杨树钢 叶建新 林建安
（福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区 福建福州 350004）
【摘要】目的：研究利用siRNA方法基因沉默人结肠癌SW480细胞dcr3基因的表达，并观察受基因沉默后人结肠癌SW480细胞体外增殖情况。方法：利用脂质体将siRNA转染进入人结肠癌SW480细胞系，在细胞内形成小干扰双链RNA，识别并降解dcr3 mRNA。通过MTT法检测人结肠癌SW480细胞的增殖抑制情况。结果：siRNA方法基因沉默人结肠癌SW480细胞dcr3基因后，其细胞增殖率降低（P＜0.05）结论: siRNA方法基因沉默人结肠癌SW480细胞dcr3基因的表达后，细胞增殖率降低。
【关键词】dcr3 RNA干扰技术 基因沉默 人结肠癌SW480细胞系
【中图分类号】R735.3+5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）01-0124-02
DCR3(decoy receptor 3)诱骗受体3，1998年Pitti 等发现的一种TNFR超家族成员，并命名为DCR3(decoy receptor 3)，它在部分正常组织及血清中少量表达，在恶性肿瘤组织中特异性表达，表达水平与肿瘤恶性程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤浸润和转移有关[1][2]。有研究发现，DCR3在调节细胞增殖、凋亡中起重要作用[3]。RNA干扰技术是将与信使RNA(messenger RNA，mRNA)对应的外源性小片段RNA导入细胞，与该片段siRNA同源的mRNA发生特异性降解，导致其相应的基因受到抑制的技术，在剔除目标基因上具有特异性、稳定性及高效性等优势，正成为包括结肠癌在内各种肿瘤基因治疗研究中的热点[4]。本研究利用siRNA方法基因沉默人结肠癌SW480细胞dcr3基因的表达，并观察受基因沉默后人结肠癌SW480细胞体外增殖情况。
1.材料与方法
1.1材料 人结肠癌细胞株SW480购于中国典型培养物保藏中心，RPMI-1640培养基和小牛血清购自GIBCO公司，Purified anti-human dcr3抗体购自Santa公司，转染试剂LipofectamineTM2000 和青霉素-链霉素液体购自Invitrogen公司，MTT购自Sigama公司
DcR3-siRNA由上海吉玛制药有限公司合成。DcR3的siRNA干扰序列如所示:
DcR3的siRNA 正义链 反义链
①DcR3-179
5’GUACGCGGAGUGGCAGAAATT3’ 5’UUUCUGCCACUCCGCGUACTT3’
②DcR3-641
5’CUCAAUGUGCCAGGCUCUUTT3’ 5’AAGAGCCUGGCACAUUGAGTT3’
③DcR3-1027
5’CCCUCUUAUUUAUUCUACATT3’ 5’UGUAGAAUAAAUAAGAGGGTT3’
1.2方法
1.2.1细胞培养 采用含体积分数10 %小牛血清的RPMI1640培养基培养，细胞为贴壁生长细胞。细胞传代时用质量分数0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1︰2或1︰3传代，加入培养液后在37℃，体积分数5%的CO2孵箱中培养。
1.2.2转染 转染前一天收集3～5×105细胞接种在6孔板上，2mL含小牛血清的RP1640细胞培养基，将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温放置20min,以便形成siRNA/lipofectamin复合物。将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞2遍后，加入2mL无血清培养基，将500μLsiRNA/lipofectamin复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻摇细胞培养板，孵育4～6h后，除去复合物，更换培养基，细胞继续在体积分数CO2培养箱中37℃温育24～48h后，进行转染后的其他检测步骤。
1.2.3细胞生长增殖抑制率 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法，待测细胞经胰酶消化后，调节细胞浓度约为5.0～10×104?mL-1；以每5.0～1.0×103个细胞接种于4个96孔培养板中，每孔体积约100 ?L。设6个复孔，分别培养12、24、48、72 h后，每孔加入20 ?L MTT（5 g/L），继续培养4 h，加200 mLDMSO，放置水平摇床15 min后，在?=490nm处测定吸光度（A）。
细胞生长抑制率=[（对照组-处理组）/(对照组-本底)]×100%
1.3统计学处理 运用SPSS13.0进行统计处理，计量资料统计结果以x-±s表示，对组间差异进行t检验和单因素方差分析，检验水准 α=0.05。
2.结果
各组转染后对SW480细胞的增殖抑制情况，经统计分析，DCR3沉默组比对照组、脂质体组及nc组的细胞增殖抑制作用明显，在24h和48h时差别有显著性意义（P<0.05），但由于时间延长，本实验为瞬转，siRNA脱靶效应，抑制率逐渐下降。
3.讨论
结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化。我国结肠癌的发病率和死亡率均保持上升的趋势[5]。目前，肿瘤外科治疗、放射治疗和内科治疗相结合的个体化综合治疗是提高结直肠癌治疗水平所推崇的模式。最近十年，分子靶向治疗是肿瘤研究最活跃的领域引起很高的重视，而分子靶向介导的抑制肿瘤细胞的信号传导通路，促进肿瘤细胞凋亡是目前研究的一个热点，是目前分子靶向药物的主要作用效应。作为靶向治疗新的靶点DCR3(decoy receptor 3)诱骗受体3，1998年Pitti 等发现的一种TNFR超家族成员，并命名为DCR3(decoy receptor 3) ，它在部分正常组织及血清中少量表达，在恶性肿瘤组织中特异性表达，表达水平与肿瘤恶性程度、肿瘤大小、临床分期、肿瘤浸润和转移有关[1] [2]。有研究发现，DCR3在调节细胞增殖、凋亡中起重要作用，DCR3一方面能与死亡因子FasL特异性结合，并抑制其与死亡受体Fas的结合，从而阻断配体诱导产生的细胞凋亡，使恶性肿瘤细胞逃避FasL依赖的免疫细胞毒攻击；另方面可能与肿瘤坏死因子超家族成员LIGHT紧密结合，抑制其与受体HVEM／TR2和LTI3R 的相互结合，阻断LIGHT介导产生的细胞凋亡，有助于恶性肿瘤细胞的免疫逃逸[1][3]。
RNAi是近年发展起来的沉默基因的新技术，是目前分子生物学研究领域的热点之一其是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，通过具有序列特异性的双链RNA（Double- stranded RNA，dsRNA）或shRNA与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调，RNAi具有高稳定性，高效性，高特异性等特点，目前RNA干扰在癌基因组功能研究和肿瘤基因治疗中已显示出效果。由于肿瘤基因治疗较少涉及伦理问题，加之临床治疗的迫切需要，肿瘤发生的分子机制及其基因治疗也已走在基因治疗的前列。
本实验将靶点DCR3和 RNAi技术相结合，利用siRNA方法基因沉默人结肠癌SW480细胞dcr3基因的表达，并通过MTT法观察受基因沉默后人结肠癌SW480细胞体外增殖情况。本文结果显示，以DCR3为靶点的 RNA干扰能明显抑制 SW480人结肠癌细胞的增值。本实验为结肠癌的基因沉默疗法提供了新的思路，以DCR3基因为靶基因的RNA干扰技术由基础到临床的应用提供理论依据。
参考文献
[1] Pitti RM ，Marsters SA，Lawrence DA，et a1.Genomic amplification of a decay receptor for Fas ligand in lung and colon cancer[J].Nature，1998，396：699—703.
[2] Bai C，Connolly B，Metzker ML，et a1.Overexpression of M68／DcR3 in human gastrointestinal tract tumors independent of gene amplifica tion and its location in a four—gene cluster.Proc Nail Acad Sci USA，2000.97(3)：1230?1235.
[3] Yu KY，Kwon B，Ni J，et a1.A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily(TR6) suppresses LIGHT-mediated apoptosis [J].J Biol Chem，1999，274(2O)：13733—1 3736.
[4] 冯作化，药立波，周春燕，等.医学分子生物学[M].北京：人民卫生出版社, 2007:172,314
[5] 曾益新.肿瘤学 [M] 北京：人民卫生出版社 第2版2003:536-559
论文作者:杨树钢,叶建新,林建安
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第1期供稿
论文发表时间:2014-4-3
标签：细胞论文; 基因论文; 肿瘤论文; 结肠癌论文; 沉默论文; 培养基论文; 转染论文; 《医药前沿》2014年第1期供稿论文;