-1。(6)通过自组装纳米金层固定具有碱基突变识别能力的MutS蛋白,MutS蛋白能捕获含碱基突变的DNA双链并以亚甲基兰在DNA双链中的嵌入作为电化学响应信号来检测单碱基突变核酸链。该方法成功地实现了对β-地中海贫血症基因的-28位点的单个碱基突变的识别,检测限达到5.66×10-13 M,对点突变的检测具有快速、灵敏度高、成本低的特点。对实际样品的两步检测方法可实现样品的基因分型,即将样品分类为变异杂合子,野生纯合子和变异纯合子。(7)单壁碳纳米管具有隧道效应、特殊的电化学、光化学等物化性质,将其作为纳米材料探针与电化学方法联用可以超灵敏的检测核酸单链,构建了新型的核酸检测方法。检测原理:将单壁碳纳米管与核酸检测探针混合机械超声,制备核酸检测探针修饰的水溶液分散的单壁碳纳米管。与目标DNA链的杂交反应会使检测探针解离离开碳管表面,裸露的单壁碳纳米管继而吸附在疏水的电极表面,由于其特有的隧道效应使原本绝缘的电极导通,从而检测到氧化还原电子对在电极表面实现电子传递的电化学信号。背景非特性吸附不能产生隧道效应,故检测背景极低,实现了对目标核酸单链的超灵敏测定,线性范围为6.9 pM～50 nM。
宋维玲[4]2015年在《基于等温酶循环放大技术的DNA生物传感分析及应用研究》文中研究表明本文采用石英晶体微天平及荧光光谱分析检测方法,基于核酸适体与目标分子的高亲和力以及特异性识别作用,结合纳米金生物条码技术及核酸聚合酶、内切酶等工具酶的自身特性,构建了基于酶循环信号放大方法、DNA自组装信号放大方法、滚环复制与自组装循环放大相结合、等温链置换放大方法以及滚环复制放大方法,实现了生物小分子、基因及DNA甲基化酶等肿瘤标志物的高灵敏及高选择性检测。主要内容如下:1、构建了新型的石英晶体微天平传感器,结合DNA酶循环放大方法实现了对ATP的高灵敏检测。将适体的特异性识别作用与DNA酶循环放大相结合,以纳米金生物条码作为信号探针,通过链替代聚合反应,将信号探针与修饰在芯片表面的捕获探针相结合,使检测信号显着增强,以生物小分子ATP为靶分子,检测限达1.3 n M。利用核酸适体的特异性识别特点,提高了检测的选择性,并将该方法用于肿瘤细胞(Ramos)中ATP含量的测定,进一步验证了检测系统的实用性。该方法灵敏度高,选择性好,适用于复杂生物样品中ATP的选择性分析,为生物学研究、基于检测以及肿瘤的早期诊断提供了有效的分析手段。2、提出了自组装杂交链式反应放大的石英晶体微天平检测DNA的新方法。将自组装杂交链式反应与生物催化沉淀技术相结合,增大了芯片表面的质量,提高了检测灵敏度。通过芯片结合的靶DNA引发杂交链式反应,进一步进行生物催化沉淀,从而将少量的靶DNA转化成大量的沉淀物,放大检测信号,采用石英晶体微天平技术实现了靶DNA的高灵敏检测,检测限达5×10-11M。检测系统采用捕获探针修饰芯片,提高了系统的选择性,减小了非特异性吸附,有望用于单核苷酸多态性方面的研究。3、基于等温循环链置换聚合扩增技术,设计了ATP高灵敏检测的荧光传感系统。通过靶分子与适体的特异性识别作用引发链置换聚合反应,在DNA酶的作用下,一个链置换聚合反应的产物作为另一个反应的催化链,形成了DNA循环放大网络,提高了反应的放大效率,以ATP为目标分析物,荧光探针为检测信号,实现了ATP的快速、灵敏检测,检测限达2.6×10-10 M。成功应用于人血清实际样品中ATP的分析。该方法适用范围广、选择性强、操作便捷,在生物检测方面具有潜在的应用价值。4、构建了一种新型DNA级联循环放大分子机器,并将其成功应用于DNA的高灵敏检测。通过靶DNA的杂交互补反应引发模板增强杂交过程(TEHP),在DNA工具酶的作用下发生滚环复制放大反应(RCA),生成大量的具有重复序列的产物,在剪切酶作用下RCA产物引发发卡催化自组装循环反应(CHA),同时将模板链与靶释放出来形成源头循环。通过DNA级联循环放大,释放大量的荧光探针,极大地增强了荧光检测信号,从而实现了对DNA的高灵敏检测。DNA的检测限为1.2×10-18 M,系统中引入模板增强杂交过程,提高了靶DNA的选择性,为基因检测提供了有效的分析手段。5、提出了一种基于滚环复制放大技术荧光检测DNA甲基化酶的新方法。通过DNA甲基化反应生成DNA短链,该链作为RCA的前体与环状模板结合,在聚合酶作用下发生滚环复制放大反应,将荧光信号探针与带有大量重复序列的滚环复制的长链相结合,使检测信号显着增强,对DNA甲基化酶的检测限可达0.6 U/m L。运用该方法对抗癌药物的抑制效果进行研究,有望用于抗癌药物的筛选,通过检测DNA甲基化水平的变化在癌症早期风险评估及分子诊断治疗方面具有潜在应用价值。
费月华[5]2011年在《基于发夹探针基因突变点分析与DNA修饰检测小分子》文中研究表明单碱基多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是遗传变异中最丰富的形式，人类30亿碱基当中每100-300个碱基就可能出现一次单碱基突变。实现对这些基因单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认，对于很多疾病的发病机理研究及早期诊断治疗非常重要。因此开发一些易于操作、价格低廉且又精确有效的DNA传感技术意义重大。发夹型核酸探针由于具有灵敏度高，特异性好等优点已经被广泛应用于生物传感器的制备。近年来，科学家们通过改变经典分子信标的结构，已提出了许多新型的检测方法。本文中，我们通过对发夹探针的重新设计，发展了两种新颖的DNA传感技术。此外，我们通过DNA修饰转换信号，实现了对小分子目标物的灵敏检测。主要内容如下：(1)巧妙设计了一条植入酶切位点的具有发夹结构的寡聚核苷酸链，实现了一种简单、有效的DNA压电检测方法。其特点在于结合使用核酸内切酶(ECoR I)及纳米金标记的检测探针，能够很好的降低背景值并有效增强信号。方案如下：在电极表面固定具有酶切位点的发夹探针，当待测体系中含有目标DNA时，发夹探针可以通过与目标链杂交打开，导致内切酶对其没有作用，从而实现纳米金沉积放大作用；反之，在没有目标链时，发夹探针被特异性酶切，无法继续反应，便没有信号产生。实验结果表明，此方法是一种简单实用、选择性高、灵敏度较高的适用于DNA分析检测的技术。此外，通过共用ECoR I和目标序列，我们还设计了一种用亚甲基蓝作指示剂的电化学方法，进一步验证了我们实验体系的实用性，为基因突变点分析提供了一种新的思路。(第二章)(2)提出了一种单步可重复的检测DNA单碱基突变的电化学分子开关。实验中采用了一条标记二茂铁的具有发夹结构的寡聚核苷酸链，当与目标链杂交打开发夹后被修饰有捕获探针的电极捕获从而拉近电活性物质二茂铁产生很强的电流信号，成功构建了一种信号打开型的电化学传感器。这一方法在基因突变导致α-地贫的分析检测中得到了实际应用，成功检测了染色体末端142编码子(HbConstant Spring codon142)单碱基突变(TAA→CAA)的存在，取得了令人满意的实验结果。检测下限为0.01pM，在0.01到100pM的目标DNA浓度范围里面，电流信号与目标物浓度对数呈现良好的线性关系，结果表明，此方法是一种简单快速而且比较灵敏的适用于单碱基突变检测的技术，具有较强的通用性。(第叁章)(3)实现了一种基于DNA修饰的小分子目标物检测方法，该法应用了一条修饰了目标小分子的巯基化的杂交链，当加入含有目标物β-吲哚乙酸(IAA)的样品预先反应一段时间后，样品中的游离IAA可以跟反应液中的IAA抗体蛋白相结合，从而阻碍后续反应抗体与衍生的IAA的结合，于是巯基化的衍生链可以自组装到石英晶振(QCM)表面，接下来通过杂交反应和生物素-亲和素作用引入辣根过氧化酶，通过酶催化沉积作用产生增强的压电信号响应。此方法不仅比传统的方法更有效灵敏地监测了IAA与抗体的结合作用以及定量分析IAA，而且这个新颖的理念为我们以后检测其他的小分子提供了一个新的平台。实验结果表明，此方法是一种价格低廉、选择性高、灵敏度高的适用于小分子目标物分析检测的技术。(第四章)
张留德[6]2002年在《生物大分子的涂饰、反应机理及其在压电生物传感器中的应用》文中认为生物大分子的涂饰对生命物质的检测、分离和提纯有着很重要的作用，尤其是在各种生物传感器的构制中一直是人们的研究热点。如何有效、简单、方便、快捷地进行生物大分子敏感膜的修饰是在构制生物传感器时首先要考虑的问题。而作为一种很有发展前途的传感器件，压电体声波传感器具有高灵敏度、宽响应谱、价格低廉、操作简单及方便适时的输出等优点；尤其是基于质量效应构制的石英晶体微天平具有很高的质量响应灵敏度，特别适合生物大分子的测定而广泛用于临床化学，药物分析，环境质量等诸多领域。本文以压电石英晶体为传感器件，从生物大分子敏感膜膜材料的选择出发，研究了两种类型的生物大分子敏感膜的性质，成功地进行了生物大分子在压电石英晶体表面的修饰。另外，本文首次应用分形反应动力学理论对压电传感器表面发生的生物大分子反应进行了初步探讨。最后，利用所讨论的两种膜本文构制了两种类型的压电生物传感器，针对人们关注的结核病和旋毛虫病首次进行了临床诊断方面的应用。具体包括以下几个方面：1． 选择了两种固定生物大分子的敏感膜：首先，从具有原料易得，成膜方法简单，可以进行表面改性等优点的聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚苯乙烯-丁二烯-苯乙烯共聚物叁种高分子中选择出成膜迅速、均匀、膜的稳定性好、响应迅速、而且易于控制涂层厚度等优点的聚苯乙烯．丁二烯-苯乙烯共聚物作为膜材料，研究了膜的性质和对生物大分子修饰的效果；另外，对具有专一性结合抗体Fc功能区的蛋白A作为中间链接层进行了膜性质、定向修饰功能、重复性方面的研究。2． 本文首次利用分形反应动力学理论来研究压电生物传感器表面发生的不均一反应并对生物大分子抗体吸附到传感器敏感膜表面，以及发生在敏感膜表面的抗原抗体反应进行初步研究；提出了在压电石英晶体表面发生的大分子吸附反应或抗原抗体反应的动力学反应模型；对实验进行了应用，获得了较好的拟合结果，验证了模型。 叁．基于所讨论的两种敏感膜，本文构制了两种类型的压电生物传感器。 一种是基于SBS膜固定抗体的压电气相兔疫技术，我们利用该技术首 次对结核病和旋毛虫病分别进行了快速诊断：另一种是基于蛋白A定 向修饰抗体的压电液相兔疫传感技术，我们利用该技术首次对结核病 进行了诊断。
孔荣梅[7]2011年在《基于纳米金和酶切信号放大的生物传感分析方法及应用研究》文中进行了进一步梳理随着分析科学的不断发展,生命科学领域中的各种分析和检测过程越来越多地需要要借助于生物传感技术获取所需的信息。生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点,在化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域有重要的应用价值。理想的生物传感器对目标物应该具有非常高的检测灵敏度(低检测限),高特异性(低干扰)宽的动力学检测范围,快速响应时间,以及通用性等特点。功能核酸是基于体外筛选或指数富集配体系统进化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX),筛选得到的与生物小分子、蛋白质分子、细胞、金属离子等高亲和力和高特异性结合的DNA或RNA片段。功能核酸通常包括两大类具有特殊功能的核酸分子：一类具有类似于蛋白酶的催化活性,称为DNA酶(DNAzymes),另一类能够像抗体一样特异性结合目标分子,称为核酸适配体(Aptamer)。功能核酸的发现突破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识,为构建用于各种分析对象的生物传感体系提供了全新的设计思路和平台。灵敏度是衡量生物传感器性能的最重要参数之一,而单纯利用功能核酸结合目标物前后构象变化引起信号的改变,在进一步提高灵敏度方面已经十分有限。近年来,设计新的信号放大方法用于目标物的高灵敏检测已经引起了研究人员的广泛关注。提高传感器灵敏度的方法通常有两种,一种是降低检测背景,另外种是采用信号放大技术。其中,由于信号放大技术在提高灵敏度方面的显着效果,近年来受到了研究者更为广泛的关注基于以上考虑,综合文献报道,本文主要利用信号放大技术在提高生物传感器的检测灵敏度方面做了一些工作,主要内容如下：(1)基于纳米金信号放大技术的生物传感器的研究。利用纳米金比表面积大、具有良好生物相容性以及表面核酸高负载量的特点,在第2章提出了一种基于‘T-Hg2+-T”特异性强结合作用和纳米金信号放大的新型非标记Hg2+电化学传感器。在Hg2+存在的条件下,连接DNA与电极表面的捕获探针通过“T-Hg2+-T”相互杂交,然后引入纳米金功能化的信号DNA与连接DNA另外一端序列杂交。以亚甲基蓝作为电活性物质,由于纳米金功能化信号DNA的引入能够放大检测信号,因此当进行DPV检测时,可得到明显增强的电化学信号。该方法可获得0.5nM的检测限,且选择性好、操作简单,并可用于实际样品的检测。在第3章,我们基于利用距离决定电磁场(EM)增强作用的指数减弱,即拉曼标记物离纳米粒子表面越近,Raman信号越强的原理,发展了一种基于树枝状纳米分子结信号放大技术的新型SERS传感器。以基于GR-5DNA酶的Pb2+SERS传感器和基于核酸适配体的腺苷SERS传感器作为分析模型,验证了通过层层自组装形成纳米分子实现拉曼信号放大的可行性,以及该设计策略的通用性。为了构建Pb2+SERS传感器,首先将巯基标记的GR-5DNA酶组装在金电极表面,当Pb2+存在时,能够催化镶嵌在该DNA酶底物链中RNA碱基的水解,使其被剪切为两部分。金电极表面剩余的核酸片段部分可以和纳米金标记的报告探针链杂交,通过层层自组装,纳米金之间形成了纳米结,拉曼信号得到显着增强,对Pb2+检测限可达0.1nM。为了检测腺苷,采用目标导致链置换构建核酸适配体SERS传感器。核酸适配体首先与金电极表面的捕获探针互补杂交被固定在电极表面,当腺苷存在时,与核酸适配体发生特异性结合,导致其构型发生变化,从电极表面脱落。然后,捕获探针可以和纳米金标记的报告探针链杂交,同样通过层层自组装形成纳米结,从而导致拉曼信号的显着增强。该传感器具有较好的选择性,检测下限为50nM。(2)基于酶切循环信号放大技术的生物传感器的研究。基于核酸切口酶能够识别特异性的双链序列而只酶切其中一条单链从而可以实现循环信号放大的特点,在第4章利用分子信标低背景、高灵敏的优点提出了一种新型、能够实现目标诱导酶切循环信号放大过程的“Y型”探针用于高灵敏检测目标DNA,该探针同时具有较强的单碱基错配识别能力。当目标DNA存在时,可以和辅助探针协同打开分子信标的发夹型结构,叁者相互杂交形成“Y型”结构,从而形成了切口酶Nt.BbvCI的识别序列。分子信标被核酸切口酶识别切断后,从传感系统上游离释放出来。释放出的辅助探针和目标DNA可以继续和另外一个分子信标进行杂交,同时诱发第二次酶切循环。经多次酶切循环反应后,实现了真正的目标DNA诱发酶切循环信号放大,与第一代基于中间标记的直线型信号探针构建的“Y型”探针相比更加灵敏,检测下限为5pM。在第5章,我们采用将分子识别和信号报告基团进行分离的设计策略,避免了对DNA酶进行修饰,并采用酶切循环信号放大技术构建了一种新型荧光催化信标,显着提高了对目标物的检测灵敏度。以L-组氨酸作为分析模型,采用DNA酶链和底物链以聚T连接的一体化DNA酶作为识别基团,L-组氨酸导致底物链酶切后的产物序列能够与作为信号报告基团的分子信标杂交,进一步采用核酸切口酶实现酶切循环信号放大,实现了对目标物的高灵敏和特异性检测,检测限为200nM。由于DNA酶具有可以循环剪切的性质,也可以用于酶切信号放大技术。在第6章,我们利用连接反应触发DNA酶和催化分子信标信号放大技术,提出了一种零背景、高灵敏的小分子检测方法。以ATP和NAD+作为分析模型,利用DNA连接酶对生物小分子的高特异性依赖,以连接反应触发劈开DNA酶的激活,然后与设计为分子信标的底物链杂交,在Zn2+存在的条件下进行DNA酶的酶切循环反应,实现了对生物小分子高灵敏、高特异性的荧光检测,其灵敏度和特异性均优于以前所报道的传感器。(3)基于纳米金和酶切循环双信号放大的生物传感器的研究。基于核酸外切酶和纳米金双重信号放大策略,在第7章提出了一种非标型、高灵敏、高特异性电化学DNA传感器。该传感器首先在均相中进行发夹型探针和目标DNA之间的杂交及酶切反应,避免了电极表面进行酶切所遇到的酶效率降低等缺点,而且该发夹型探针能够提供较好的碱基错配识别能力；然后将酶切产物序列与电极表面的发夹型捕获探针杂交,进一步提高了碱基错配识别能力；最后利用纳米金功能化的报告探针进行信号放大,以亚甲基蓝为电活性物质,实现了对目标DNA的高灵敏和高特异性电化学检测,检测限为0.6pM。
连琰[8]2014年在《新型微电极串联压电传感器在生物分析中的应用研究》文中研究说明生物传感器应用生物体、微生物、细胞或生物物质作为敏感元件，感知外界的物理或化学的刺激，从而产生各类生理参数的响应或物理与化学参数的响应，传感器接收并感受这些响应并作出评价。生物传感器及其检测技术，不仅可以应用于微生物学研究，还可以应用于生物代谢研究，也可以应用于细胞生物学研究以及为药理学与毒理学研究提供科学有效的方法，因此生物传感被广泛地应用于临床诊断、药物功能与毒性分析、环境毒物监测、食品安全分析与生物产品质量控制相关领域。在生物传感研究上，多年来本实验室主要以压电传感作为本实验组的研究方向并取得了一定的工作进展也得到了相当的积累。因此在本文中，首先介绍了压电传感器的发展现状及发展方向：质量敏感型方向和非常量的串联压电电化学型方向。接着详细介绍了本实验室的研究工作，即串联压电生物传感器的相关工作与成果。之后，在对电极串联压电传感的研究基础之上，提出了由微型电极与压电晶体串联构建灵敏的压电生物传感器。本论文主要开展了几种微型电极的设计、仿真计算与优化、加工与其电学参数的检测与研究以及构建传感器检测实验研究。首先设计了几种不同尺寸规格的平行叉指电极，进行多物理场仿真计算，并对叉指电极与对电极的电场分布进行对比较，仿真结果表明叉指电极这种交替嵌入结构的电场分布比传统平行板对电极具有更强的电场强度与更集中的电场分布，因此叉指电极对其检测对象有更高的传质效率。然后，以叉指电极构建叉指电极串联压电生物传感器对实际生物样本进行实验研究，结果表明，叉指电极构建的压电生物传感器比对电极构建的压电生物传感器具有更高的灵敏度。此外通过对叉指电极进行修饰操作构建了溶菌酶为分析目标的生物蛋白的分析。实验结果也表明在高选择性高灵敏度的生物分子识别与分析上也取得了成功。由于叉指电极为平面分布的对称电极，能更好的进行表面修饰处理，从而使得其在特殊功能改造上更具有独特的优点与便利。最后，基于对叉指电极仿真研究的结果分析，本文提出了环状电极的设想，设计加工了多种不同尺寸的环状电极，并对其电极面上方空间电场进行仿真计算，结果表明环状电极的电场分布比平行的叉指电极更加合理，根据模拟样本实验检测，结果表明，增加环数能显着提高传感器的灵敏度。在得到仿真结论绵基础上，利用优化的电极与压电晶体串联构建了串联压电细胞传感器，测试了传感器的等效电路及压电理论模型及参数。应用该细胞传感器对宫颈癌Hela细胞进行了在线培养监测。通过对传感器稳定性的实验、Hela细胞生长监测及外源药物实验，研究结果均表明，该传感器具备高灵敏度地适时在线监测细胞生长监测与药物分析功能。本论文的创新点：通过多物理场软件仿真串联电极电场分布，探科学合理的电极几何尺寸。根据仿真结果设计加工了多种不同形状的串联电极，并结合压电传感理论构建了不同的串联压电传感器，进行了压电传感器等效电路的分析与检测，提出了不同压电传感器的压电频移关系式。此外还进行了实际生物样本的在线监测，结果表明根据仿真结果设计的串联电极并以此构建的压电传感器能很好地满足实际生物样本分析要求。
刘善超[9]2005年在《核酸、蛋白质相互作用研究及毛细管电泳电化学发光的应用》文中研究表明近年来,社会发展的需求对生命科学和人类环境方面的研究提出了更高的要求,同时也提供了广阔的发展空间。新的发展空间为分析化学创造了新的机遇。这就要求分析化学不仅仅在知识体系上为科学研究提供理论基础,还要从分析手段上为科学研究提供方便。压电化学生物传感器是把化学、生物敏感元件固定在压电石英晶片上而组成的一种新型的传感器,是分析化学的一个重要的研究领域。它具有结构简单、响应广谱、检测快速、灵敏度高、可实时在线测定以及费用低廉等特点。毛细管电泳是现代分析化学研究的前沿领域之一。这种技术因具有高效、快速、微量和易于自动化等特点而在短短的几十年中得到了蓬勃的发展。鉴于这些特点,压电生物传感和毛细管电泳技术已在化学和生物界引起人们愈来愈多的兴趣。目前,其研究方向涉及到生命科学分析、环境监测、医学诊断、军事监控、食品卫生、材料应用以及工业生产等诸多领域。基于上述技术,本文主要开展以下几个方面的工作:1.用压电阻抗技术(PQCI)和电化学技术研究了抗癌药物卡铂诱导下生物大分子DNA和蛋白质之间的相互作用,并根据阻抗分析仪获得的多维参数,比如f0,Rm,C0等,推导了DNA-protein相互作用过程的动力学模型以及交联过程的动力学参数。并且,利用电化学循环伏安和交流阻抗技术对这个反应过程进行了佐证。2.基于电化学、压电阻抗以及UV-vis等多种技术表征了中草药诱导下DNA和蛋白质的相互作用过程。3.采用毛细管电泳电化学发光技术(CE-ECL)测定了除草剂苯噻草胺的含量,考察了影响发光强度的因素比如进样时间、进样高压、施加电压、溶液的pH等。苯噻草胺在1.07×10-8-5.0×10-7 M的范围内和发光强度有很好的线性关系,最低检测限为4.0×10-9 M。这种技术成功地用于检测了苯噻草胺在土壤和稻谷的残留量。
封科军[10]2008年在《基因检测和点突变识别的DNA探针及适配体生物传感新方法研究》文中研究说明随着人类基因组计划的完成和功能蛋白质组学的研究进展,建立简单、灵敏、快速、特异性强、高通量的蛋白质和基因检测方法,已成为分析科学家们研究的重点之一。核酸碱基的突变与人类许多疾病有着直接的关系,因此实现单核苷酸突变准确灵敏的检测对疾病的早期诊断也有着重要的意义。核酸适配体是近年来发展起来的一类经体外人工进化程序筛选出的寡聚核苷酸。由于其不但和抗体一样能与配体高效、特异性地结合,而且具有许多抗体无法比拟的优点,因此将核酸适配体应用于生物传感器实现对包括蛋白质、小分子等目标物的检测有着巨大的发展潜力。鉴于电化学及压电检测技术所需仪器简单、检测成本低、易于实现微型化,且灵敏度较高等优点,本研究论文针对当前传感器设计中的探针固定化和检测方法两个关键技术,在电化学及压电DNA传感器用于基因检测和点突变识别以及电化学适配体传感器两方面开展了一些新方法研究工作。具体内容如下:(1)在第2章中,研制出一种新型的基于纳米多孔CeO2/壳聚糖复合膜的固定基质。用它来固定单链DNA探针,构建了检测与结肠癌高度相关的基因序列的电化学DNA生物传感器。该固定基质制备方法简单,成本低,结合了CeO2和壳聚糖的优点,具有良好的生物兼容性,无毒性和优越的电子传导性。将其用于固定结肠癌基因的互补探针序列,能够显着增强ssDNA探针在电极表面的负载量。制得的传感器检测目标的线性范围在1.6×10-11-1.2×10-7 M,检测下限为1.0×10-11 M,具有识别完全互补目标序列和四碱基错配序列的能力。(2)在第3章中,基于连接酶的高保真性和生物催化沉积反应,提出了用于高特异性识别单碱基突变的压电检测方法。实验中,目标DNA链先与连接在石英晶振上的DNA捕获探针杂交,再与生物素标记的等位特异性DNA检测探针杂交。只有在目标DNA链和检测探针完全匹配时,连接反应才能发生,即将捕获探针和检测探针相连接。否则,即使只有一个等位错配的基因,连接反应也不会发生。经过高温热处理,形成的双链解开,只有与目标链完全匹配的检测探针保留在电极表面。生物素化的检测探针继而与链酶亲和素化的辣根过氧化物(SA-HRP)绑定,辣根过氧化物催化过氧化氢氧化底物中的3, 3–二氨基联苯胺(DAB)在电极表面生成不溶性沉淀物,使压电频率响应显着增大。用该方法对β-地中海贫血基因-28位密码子的突变情况进行了检测,使突变型和野生型得到了很好的区分,对目标的检测线性范围为0.7-100 nM,检测下限达0.1 nM,是一个低成本高效率的检测方法。(3)在第4章中,基于等位基因特异性延伸法,结合酶催化银沉积的放大体系,提出了用于单碱基突变的电化学检测方法。首先,在金电极表面固定的等位特异性捕获探针。由于其与野生型目标链完全互补,在聚合酶的作用下能够发生延伸反应;而突变型目标链由于3’端与捕获探针发生错配,延伸反应不能进行,从而实现对突变型和野生型基因的区分。用1 M NaOH进行解链处理后,双链结构解开,目标链从电极表面脱落。在电极表面滴加与探针延伸部分相互补的生物素化的检测探针后,只有发生延伸反应的捕获探针链会进一步与生物素化的检测探针杂交,并引入链亲和素化的碱性磷酸酶,继而发生酶催化沉积银的反应。通过线性扫描伏安法可以检测出电极表面沉积的银。该方法成功用于β-地中海贫血基因-28位密码子单碱基突变的区分和定量检测,简单、快速、灵敏度高,线性范围为3.0×10-16-3.0×10-8 M,检测下限为1.0×10-16 M。(4)在第5章中,报道了基于目标物诱导置换适配体的无标记电化学传感器,用于以腺苷为分析物模型的目标物检测。该传感器使用1,6-巯基己醇自组装层修饰的金电极为传感基底,以巯基己醇为媒介组装金纳米颗粒层,能够增加巯基捕获探针的表面负载量,提高信号强度。含有腺苷适配体序列的一段寡核苷酸序列一部分可与捕获探针杂交,在电极表面形成捕获探针与适配体的双链复合物。含有腺苷的分析物的加入,把腺苷适配体序列置换下来,使其从电极表面解离,从而减少了电极表面核酸链的数量,使与核酸作用的电化学活性指示剂亚甲基蓝的量相应减少。指示剂的还原电流的大小能够反映被分析物的浓度。构造的传感器简单、快速、灵敏、选择性好,线形范围为5-1000 nM,检测下限为1 nM,同时具有简便快速的再生能力。(5)在第6章中,报道了基于抗体与生物素标记的适配体新型夹心的酶放大电化学免疫传感器,用于免疫球蛋白E(IgE)的检测。IgE多克隆抗体作为捕获探针通过半胱胺自组装层以及交联剂戊二醛的作用共价固定在金电极表面,与目标物发生免疫反应后,继续捕获生物素化的IgE适配体的检测探针,从而形成一种新型的夹心结构。之后,通过生物素与亲和素的特异性亲和作用,亲和素标记的碱性磷酸酯酶能与电极表面适配体上的生物素相结合,促使碱性磷酸酯酶催化底物抗坏血酸磷酸酯水解成强还原剂抗坏血酸,并将底液中的银离子还原成单质银,沉积到电极表面。沉积的银的量与电极表面捕获的目标IgE的量成正比,可以用溶出伏安法来定量。结果表明,该免疫传感器结合了抗体和适配体的双重特异性,并利用了酶催化银沉积体系的高灵敏性,检测目标蛋白的灵敏度高、特异性好,线性范围为0.1-100 nM,检测下限为0.02 nM。(6)第7章,同样基于抗体与适配体的新型夹心结构,构建了纳米金/壳聚糖电化学沉积复合膜的新型固定基质用于抗体的固定,采用亚甲基蓝为电活性指示剂,报道了检测凝血酶的无标记电化学方法。该复合膜结合了纳米金和壳聚糖独特的性能,提高了传感器的导电性能以及负载量。实验考察了纳米金/壳聚糖电化学沉积条件,并用扫描电子显微镜对该膜进行了表征。在这个工作中,在不改变适配体与目标物结合作用的基础上,对原凝血酶的适配体序列进行了适当延伸,以提高亚甲基蓝嵌入适配体中的量,增强信号响应。传感器构造方法简单、价格低廉,无需对探针进行任何修饰,凝血酶的线性响应范围是1-60 nM,检测下限为0.5 nM。
参考文献：
[1]. 小分子与核酸、蛋白质作用过程的压电传感研究[D]. 田露. 湖南大学. 2003
[2]. 核酸、蛋白质物化过程和聚合物性质压电传感研究[D]. 毛友安. 湖南大学. 2002
[3]. 基于脂质体纳米粒子的生物传感器在生化分析中的应用[D]. 陈欢. 湖南大学. 2008
[4]. 基于等温酶循环放大技术的DNA生物传感分析及应用研究[D]. 宋维玲. 青岛科技大学. 2015
[5]. 基于发夹探针基因突变点分析与DNA修饰检测小分子[D]. 费月华. 湖南大学. 2011
[6]. 生物大分子的涂饰、反应机理及其在压电生物传感器中的应用[D]. 张留德. 湖南大学. 2002
[7]. 基于纳米金和酶切信号放大的生物传感分析方法及应用研究[D]. 孔荣梅. 湖南大学. 2011
[8]. 新型微电极串联压电传感器在生物分析中的应用研究[D]. 连琰. 湖南大学. 2014
[9]. 核酸、蛋白质相互作用研究及毛细管电泳电化学发光的应用[D]. 刘善超. 湖南大学. 2005
[10]. 基因检测和点突变识别的DNA探针及适配体生物传感新方法研究[D]. 封科军. 湖南大学. 2008
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