侯文胜[1]2004年在《小麦蓝色胚乳相关cDNA序列的分离鉴定》文中提出本研究以小麦蓝粒单体附加系为材料，构建了相关cDNA文库和抑制差减文库，并分离鉴定了一些与小麦蓝色胚乳表达相关的特异性cDNA序列，其目的是阐明小麦蓝色胚乳性状表达的遗传基础和发现相关基因。研究获得以下主要结果：1．利用蓝粒小麦未成熟种子mRNA构建了蓝粒相关cDNA文库，最终获得的未扩增文库约含1.2×10~6个克隆子；对部分文库扩增后获得的文库滴度约为2×10~9pfu／ml。2．构建了小麦蓝色胚乳表达相关基因的抑制差减文库，文库约含10000个克隆子，插入片段多集中在100-500bp之间，平均长度约300bp。3．筛选获得了16个阳性克隆子，序列分析发现：(1)9个cDNA序列在GenBank上能找到同源较高的相关序列，其中3涉及小麦醇溶蛋白基因序列、1个涉及小麦低分子量谷蛋白亚基，这些基因在小麦种子中一般表达较强，假阳性的可能性较大；另外5个cDNA序列可能分别涉及单氧化酶基因、丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和与小麦籽粒硬度相关的基因序列，以及2个功能未知的小麦、水稻DNA序列，它们可能与蓝粒性状的表达有一定的相关性；(2)7个cDNA序列在GenBank上没有找到较为匹配的序列，分析认为这些序列可能与小麦蓝色胚乳性状的表达有关，而且没有相关的研究报道，可能涉及新的功能基因。4．对4个候选cDNA序列的表达特异性分析发现：与玉米P450单氧化酶基因相关的cDNA序列3及功能未知的cDNA序列15在蓝白粒未成熟种子间差异表达，在蓝粒未成熟种子中的表达明显增强，说明它们可能与蓝粒性状的表达相关；功能未知的cDNA序列14、16在蓝粒未成熟种子中特异性表达，可能代表了与蓝色胚乳表达高度相关的基因。
高东尧[2]2010年在《小麦穗发芽抗性相关Vp-1B和AIP2基因的克隆及功能分析》文中研究说明小麦成熟期穗发芽不仅影响产量,而且严重影响小麦品质,是世界性的自然灾害。本研究以叁种不同穗发芽抗性小麦:中优9507(感穗发芽,Vp-1Ba)、西农979(中抗,Vp-1Bc,83 bp缺失)、永川白麦(高抗,Vp-1Bb,193 bp插入)为研究材料,分离得到小麦中与穗发芽抗性相关的Vp-1B和AIP2基因,并对其表达特性和基因功能进行了初步分析和鉴定。Vp-1(Viviparous-1)是调节胚发育,促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子。利用叁种抗性不同的小麦材料,分离了Vp-1B叁个等位基因的基因组及cDNA序列,在进行表达分析、核定位分析的基础上,采用Gateway技术分别构建了含有叁种DNA序列、永川白麦cDNA序列的pLeela高效表达载体,通过农杆菌介导法,分别将其转入拟南芥突变体abi3-1中。结果表明:转基因各株系种子的GI值、ABA敏感性、转基因株系的花期时间及叶数与对照相比均有变化,结合Real-time方法检测ABA传导途径中基因表达的变化,结果说明小麦Vp-1B基因的导入抑制了abi3-1突变体中ABI1、ABI2基因的表达,同时激活了ABI5基因的表达;转基因株系表现出营养生长期延长,花期推迟;同时,对ABA的敏感性增强,转基因种子的GI值降低。转入的四种序列中,功能最强的是YCCVp-1B基因;叁种基因组序列中,功能较强的是YCGVp-1B序列,说明插入和缺失影响了小麦Vp-1B基因的功能。AIP2(ABI3-interacting protein 2)基因编码蛋白可在转录后水平降解Vp-1蛋白,从而间接影响穗发芽抗性。本文采用RACE技术结合电子序列拼接的方法首次从小麦中分离得到AIP2基因的两种cDNA序列,命名为:AIP2-1、AIP2-2。表达特性分析表明两种AIP2基因表达量均随胚的成熟而呈下降趋势。在穗发芽敏感时期,AIP2-2基因在感性品种的表达量明显高于抗性品种,说明AIP2-2基因可能与穗发芽抗性相关。通过农杆菌介导法分别将其转入拟南芥突变体aip2-1中,结果表明小麦AIP2基因的转入激活了拟南芥ABI1、ABI2基因的表达,使转基因种子对ABA的敏感性减弱,GI值分析表明:转ZYAIP2-1、ZYAIP2-2基因种子发芽指数均高于突变体,与野生型相近;转ZYAIP2-2基因的种子发芽指数最高,比突变体材料提高近10%。在此基础上,以单子叶植物表达载体pAHC25为基础,构建了Vp-1B、AIP2基因的过表达,Vp-1、AIP2基因干扰表达载体,通过基因枪法分别将其转入小麦受体材料新春9号。利用Bar基因引物和基因特异引物对再生植株进行PCR检测,得到了转基因植株。通过检测T0代转基因种子GI值变化,对Vp-1B基因、AIP2基因在小麦中的功能进行了初步分析和鉴定。结合拟南芥中的分析结果,说明小麦Vp-1B、AIP2基因调节种子发育具有重要作用,对小麦品种穗发芽抗性具有重要影响。本研究将为阐明小麦穗发芽抗性机理,进而为通过分子育种进行小麦品种改良提供一定的依据和借鉴。
赵光耀[3]2006年在《小麦全长cDNA文库构建、测序与分析》文中指出作物基因组学是当今最重要的研究领域。小麦是世界上最重要的粮食作物之一,但普通小麦(T.aestivum)为异源六倍体(AABBDD),基因组庞大(1.6×10~(10)bp),重复序列多(约90%),目前还难以通过全基因组测序进行小麦功能基因组研究。全长cDNA克隆不仅包含完整的阅读框,还拥有5′和3′端的非编码区,是进行高通量的功能基因组学研究的一条有效途径。 在引进、消化吸收的基础上,我们对Cap-trapper法做了进一步的改进,形成了一套简单易行的技术体系,建立了我们自己的全长cDNA文库构建技术平台。利用改进的Cap-trapper法,分别构建了不同倍性、不同组织、不同处理的小麦全长cDNA文库10个,涉及普通小麦(AABBDD)及其叁个二倍体祖先种(AA、SS和DD)和四倍体波斯小麦(AABB)共计小麦的5个种,涉及幼苗、根、愈伤组织、花药、胚乳,并设有白粉菌诱导诱导与对照等。所建文库插入片段平均为1.5kb左右,原始文库的库容量在6.0×10~5～5.0×10~6 pfu之间,经后期测序并与GenBank公布的小麦全长mRNA序列比对分析表明克隆的全长比例为93%左右,扩增文库滴度在10~(10)pfu/ml数量级,适合于大规模测序需要,是开展小麦功能基因学研究的宝贵资源。 试验从10个全长cDNA文库随机挑取大约11万个克隆进行3'端测序,获得106,671条3'端EST,去除冗余后选择代表性克隆进行了克隆5'端测序,获得31,732条5'EST,共获得138,403条EST,得到高质量序列(Q20)数据7.46×10~7bp。在去除ployA和短于100bp的序列后获得5'EST和3'EST分别为30,586条和95,736条。经cap3软件聚类分析表明试验获得了32,899条不重复克隆。 GC含量统计表明小麦族基因cDNA序列中GC含量为54.0%,这与水稻基因组GC含量基本一致(53.4%),而与拟南芥有明显差别(40.7%);5'和3'EST比较发现5'端GC含量为57.80%,明显高于3'的GC含量(52.8%)。推测小麦基因的这种高GC含量特别是5'端高GC含量是小麦全长基因克隆和测序困难的原因之一。 将获得的32,899条不重复序列使用blast软件将比对参数E值设为le-20对879,695条小麦公共EST数据进行相似性搜索,结果表明8,800条为新的小麦EST(26,75%);使用参数1e-5对水稻32,127条全长cDNA序列比对结果表明15,992条(48.6%)序列在水稻全长cDNA中没有对应序列。同时,利用1e-20的参数对水稻1,191,102条水稻EST数据blast结果表明18,672条没有相应序列(56.75%);用该数据集对华大基因组研究所测序的水稻基因组序列blastn搜索结果表明14,382条(43.72%)在水稻基因组序列中没有对应序列(E-value 1e-5)。 密码子使用的偏爱性是生物在长期进化过程中逐渐形成的,影响偏爱性的因素有多种,如G+C含量,基因表达水平,基因的长度,tRNA的丰度等等。我们随机挑取了750条全长序列使用codonW软件对小麦密码子使用偏爱性进行了分析,统计结果表明小麦基因密码子第叁位GC含量为54%左右,与表达基因的整体GC含量一致;同时发现小麦优先使用的密码子27个,所有优先使用的密码子均以G或者C结尾,无一例外,这与水稻的情况非常一致;而拟南芥为低GC含量物种,仅为44%,所有优先使用的密码子均以A或者T结尾。说明植物进化过程中单双子叶植物分开后首先GC含量趋异非常明显,进而密码子优先使用特性也完全不同。 使用基于Linux平台的本地化分析平台系统对获得32,899条序列进行了分子功能、生物过程和细胞组分叁个层次的Gene Ontology注释,获得了小麦基因的多层次注释信息。
郭卫卫[4]2015年在《小麦籽粒高分子量谷蛋白重要调控因子的克隆及功能鉴定》文中进行了进一步梳理小麦谷蛋白作为种子储藏蛋白的重要组分,其含量和组成影响着面筋强度和面团弹性。种子发育过程中,种子储藏蛋白的合成以及储藏蛋白基因的表达都受到转录因子的严格调控；因此克隆调控谷蛋白亚基基因的转录因子对于改善小麦品质具有积极的推动作用。本论文筛选到影响小麦高分量谷蛋白亚基表达的调控因子TaGAMyb、TaGCN5、TaNAC46,并初步明确了其调控关系。取得的主要研究结果如下：1.体外结合实验表明,MYB类转录因子TaGAMyb可以结合在小麦高分子量谷蛋白亚基基因(TaGLU-1)的启动子区,并且结合位点数目多少以及结合能力强弱与谷蛋白表达相关；转化模式植物拟南芥发现,TaGAMyb可以直接结合在TaGLU-1基因启动子区促进其表达。2.酵母双杂实验筛选到TaGAMyb互作蛋白GCN5,拟南芥转化实验证实,GCN5通过TaGAMyb结合在TaGLU-1Dy基因的启动子区,并通过影响TaGLU-1Dy启动子区H3K9和H3K14的乙酰化水平参与其表达调控。小麦授粉后不同天数种子中表达分析结果表明,TaGCN5蛋白主要在发育中期和晚期的种子中表达；ChIP结果证实,小麦体内TaGCN5可以结合在TaGLU-1基因的启动子区；比较分析小麦授粉后不同天数种子中TaGLU-1Bx、TaGLU-1By、 TaGLU-1Dx、TaGLU-1Dy启动子区H3K9和H3K14乙酰化水平的变化发现,与它们的表达时期一致,说明1aGCN5可以结合在TaGLU-1基因启动子区通过影响其乙酰化水平调控小麦高分子量谷蛋白亚基基因的表达。3.体外结合实验、转拟南芥以及小麦瞬时表达实验表明,TaNAC46蛋白可以结合到TaGLU-1Dy基因启动子区促进TaGLU-1Dy基因的表达。为了进一步研究TaNAC46对于TaGLU-基因的调控作用,我们构建了TaNAC46基因的RNAi和超表达载体并转化小麦,通过小麦转基因植株TaNAC46以及TaGLU-1基因的表达分析发现,TaNAC46RNAi转基因株系中TaGLU-1基因的表达量与野生型相比显着降低,而在TaNAC46超表达小麦植株中TaGLU-1基因的表达量与野生型相比显着增加,说明小麦体内TaNAC46能够促进TaGLU-1基因的表达。同时酵母双杂实验证明了TaNAC46与TaGAMyb蛋白具有相互作用,这说明1TaNAC46可能与TaGAMyb形成一个复合体共同参与小麦高分子量谷蛋白亚基基因的表达。4.综合以上研究结果,我们提出种子发育过程中,小麦TaGAMyb通过招募组蛋白乙酰转移酶TaGCN5促进小麦高分子量谷蛋白亚基基因的表达；胚乳特异表达基因TaNAC46体外可以结合在TaGLU-1基因启动子区,并且在拟南芥和小麦体内都可以促进其表达,同时TaNAC46蛋白还可以与TaGAMyb蛋白互作,这为解析小麦高分量谷蛋白亚基基因的表达调控途径提供了新的线索。
林玉玲[5]2011年在《龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究》文中进行了进一步梳理龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国南方重要的热带亚热带木本果树,其胚胎发育状况与其果实的产量及品质密切相关。植物胚胎的发育是一个细胞分化的过程,该过程中必然有氧化胁迫的影响,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)作为抗氧化系统的第一道防线在植物胚胎的细胞分化和发育过程中起着重要作用。本研究利用龙眼体胚发生模式实验系统,在进行龙眼体胚发生过程SOD的生理生化研究的基础上,进一步进行SOD基因家族克隆及表达调控机制研究(启动子分离与功能鉴定、miRNA分离与鉴定以及相关基因和miRNA定量表达分析等),以探讨在龙眼体胚发生中SOD的作用的分子机制,并为龙眼活体胚胎发育中的SOD作用机制提供参考。主要结果如下:1.龙眼体胚发生过程中SOD酶活性变化及同工酶分析在本研究中首先对龙眼活体晚期胚胎和早期离体胚胎中的SOD活性及同工酶谱进行了初步分析。结果发现,不管是龙眼晚期活体胚胎或早期离体胚胎,随着龙眼胚胎的进一步发育,SOD的活性均呈逐渐升高趋势,说明SOD对胚性细胞的分化以及晚期胚胎发育具有促进作用。温度处理对龙眼体胚发生早期SOD活性影响较小,而对SOD同工酶谱影响较大,表现为谱带的出现与消失,其中25℃处理的龙眼胚性培养物,SOD同工酶谱条带数最多,而20℃和30℃处理的材料,表达较弱的酶谱条带消失。提示SOD活性与同工酶谱的规律变化与龙眼体胚发生早期细胞分化、超氧自由基的清除以及促使体胚正常发育有密切关系。2.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族cDNA和DNA全长的获得在酶活性测定的基础上,利用RT-PCR和RACE法从龙眼胚性愈伤组织中获得SOD基因家族20个不同mRNA转录本,它们分别编码细胞质DlCSD1a和DlCSD1b、叶绿体DlCSD2a、叶绿体DlFSD1a、DlFSD1b及线粒体DlMSD等,这是木本植物SOD首次克隆较为完整的,也是植物体胚SOD基因分离较为完整的;SOD基因家族各成员的3’UTR序列的长度都具有多态性,可能与miRNA的转录后水平调控相关;此外,还获得了DlCSD1a-4、DlCSD1a-5、DlCSD1b- variant1和DlFSD1b-variant1~ DlFSD1b-variant4等7个不同的可变剪接体,它们发生剪接的位置不尽相同,并存在各自不同的剪接模式。DlCSD1a基因基因组序列长2741 bp,含8个内含子;DlCSD1b基因长4592 bp,含6个内含子;DlCSD2a基因长3727 bp,含7个内含子;DlFSD1a基因长2171 bp,含6个内含子;DlFSD1b基因长2137 bp,含7个内含子;DlMSD基因长1589 bp,含5个内含子;所有内含子的剪切位点均符真核生物GT-AG规则。不同基因所含内含子和外显子的长度不一,其中DlCSD1b的第5个内含子、DlCSD2a的第6个内含子的长度较长,分别为3539 bp和2178 bp,长内含子的存在可能有利于产生多种mRNA分子,编码出多种功能的蛋白质。3.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族生物信息学分析根据生物信息学分析结果,龙眼胚性愈伤组织DlSODs编码的蛋白质不同成员均含有SOD典型的保守结构域,属于超氧化物歧化酶大家族的不同成员,它们在进化上具有高度保守性,在功能上也具有较大相似性,均为亲水的酸性蛋白,除DlFSD1a和DlFSD1b外,其余均为稳定蛋白。不过不同类型的SOD又具有各自特点,它们在龙眼体胚中的可能作用机理:①DlCSD1a和DlCSD1b定位于细胞质,不含信号肽,不进行跨膜运动,两者相互协调主要负责细胞质中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸的位点为辅发生磷酸化;②DlCSD2a定位于叶绿体,含有信号肽,以由叶绿体内膜到叶绿体外膜上方式进行跨膜运动,主要负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;③DlFSD1a定位于叶绿体,含有信号肽,不含跨膜结构域,可能与DlCSD2a协同作用负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化;④DlFSD1b和DlFSD1b(JF316733)可能定位于过氧化物酶体和细胞质,均不含信号肽,含2个跨膜结构域,倾向于由外到内进行跨膜运动,并以酪氨酸为主、丝氨酸及苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;⑤DlMSD定位于线粒体,不含信号肽,存在从线粒体内膜到外膜或从外膜到内膜的双向跨膜运动的2个跨膜螺旋结构域,主要负责线粒体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化。4.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族启动子克隆和功能鉴定为进一步了解SOD基因家族在转录水平上的调控作用,本研究采用Tail-PCR法和IPCR法,分别获得了DlCSD1a、DlCSD2a、DlFSD1a和DlMSD基因启动子序列,长度分别为2252 bp、164 bp、1080 bp和843 bp,其中,DlCSD1a启动子区域含有2个内含子序列。利用RLM-RACE法鉴定DlSODs基因家族的TSS,结果显示它们都含有丰富的TSS,数量从3 ~ 10个不等;5’UTR长度波动范围较大,介于11~193 bp之间;TSS碱基组成一般以A为主,其次为G和C,还少数出现T。龙眼DlSOD基因家族不同成员存在多个TSS且各TSS起始mRNA转录效率不同,暗示RNA聚合酶和调控因子在DlSOD基因家族启动子的一个较宽范围内的互作控制了转录的效率。PlantCare软件分析显示,DlCSD1a、DlCSD2a和DlFSD1a基因启动子区域中,均含有核心启动子元件和基本启动子区,但DlMSD基因5’端基础启动区缺少TATA和CAAT盒;此外,还存在大量与光响应、激素应答、环境胁迫响应、胚乳特异表达响应、细胞周期相关响应及大量的功能未知或功能特异的相关元件;另外不同成员SOD基因还存在各自功能特异的顺式元件。此外,DlCSD1a和DlFSD1a基因可能受bZIP类转录因子调控,而DlMSD可能受WRKY类转录因子的调控。在此基础上,还构建它们3’/5’不同缺失突变体的瞬时表达载体,为将来功能验证实验奠定基础。5.龙眼体胚发生过程中调控SOD基因家族的小分子RNA的分离与鉴定为了解DlSODs基因在转录后水平上的表达调控机制,本研究首先采用Solexa技术对龙眼体胚发生过程中的sRNA进行测序。结果表明:共得到Unique序列6,553,782条,其中仅13,151条序列与已知miRNAs相似;sRNA以24 nt的长度为主要存在方式;龙眼体胚发生过程中miRNA的表达丰度存在巨大差异,其中大部分为低丰度表达;总共鉴定了367个保守miRNA,构成众多家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;另外获得23个候选的新miRNA,其中有10个miRNA含单个基因座,另13个miRNA具备多个基因座。在上述基础上,结合psRNA Target预测软件和RLM-RACE法最终鉴定到调控DlSODs的11个dlo-miRNAs,它们以裂解DlSODs mRNA的方式调控其在龙眼体胚发生过程中的转录后水平表达。这11个dlo-miRNAs分别是dlo-miR156(靶标DlCSD1a);dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643(靶标DlCSD1b);dlo- miR159、398、1171a和1171b(靶标DlCSD2a)以及dlo-miR808和2089(靶标DlFSD1a),它们在龙眼体胚发生过程中呈较大差异表达,推测其差异表达导致了不同类型SOD基因在龙眼体胚发生过程中表达模式的不同。此外利用RT-PCR法克隆获得pre-miR398a/b序列,它们与其它植物的前体序列具有高度保守性。6.龙眼体胚发生过程中SOD基因家族及miRNA定量表达分析①龙眼体胚发生过程中SOD基因家族表达模式分析在上述研究的基础上,以及对龙眼体胚发生过程中qPCR内参基因筛选的基础上,对不同类型DlSODs的表达模式进行分析。首先,不同类型DlSODs在龙眼体胚发生过程中的表达变化趋势比较接近,它们主要在体胚发育的中期和成熟胚中起作用。从松散型胚性愈伤组织开始到成熟胚等9个阶段,它们总体的表达变化趋势主要体现为“递增(胚性愈伤II)-递减(不完全胚性紧实结构)-递减(紧实胚性球形结构)-递减(球形胚)-递增(心形胚)-递减(鱼雷形胚)-递减(子叶形胚)-递增(成熟胚)”模式。其次,不同类型SODs在龙眼体胚不同发育阶段有明显的分工。在胚性愈伤组织II和心形胚阶段,所有类型SOD都介导了其发育;球形胚阶段的形态建成则主要由DlCSD1a-5和DlCSD1b-2负责;鱼雷形胚阶段的发育主要受DlFSD1a、DlFSD1b和DlMSD的调控;在子叶形胚阶段,所有类型SODs的转录水平均很低;在成熟胚阶段的形态建成则主要以DlCSD1a为主,DlMSD为辅负责。此外,还研究了DlSODs基因家族与其它抗氧化系统的相关基因CAT和POD和分子伴侣DlCCS之间表达模式的相互关系,表明CAT、POD等抗氧化系统相关基因与DlSODs的相互协调表达,从而保证了ROS网络的正常运行;DlCCS的正常稳定表达对维持DlCSDs正常发挥生物学功能是必须的,但DlCSDs的激活也并不完全依赖于DlCCS的存在。②龙眼体胚发生过程中miRNAs表达模式分析在龙眼体胚发生过程中qPCR miRNA内参基因筛选的基础上,对20个dlo-miRNAs的表达模式进行分析。dlo-miR3,5,10,12,13,156a,156c,397a,398b.1,398b.2,398b.3,808和2089*等miRNA共同介导了龙眼体胚发生早期的形态建成,它们均在体胚发生早期球形胚之前大量表达,晚期表达量多数下降,部分miRNA甚至不表达;dlo-miR6、160a和167a可能在龙眼体胚发生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a转录水平的累积对龙眼心形胚和鱼雷形胚的形态建成可能是必须的;dlo-miR167a在龙眼子叶胚和成熟胚中起主要作用;而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龙眼体胚发生过程中的表达均比较稳定。以上说明miRNAs表达的组织和时空特异性共同介导了龙眼体胚的发生。③龙眼体胚的发生过程miRNA与DlSODs表达模式的比较分析miRNA-DlSODs的协调表达参与调控了龙眼体胚的发生。对miRNA与DlSODs表达模式进行比较分析表明:dlo-miR156家族、159家族、398b家族、808和2089*在龙眼体胚发生过程中均有特异性扩增,且表达量能与相应靶基因呈负相关;然而dlo-miR863-3p、1023b-23p、1171a/b、1223和2643却未能得到特异性扩增但却能鉴定到它们裂解的mRNA片段,提示在龙眼体胚中可能还存在其它潜在的miRNA或内源siRNA介导了DlSODs的表达。此外,不同miRNA成员间在不同发育阶段具有明确的分工,甚至不同miRNA成员可能控制着相应mRNA转录本的表达,如dlo-miR159家族的4个成员分别调控着DlCSD1b、DlCSD2a不同发育阶段的表达。在龙眼体胚发生早期(球形胚前),它们的表达主要由dlo-miR159a.1负责;从球形胚到心形胚则由dlo-miR159c和159f负责;心形胚到成熟胚阶段由dlo-miR159a.2和dlo-miR159c负责,这种现象还在dlo-miR156家族及398b家族出现。这可能提示当miRNA某个成员不能裂解mRNA表达时,另外一些成员则对其功能进行互补,从而实现对靶基因转录后水平的调控。dlo-miR159同时介导DlCSD1b和DlCSD2a的表达,并负责协调不同靶基因间的表达变化趋势;miRNA可能以裂解靶基因mRNA的降解或抑制靶蛋白质翻译两种调控机制并存的方式同时介导靶基因的表达。此外,dlo-miR398b与pre-miR398b的表达模式基本一致,它们与靶基因DlCSD2a的表达模式刚好相反,说明前体miRNA能在一定程度上反应成熟miRNA的表达情况。综上所述,龙眼体胚发生过程中DlSODs的表达调控机制可能是:当外界环境因子发生改变时(内源激素或外界环境因子胁迫),细胞内活性氧水平发生变化,进而启动相关调控因子[(转录因子bZIP、WRKY、miRNAs(dlo-miR156、159、398、808和2089*)、磷酸化作用)]转录水平的变化从而调控DlSODs的表达,使之最终参与龙眼体胚发生过程中的基础代谢、激素信号转导、细胞凋亡、氧化胁迫等生理过程,从而最终影响其发育的整体进程。总之SOD的表达是多种因子共同构成的一个复杂调控网络。
李娜[6]2014年在《小麦TaYUC基因的克隆与初步功能分析》文中研究说明生长素是植物体内一种重要的内源激素，参与植物体多种生理生化的调控，涉及植物胚胎和果实发育、器官发生、微管组织分化、根的形成、伸长和向性生长以及顶端优势等，对植物体的生长发育起到重要的调控作用。YUCCA基因编码的黄素单加氧酶是生长素合成过程中色氨酸依赖途径中的一个限速酶，对生长素的合成起重要调控作用。本研究以中国春小麦为材料，在前期获得YUCCA10基因的部分cDNA序列及对小麦cDNA数据库进行分析的基础上，采用生物信息学分析、基因克隆、实时荧光定量PCR分析、载体构建和遗传转化的方法，克隆得到了小麦中的YUCCA基因TaYUC10与TaYUC11两个新的基因，并对其进行生物信息学分析和初步功能分析。主要研究结果如下：1.克隆到小麦TaYUC10和TaYUC11全长基因。TaYUC10基因得到叁条序列，分别命名为TaYUC10.1，TaYUC10.2和TaYUC10.3，序列长度分别为为1414bp，1428bp，1427bp。叁条序列的内含子的长度存在差异，但是相互之间的相似度很高，均编码382个氨基酸，保守区域完全一致，含有FMO保守结构域。信号肽预测显示TaYUC10编码的氨基酸不含有信号肽，可能在细胞质中行使其功能。TaYUC11与TaYUC10基因结构相同，都是叁个内含子与四个外显子交替排列的结构。TaYUC11基因的叁条cDNA序列长度分别为1197bp，1124bp和1191bp，分别编码398，343，396个氨基酸。聚类分析显示TaYUC10和TaYUC11分别与拟南芥的AtYUC10和AtYUC11具有很高的相似性。2. TaYUC基因的定位。通过设计TaYUC10.1的特异引物，用中国春缺四体材料与端体材料发现TaYUC10.1位于5BL染色体，通过数据库分析显示，TaYUC10.3位于5DL上。TaYUC11不存在信号肽序列，并且在细胞质中表达。3. TaYUC10与TaYUC11基因的实时荧光定量PCR分析。对小麦生长发育期间各组织部位进行TaYUC基因荧光定量PCR分析发现，TaYUC基因在小麦中的表达具有时空特异性，在生殖器官如花和种子中强烈表达。幼苗期检测到TaYUC10与TaYUC11的微量表达，而且在根与叶片中差异不大。小麦进入生殖生长后TaYUC基因开始大量表达，小穗抽穗后TaYUC10与TaYUC11在小麦小穗中的表达明显上升。TaYUC基因主要在幼嫩种子中表达，种子中TaYUC11基因的表达量可达旗叶中的28倍。TaYUC10与TaYUC11的表达量在授粉后的28d里随着种子的发育呈持续上升的趋势。28d以后TaYUC11的表达开始下降，此时种子已经接近成熟。表明TaYUC10与TaYUC11均有可能在小麦籽粒的生长发育过程中起到关键的调控作用。小麦TaYUC10与TaYUC11在小麦各组织中表达趋势一致但是相对表达量存在差异，推测两者对植物的生长的调控作用的机制可能不同。4. TaYUC基因相关载体的构建及遗传转化。成功的构建了TaYUC10基因的转化小麦的过表达载体和含有HMW-GS-BX17基因启动子的基因枪转化载体，为深入研究该基因在小麦中过量表达与胚乳特异表达对小麦的影响和TaYUC基因在小麦中的功能的研究奠定了基础。TaYUC11转化拟南芥的过表达载体构建成功，为进一步研究TaYUC11基因的功能做好了准备工作。5. TaYUC10基因功能的初步分析。转TaYUC10基因的拟南芥植株有明显的生长优势即植株高大茎秆粗壮的特点，转基因植株部分败育，后期花器官严重变形，花的结构减少，不能产生任何花粉。表明TaYUC10基因能够调控植株株型的发育，对植物花器官和种子的形成起到关键的调控作用。通过以上研究，首次在小麦中克隆到YUC基因家族的两个基因TaYUC10与TaYUC11的全长序列，分析了其序列结构，染色体定位情况和基因表达特性，构建了植物表达载体。对转TaYUC10基因的拟南芥的生长情况进行观察，初步分析YUC基因对植株发育的调控。为这些YUC基因在小麦遗传转化和品种改良的应用奠定了基础。
李志岗[7]2004年在《转基因小麦抗穗发芽特性的分子鉴定、遗传分析与抗性机理研究》文中指出小麦是世界上第一大粮食作物,它不但推动了世界人类文明的演进,也极大地影响着世界农业经济和粮食安全。但由于穗发芽影响,从1983到1985年世界小麦的产量损失达20%,每年近1亿吨,相当于我国小麦年总产量;在我国黄淮麦区因成熟期遇雨也导致多次发生大面积小麦穗发芽,而造成断种和面粉不能食用的灾情,在北方麦区,常年虽无梅雨季节,但个别年份也曾出现过麦收期连阴雨小麦穗发芽的情况。因此,小麦穗发芽问题早就引起了国内外植物育种家和生理学家的广泛关注,成为农业生产中的殛待解决的难题。 近年来,国内外有关硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)生物学功能和反义基因作用机理的研究为创育抗穗发芽小麦资源提供了一条新的途径。Trx是一种能催化二硫键氧化还原反应的功能蛋白,通过调节Trx h活性能改变种子中淀粉酶和蛋白质酶等重要酶的活性,增加贮藏蛋白的水溶性和促进营养物质水解的作用,并对作物的品质产生影响。 源于蓝色黑鸭草(Phalaris coerulescens)的trxs基因(thioredoxin s,trxs)与trx基因(thioredoxin,trx)同属于硫氧还蛋白基因家族,其蛋白质表达产物有相似的生物活性。将反义trxs基因导入小麦有望降低种子中TRX的活性,减慢种子发芽时的碳氮代谢和淀粉、蛋白质的水解,抑制淀粉酶的活性,最终导致转基因小麦子粒发芽能力减弱。 本课题组早在2000年就开始进行反义trxs基因导入小麦的研究,到目前,已经得到了转基因第四代小麦。为了明确反义转基因在转基因小麦中的遗传规律和作用机制,本研究以转基因小麦后代株系为材料,追踪反义转基因的传递规律,并筛选纯合系;通过对目的基因的分子检测,确定了目的基因在小麦基因组中的遗传稳定情况;通过对转基因大麦籽粒和胚乳的生化生理特性测定,证明了目的基因在转基因小麦部分株系中能正常表达;通过对转基因稳定遗传和表达的株系进行模拟降雨抗穗发芽试验,证实部分转基因株系与对照相比,具有很强的抗穗发芽能力。研究的主要结果如下: 1、转反义trxs基因小麦株系分子检测和遗传分析 用PCR、Nested PCR、限制性酶切、Southern杂交等技术对转基因小麦T_1、T_2、T_3、T_4代部分株系进行分子鉴定,并连续2年追踪研究反义trxs基因在这些株系中的遗传规律和遗传稳定性。结果表明,反义trxs基因在转基因小麦株系中呈孟德尔单基因遗传,能稳定传递;根据分子检测结果,确定了4个反义trxs基因纯合的株系(00T89和
王雁楠[8]2015年在《甘薯淀粉合成相关基因IbAATP和IbSSI的克隆及功能分析》文中研究说明甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物,甘薯淀粉的研究与利用对提高甘薯的产量及品质以使其更适合作为工业原料与能源作物有着重要意义。本研究从甘薯高淀粉品系徐781中同源克隆到两个与淀粉合成相关的基因,并将其导入甘薯低淀粉品种栗子香中进行过表达或干扰表达,对这两个基因在甘薯淀粉合成中的作用进行了分析,获得了如下主要实验结果：1.从甘薯高淀粉品系徐781中利用RACE技术(rapid amplification of cDNA ends)克隆到质体型ATP/ADP转运蛋白基因(plastidic ATP/ADP transporter, IbAATP),该基因具有5个外显子和4个内含子。IbAATP基因在甘薯块根中表达量最高,其次是叶片；该基因的表达受到外源蔗糖的诱导及昼夜节律的调控。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于叶绿体(或质体)。过表达IbAATP基因的甘薯植株的块根淀粉含量、直链淀粉含量显着提高、淀粉粒平均粒径变大、结晶度变小。此外,转基因株系及野生型植株均表现出A型淀粉粒的特征。同时,转基因株系块根淀粉的理化性质(DSC谱和RVA谱)及支链淀粉链长分布发生改变。qRT-PCR分析表明,转基因株系中与淀粉合成相关的基因均受到了不同程度的上调或下调表达,这些基因所编码蛋白的酶活与野生型植株相比也发生了显着改变。这些结果表明IbAATP基因能够显着提高转基因甘薯植株的淀粉合成能力,并通过影响淀粉合成相关基因的表达而改变淀粉含量、组成及特性。2.对本人之前从甘薯高淀粉品系徐781中克隆到的可溶性淀粉合成酶基因I (soluble starch synthase I, IbSSI)进行表达分析及功能鉴定。原核表达实验证明该基因可在大肠杆菌中被诱导表达,其诱导蛋白具有淀粉合成酶活性。该基因在甘薯叶片中表达量最高,其次是块根；该基因的表达受到外源蔗糖的诱导；同时,IbSSI基因的表达不受昼夜节律的调控。亚细胞定位显示IbSSI定位于叶绿体。对IbSSI基因启动子进行分段活性分析(分7段),结果表明各分段启动子均有启动gusA基因表达的能力。过表达IbSSI基因的甘薯植株的块根淀粉含量显着提高、直链淀粉含量显着下降、淀粉粒的平均粒径及结晶度变大,而干扰表达(RNAi) IbSSI基因的甘薯植株则表现出相反的趋势。同时,转基因株系及野生型植株均表现出A型淀粉粒的特征。此外,转基因甘薯植株淀粉的理化性质(DSC谱和RVA谱)及支链淀粉链长分布发生改变,进一步分析表明,IbSSI基因在甘薯中主要负责聚合度(DP)在9-17的支链的合成。qRT-PCR分析表明,转基因株系中与淀粉合成相关的基因均受到了不同程度的上调或下调表达,这些基因所编码蛋白的酶活与野生型植株相比也发生了显着变化,正是这些相关基因的表达及酶活发生的改变导致了转基因株系块根淀粉含量、组成及特性的改变。
栗现芳[9]2011年在《小麦多子房性状SSH文库的构建及其相关基因的克隆与表达》文中指出多子房小麦具有明显的穗粒数优势,如能应用到杂交小麦育种中将会是提高繁制种系数的一种有效途径,进而对杂交小麦的发展将会起到一个极大地促进作用。目前有关多子房小麦的研究多集中在花器官的发育过程、种子萌发过程中的生化研究、分子标记、基因定位和遗传分析,对小麦多子房性状形成的分子机制研究至今仍是空白。小麦多子房品系Ⅱ(简称多Ⅱ)近等基因系(near-isogenic line, NIL)是由西北农林科技大学专为研究多子房性状的分子遗传机理而创制的一种试验材料,其多子房、单子房性状遗传稳定,其它遗传背景和农艺性状与轮回亲本一致,是研究多子房性状分子机制的良好试材。为了深入揭示小麦多子房性状形成的分子机制,本研究利用上述材料,首次以SSH(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)技术分别构建了多子房和单子房相关基因特异表达的抑制消减杂交cDNA文库,通过对两个cDNA文库的克隆测序、EST序列比对分析和功能分类,探讨了小麦多子房和单子房性状各自表达基因的种类和功能的异同,并从中选择了部分基因进行了表达分析和cDNA、DNA序列的克隆,获得如下重要结果:1.对小麦多ⅡNIL的外显率、多粒结实率、发芽率进行了调查与分析,同时在田间调查过程中发现了每朵小花具有4～6个雌蕊的新变异类型。不同株系间多子房性状外显率分布在77.2～95.3%之间,平均为88.6%;多粒种子平均结实率为79.9%;多子房株系主位种子与单子房株系种子发芽率基本一致,副位种子发芽率稍低;分析推测小麦多子房新突变现象是在原本遗传稳定的多子房性状基础上进一步发生了雄蕊心皮化的结果,第4～6个雌蕊未能成功受精结实。2.以小麦多ⅡNIL的多子房和单子房株系幼穗cDNA互为Tester和Driver,利用SSH技术成功构建了小麦多子房和单子房性状相关基因的cDNA文库(简称为Mu文库和Mo文库)。Mu文库共得到约2536个菌落,其中白斑2383个,重组率为93.97%;Mo文库共得到约4543个菌落,其中白斑4359个,重组率为95.95%。分别采用巢式引物和通用引物对随机挑取的克隆进行PCR检测,两个文库85%以上的克隆皆能扩增出目的片段,基本介于200～750bp之间,多数集中在400～500 bp之间。对部分阳性克隆提取质粒及酶切,插入片段大小主要集中在450bp左右,与菌液PCR检测结果一致。3.从Mu和Mo文库中,各随机选择100个阳性克隆进行测序。Mu文库中所获EST片段平均大小为378bp。去除低质量序列及重复序列后,共获得90条EST,其中65条功能已知,占全部EST的72.22%。参与蛋白合成的最多,占27.69%;其次为亚细胞定位相关的基因,占10.77%;与能量、转录相关的基因各为7.69%;与新陈代谢、生长发育、结合功能蛋白相关的基因各为6.15%;占比例较低的是与蛋白加工、细胞通信与信号转导、细胞防御等相关的基因。Mo文库中所获EST片段平均大小为339bp。去除重复序列后,共获得89条EST,其中60条功能已知,占全部EST的67.42%。在已知功能序列中,未分类功能蛋白的序列较多,占33.33%;与新陈代谢有关的基因占11.67%;亚细胞定位相关基因占10%;与能量、蛋白合成、蛋白加工、结合功能蛋白相关的基因各占6.67%。不同功能的蛋白在两个库中所占比例不一致,Mu文库以蛋白合成、转录和生长发育相关蛋白为主;而Mo文库以物质代谢、蛋白加工及细胞运输途径相关蛋白为主。4.利用半定量RT-PCR对两个文库中的12个相关基因进行了时空表达研究。Mu文库中所选的6个基因在多子房株系都有不同程度的上调表达,40S核糖体蛋白S6、核内小核糖核蛋白质G、核糖体蛋白L10A差异较为明显,其次为核糖体蛋白s15a、14-3-3蛋白、60s核糖体蛋白L21,而假定的脯氨酰4 -羟化酶、伴侣蛋白、CER1蜡质合成酶基因差异不明显;Mo文库中尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶、60S核糖体蛋白L17-1在单子房株系中上调表达,半胱氨酸蛋白酶抑制剂差异较小;多数基因1~12mm幼穗时期内表达量呈上升趋势,广泛存在于各种组织,在茎顶端表达量高于其他组织。研究推测,差异表达的基因可能参与了多子房性状的发生。5.以SSH文库中筛选出的小麦RPS15a和RPL21基因序列为信息探针,通过同源序列搜索、聚类拼接、RT-PCR和PCR克隆,获得了RPS15a、RPL21基因的cDNA和DNA序列。小麦RPS15a基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM055513)长为413 bp,编码130个氨基酸;DNA序列(GenBank登录号:HM063421)长为642 bp,含有3个外显子和2个内含子。小麦RPL21基因cDNA序列(GenBank登录号:HM138480)长521bp,编码164个氨基酸,氨基酸序列在植物与动物间相似性较差;DNA序列(GenBank登录号:HM138481)长1600bp,含有2个外显子和1个内含子。在不同材料中,这两个核糖体蛋白基因在多子房株系2～4mm幼穗中表现不同程度的表达上调,可能与小麦多子房性状的发生有关,其具体功能作用尚需进一步验证。6.以SSH文库中筛选出的小麦Cab基因序列为信息探针,通过同源序列搜索、聚类拼接和RT-PCR,获得了小麦Cab基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM362991)。序列长862bp,编码266个氨基酸,与之前EST序列拼接延伸后得到924bp的序列。在不同材料中,Cab基因在单子房株系2～3和3～4mm中表达量下调;在单子房株系1～6mm幼穗时期内,2～3mm幼穗中表达量较低;不同组织中差异明显,幼叶中表达量最高,幼根中无表达。
钱雪娅[10]2005年在《小麦直链淀粉含量半籽粒测定方法的研究及其在糯小麦鉴定中的应用》文中研究表明为了寻求一种准确、简便、快速测定小麦直链淀粉含量的方法,并将这种方法用于糯小麦和非糯小麦及其分离世代的鉴定,以及用于不同类型小麦直链淀粉积累的研究,本试验选取了叁类直链淀粉含量不同的小麦材料。在半籽粒测定方法研究中: 研究了不同乙酸用量、碘用量以及不同显色时间对吸光值的影响;比较了不同预处理方法下籽粒的直链淀粉含量;对群体直链淀粉含量和半粒直链淀粉含量以及半粒法和常规法进行相互比较。用半粒法测定不同组合F1植株所结籽粒直链淀粉的含量,对不同类型小麦在灌浆期直链淀粉含量的动态积累进行了研究。结果表明:1 不同用量的乙酸、碘试剂都影响吸光值,加入1.0ml 浓度为1mol/L 的乙酸和1ml 0.2%碘试剂为其最佳反应条件。在这种条件下,直链淀粉遇碘形成具有特殊颜色的碘-淀粉络合物,测定结果稳定、具有代表性。显色时间影响吸光值,显色后15min 测定吸光值比较准确。2 籽粒预处理中对NaOH 浓度、用量、糊化时间及糊化后是否需要加热进行比较试验。结果表明:在籽粒糊化过程中,NaOH 浓度在1.0mol/L 时,用量为1.5ml 时,籽粒糊化效果较好,增大浓度和用量对籽粒的糊化效果作用不大。糊化24h 为合适时间,糊化24h 后再在沸水浴中分散10min 所测直链淀粉含量结果平稳、准确。3 对半籽粒所测直链淀粉含量和小群体所测直链淀粉含量进行了相关分析,相关系数r=0.989>r0.01=0.959,达到极显着水平,说明可以通过半粒直链淀粉含量来预测群体直链淀粉含量;对半粒法和常规法所测直链淀粉含量进行t 测验,结果差异不显着(t =0.746 [1]. 小麦蓝色胚乳相关cDNA序列的分离鉴定[D]. 侯文胜. 中国农业科学院. 2004 [2]. 小麦穗发芽抗性相关Vp-1B和AIP2基因的克隆及功能分析[D]. 高东尧. 吉林大学. 2010 [3]. 小麦全长cDNA文库构建、测序与分析[D]. 赵光耀. 中国农业科学院. 2006 [4]. 小麦籽粒高分子量谷蛋白重要调控因子的克隆及功能鉴定[D]. 郭卫卫. 中国农业大学. 2015 [5]. 龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究[D]. 林玉玲. 福建农林大学. 2011 [6]. 小麦TaYUC基因的克隆与初步功能分析[D]. 李娜. 山东农业大学. 2014 [7]. 转基因小麦抗穗发芽特性的分子鉴定、遗传分析与抗性机理研究[D]. 李志岗. 山西农业大学. 2004 [8]. 甘薯淀粉合成相关基因IbAATP和IbSSI的克隆及功能分析[D]. 王雁楠. 中国农业大学. 2015 [9]. 小麦多子房性状SSH文库的构建及其相关基因的克隆与表达[D]. 栗现芳. 西北农林科技大学. 2011 [10]. 小麦直链淀粉含量半籽粒测定方法的研究及其在糯小麦鉴定中的应用[D]. 钱雪娅. 西北农林科技大学. 2005 标签：农作物论文; 小麦论文; 转基因植物论文; 基因合成论文; 相关性分析论文; 种子植物论文; 农业论文; 启动子论文; 参考文献：