张敬敬龚琳周鹏刘佳（通讯作者）
（湖南长沙医学院基础医学院410219）
【摘要】目的：研究人参皂苷对小鼠成纤维细胞生长和衰老的影响。方法：自新生昆明小鼠身上分离培养成纤维细胞，加入不同浓度的人参皂苷，观察细胞生长曲线，MTT法分析细胞活力。结果：中浓度人参皂苷可以在传代后6-12d显著增加活细胞。结论：一定浓度的人参皂苷可以延迟细胞进入衰老和死亡状态。
【关键词】人参皂苷；成纤维细胞；衰老；生长
【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）07-0041-03
AntagonisticeffectofGinsenosideonfibroblastsenescenceZhangJingjing,GongLin,ZhouPeng,LiuJia.BasicMedicalCollegeofChangshaMedicalCollege,Hu’nanProvinceChangsha410219,China
【Abstract】Objective:Studiesinmicefibroblastgrowthginsenosidesandtheeffectsofaging.Methods:Sincethenewkunmingmicefibroblastcultivation,addingdifferentconcentrationsofginsengsaponin,observethecellgrowthcurve,cellvitalitydeterminedbyMTTmethod.Results:Concentrationofginsengsaponincanbeinbatchesafter6to12dasignificantincreaseinlivingcells.Conclusions:Acertainconcentrationofginsengsaponincandelaycellsintoaginganddeath.
【Keywords】Ginsengsaponin;Fibroblasts;Aging;Growth
从古至今，中药人参备受推崇，被誉为“中药之王”。近年来研究者们确认了人参具有抑制中枢疲劳、抗肿瘤、抗辐射等作用[1]。本课题组通过前期动物实验，已经证实了人参皂苷在一定程度上具有抗衰老作用[2]。人参皂苷抗生物老化是否与直接影响细胞有关，本课题侧重于探索人参皂苷对小鼠成纤维细胞生长和衰老的影响。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1动物SPF级昆明小鼠，体重(22±2)g，雄性小鼠10只和雌性小鼠20只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，批号43004700008689，长沙医学院湖南省重点建设学科标准动物室饲养。雄雌小鼠按1：2合笼，常规饲养。
1.1.2主要试剂及仪器人参皂苷（宏久生物科技公司）、DMEM培养液（Hyclone公司）、胎牛血清（四季青公司）、0.25％胰蛋白酶（Sigma公司），其他试剂为分析纯。倒置显微镜（德国MOTIC）、细胞培养箱（Thermo公司）、低速离心机（Beckman公司）。
1.2方法
1.2.1乳鼠成纤维细胞分离与培养取出生12h以内的乳鼠，处死后75%酒精浸泡消毒后，取其背部皮肤酒精浸泡消毒，以无Ca2+Mg2+PBS漂洗皮肤，将皮肤剪成1mm2大小均匀平贴于培养瓶中，瓶底朝上倒置5min后翻转，加DEME完全培养基37℃、5%CO2条件下充湿培养，24h后再加入足量的培养基继续培养，每2天换1次培养液，1周后将组织块去除。传代培养则根据细胞自身生长速度，融合达60％-70％时用胰蛋白酶消化，镜下观察细胞回缩成近圆形时终止消化，以l:2比例传代培养，约开始为3-4d传一代，逐渐延长为5-9d传一代。
1.2.2细胞处理待细胞第8次传代，细胞用DMEM洗一次后，加入含有人参皂苷的DMEM和10％胎牛血清，高、中、低三个浓度组人参皂苷的最终浓度分别为100、10、1mg／dl，未加人参皂苷的细胞为空白对照，连续培养至15代。
1.2.3细胞生长曲线取第15代成纤维细胞，以（10×105）／ml的细胞密度接种于24孔板，继续加入人参皂苷培养，每个浓度均置6个平行孔，用台盼蓝拒染法，每2d将各浓度的1孔以胰蛋白酶消化脱落下来后计存活细胞数，共计12d,以所获活细胞数绘制细胞生长曲线。
1.2.4MTT实验取第15代各组成纤维细胞，以（10×105）／ml的细胞密度接种于96孔板，每组设12平行孔。5％CO2、37℃充湿培养72h，离心去上清，每孔加入MTT至终浓度为0.5mg／ml，作用4h后每孔各加入100μlDMSO充分振荡，用酶标仪检测570nm波长处的吸光度（A）值，计算相对存活率（A实验组/A空白对照×100%），重复2次（n=24）。
1.3统计学方法
采用SPSS19软件进行数据分析处理，数据以x±s表示，采用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。
2.结果
2.1成纤维细胞生长曲线
由图1可知，人参皂苷高中低三个浓度组和空白对照组第细胞生长曲线趋势较一致，即在传代3-4d后开始进入较为快速的生长分裂期，此时期大概维持4d，第8d后细胞基本停止了分裂，进入平台维持期，拒染的活细胞数目稍有下降，提示衰老死亡细胞数目增多。数值上分析，人参皂苷低浓度组和空白对照组差别不显著，曲线几乎重合。人参皂苷中浓度组前6d与对照组无显著差别，但是6d到10d细胞数目逐步多于对照组，即使第12d活细胞数目减少也不显著，活细胞数远高于其他各组。高浓度组则持续处于分裂受抑制状态，细胞增加慢，活细胞数也较快下降，提示该浓度人参皂苷已经对细胞生长具有显著反作用。
2.2MTT实验
如表1所示，人参皂苷中浓度组与空白对照相比，细胞的相对存活率为121%（P<0.05），提示中浓度的人参皂苷能显著延缓成纤维细胞的衰老和死亡，但是人参皂苷浓度过高时，细胞存活率显著降低，说明其对于细胞生长有明显的压制作用，这两组与空白对照的差别具有统计学意义。
3.结论
小鼠成纤维细胞正常的分裂次数约莫只有20多次，本实验采用的昆明小鼠比野生鼠类寿命短，细胞生长和分裂速度快，实验所采用的第16代细胞已经是处于“中晚年”的细胞，是较为适合的细胞模型。加入一定浓度的人参皂苷，发现细胞能较长时间维持其分裂能力，并且较晚的出现衰老及死亡现象，说明人参皂苷也能直接影响细胞的生命活动，这也许是人参皂苷对动物能抗衰老和延寿的原因之一。
本课题组围绕人参皂苷进行的一系列抗衰老、抗氧化和抗疲劳实验也发现，高浓度和长时间使用人参皂苷并无更好效果，本实验中高浓度的人参皂苷甚至抑制细胞的正常生长。因此，有人推崇的人参可以“久服，轻身延年”，这种用法未必科学。
【参考文献】
[1]张翼轸，张文驹，穆青等.人参化学成分的药理活性及其含量积累的研究进展[J].安徽农业科学，2011，39（20）：12158-12163.
[2]李珊珊，刘佳，袁婧等.人参皂苷对亚急性衰老小鼠的认知能力及脑组织MDA含量的影响[J].中国保健营养，2013，05（上）：2281-2282.
基金项目：湖南省教育厅科学研究项目(13C1131).
论文作者:张敬敬龚琳周鹏刘佳（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/7/2
标签：人参论文; 细胞论文; 皂苷论文; 浓度论文; 小鼠论文; 纤维论文; 衰老论文; 《医药前沿》2015年第7期供稿论文;