王俊, 代军飞, 马炳, 丁耀忠, 欧云文[1]2018年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核可溶性表达和间接ELISA抗体检测方法的初步建立》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的核衣壳蛋白N是一种含量高、免疫原性强、最早刺激机体产生特异性抗体的主要结构蛋白,研制针对N蛋白抗体的检测方法对进一步实现PRRS的流行病学监测和诊断具有重要意义。本研究以带有MBP标签的p MAL-C4X作为表达载体,实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,每升菌液经纯化可得约20 mg的融合N蛋白。Western-blot结果表明,融合N蛋白能被抗MBP的单抗和PRRSV N蛋白的家兔多抗特异识别。以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法不与猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的阳性猪血清发生交叉反应,但与1型PRRSV阳性猪血清有较强反应性。田间样品检测结果表明,本研究建立的间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90%左右。本研究以MBP作为促溶标签,实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达,重组蛋白具有良好的免疫反应性,这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。
陈义平[2]2003年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的高效可溶性表达和检测血清抗体的间接ELISA方法的建立》文中认为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要引起怀孕母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状，自1987年首次报道以来，已形成全球性流行并造成了很大的经济损失。该病的病原为PRRSV，随着毒株的毒力变异，新的强毒株不断出现，并能引起免疫过的猪场发病，而且人工致弱的疫苗毒也能返强而引起临床疾病。目前尚无理想的针对PRRS的预防和控制措施，因此加强对该病的监测尤为重要。本文分别用真核和原核表达系统对PRRSV核衣壳蛋白基因进行了高效可溶性表达，并用重组的核衣壳蛋白作为抗原，成功地建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。另外，还对PRRSV的凋亡诱导作用进行了研究。 一、猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在杆状病毒表达系统中的表达 用RT-PCR扩增出美洲型PRRSV VR 2332株核衣壳蛋白(N)基因，首先克隆到pGEM-T easy载体，再亚克隆到转座载体pFastBacl，最后将含有PRRSV核衣壳蛋白基因的表达盒转座到穿梭载体Bacmid中。重组质粒转染Sf9细胞，获得了重组杆状病毒reBac-N，经扩增后重组杆状病毒的滴度达到5×10~8pfu／ml，以5个MOI的reBac-N感染Sf9细胞，经SDS-PAGE和Western blot证实N蛋白已获得表达，分子量约15kDa，与天然核衣壳蛋白大小一致。分别于感染后24、48、60、72、96、120小时收获表达产物，可见重组N蛋白于感染后72小时表达量最高。经免疫荧光染色和SDS-PAGE证实，PRRSV N蛋白非分泌性、可溶性地表达于Sf9细胞胞浆内。取感染reBac-N的Sf9细胞裂解上清进行间接ELISA，可见重组核衣壳蛋白具有良好的抗原性，能与PRRSV猪抗血清发生特异性反应。另外，以重组核衣壳蛋白为免疫原制备的多抗鼠血清能与大肠杆菌中表达的GST-N融合蛋白发生特异性反应，表明Sf9细胞内表达的重组核衣壳蛋白也具有良好的免疫原性。 二、猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其表达产物的纯化制备 国内外许多学者分别利用不同的表达载体对PRRSV核衣壳蛋白基因进行了原扬州大学博士学位论文核表达，其中部分报道还对核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达方式进行了分析，结果均是以包涵体形式存在。本试验将美洲型PRRSV vR 2332株核衣壳蛋白基因克隆到表达载体pGEX一6P一1中谷眺甘肤一S一转移酶(GST)基因的下游，重组质粒转化大肠杆菌BL21，通过对各种表达条件进行优化，实现了PRRSV核衣壳蛋白基因在原核表达系统中的可溶性表达。经SDS一PAGE和Western blot分析，GST一N融合蛋白的分子量约为39.skDa，另外，还有叁种不同大小的GST一N降解产物，分子量分别为33 kDa，30.5 kDa和27.5 kDa，39.5 kDa的GST一N及其30.5 kDa的降解产物分别占菌体蛋白的30.9%和巧.3%，总表达量约占菌体蛋白的一半。重组菌经超声波裂解后，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化表达产物，每毫升床体积的GST一N融合蛋白收获量达1 smg，回收的GST一N融合蛋白浓度达到smg/ml。用Prescission Protease切去GST一N融合蛋白中的GST成分，得到纯化的重组核衣壳蛋白。经间接ELISA证实，大肠杆菌中表达的GST一N融合蛋白以及切去GST纯化的N蛋白均可作为诊断抗原，用于PRRSV抗体的检测。用GST一N融合蛋白以及切去GST后纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠制备的抗血清均能与Sfg细胞内表达的重组核衣壳蛋白发生特异性反应，可见PRRSV核衣壳蛋白的原核表达产物也具有良好的免疫原性。叁、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其应用 分别用昆虫细胞内表达的重组核衣壳蛋白(Bac一N)、大肠杆菌内表达的GST一N融合蛋白、以及切去GST后纯化的N蛋白作为诊断抗原，同时设立必要的阴性抗原对照，结果可见Bac一N、GST一N以及N蛋白均能特异性地识别PRRSV抗体阳性血清样品和阴性血清样品，而且根据针对阴性抗原以及阴性抗体反应的0D值可见，叁种检测用抗原都具有较高的敏感性。因此，Bac一N、GST一N、N蛋白均可作为诊断抗原，用于PRRSV抗体检测。但考虑到Bac一为昆虫细胞裂解后的粗提制剂，含有较多的细胞蛋白成分，需设立正常Sfg细胞裂解上清作为阴性抗原对照，同一份血清样品要对阳性抗原和阴性抗原同时进行平行检测，而上述N蛋白纯化抗原的制备需要蛋白酶PreSCISSion阶otease的切割，从而大大增加了抗原制备的经费开支，因此选用亲和层析纯化的GST一N作为检测抗原。 以方阵滴定法确定GST一N最佳包被浓度为每孔400ng，待检血清最佳稀释度为1:10。。血清样品的0D490〕0.43 x ODPo:+0.57 x0D二判为阳性，反之判为阴性。用建立的间接ELISA分别检测猪瘟阳性血清、猪细小病毒病阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪口蹄疫阳性血清、猪大肠杆菌病阳性血清、猪气喘病阳性血清，结陈义平:猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的高效可溶性表达和检测血清抗体的间接ELISA方法的建立m果均为阴性，说明该方法具有高度的特异性。取8份不同OD值的血清样品进行6次批内重复试验，结果其变异系数一般不超过5%;36份血清样品分别用两个不同批次包被冻存的酶标板进行检测，结果也完全相同，说明建立的间
邵烈刚[3]2009年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备》文中指出猪繁殖与呼吸综合征是一种能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。该病于1987年首先暴发于美国,随后迅速向世界各地蔓延:我国郭宝清等于1996年从疑似本病的猪群中分离到PRRSV,从而确认了PRRS在我国的存在。由于基因的变异,近两年我国大部分地区暴发了以高传染性、高死亡率为特征的高致病性蓝耳病,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前PRRS的确诊依赖于病毒的分离鉴定、血清学诊断方法以及分子生物学诊断方法等。血清学诊断方法包括免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、乳胶凝集试验(LAT)、血清中和试验(SN)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)等;分子生物学诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)技术、核酸探针原位杂交技术(ISH)等。这些诊断方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵,多数不适合于临床快速诊断。近几年来兴起的免疫胶体金诊断试纸法很好的弥补了这些不足,但要想成功的开发出胶体金诊断试纸,首先必须制备高亲和力、高特异性的单克隆抗体。本实验的目的就是制备高亲和力、高特异性的抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体,为下一步开发PRRS胶体金诊断试纸建立基础。本试验利用南京农业大学已构建的含有PRRSV N蛋白基因的重组表达载体阳性菌,在37℃条件下,用终浓度1mM的IPTG诱导表达4h。经SDS-PAGE分析,表明N基因在大肠杆菌中得到了高效表达。经镍柱亲和层析纯化,获得了纯度较高、免疫学活性较好的N蛋白。以此蛋白作为抗原对BalB/C小鼠进行长程免疫,取抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行融合,融合率为60.6%。建立间接ELISA方法,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体,初检阳性率为16.1%。经多次亚克隆及反复筛选,获得了2株能稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株,命名为4D3和15F6。将得到的单抗株进行初步鉴定,两单抗株特异性针对PRRSV共同的抗原表位。4D3和5F6杂交瘤细胞株经过反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌较高效价的抗体,其抗体效价保持在1:1000以上;将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内诱生腹水,7天后将收集的腹水以辛酸-硫酸铵法提纯,间接ELISA检测其效价达1:102400以上。因此,上述杂交瘤细胞将会在PRRS的诊断中发挥重要的作用。
万晓媛[4]2009年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒及其N蛋白卵黄抗体的制备与鉴定》文中指出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)严重危害世界养猪业,如何预防和控制该病的发生一直是近年来研究的热点。本研究以构建的PRRSV重组N蛋白原核表达纯化蛋白和PRRSV全病毒为抗原,制备特异性卵黄抗体(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY),并用间接免疫荧光试验和中和试验等检测卵黄抗体的特异性和中和活性。研究旨在为PRRSV的检测和治疗提供新思路,主要研究内容和结果如下：1猪繁殖与呼吸综合征核衣壳蛋白的原核表达及鉴定根据GenBank上公布的PRRSV N基因核苷酸序列(GenBank登录号：FJ175688)设计引物,RT-PCR扩增出N蛋白的目标基因。将PCR克隆产物,经EcoRI和HindⅢ双酶切,连接至原核表达载体pET-30a(+),转化大肠杆菌E.coliBL21,并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示,6his-N融合重组蛋白得到了高效表达；纯化后的目的蛋白浓度达到60.2mg/L重组菌培养液；Western blotting显示融合重组蛋白可与抗PRRSV阳性血清发生反应。2特异性卵黄抗体(IgY)的制备及鉴定以原核表达的重组蛋白6his-N及灭活的PRRSV为抗原免疫蛋鸡,间接ELISA对水稀释法提取的特异性anti-PRRSV IgY、anti-NIgY的抗体效价及其变化规律进行检测。结果显示,全病毒免疫组首免后20d可以检测到特异性IgY抗体(P／N=2.57),第47d效价达到最高,为1：320,至120d试验结束时,P／N值仍达3.76；重组N蛋白免疫组首免后36d可以检测到特异性IgY抗体(P／N=2.44),第83d效价达1：640,为最高,至120d试验结束时,P／N值仍达3.57；饱和硫酸铵法提纯的特异性IgY经SDS-PAGE和Western Blotting检测,纯度较高且有一定的免疫反应性。3特异性IgY抗体作为IFA检测抗体应用及体外保护效果的初步研究间接免疫荧光(IFA)试验和病毒中和试验(VN)表明,anti-PRRSVIgY和anti-NIgY能够在感染的MARC-145中产生特异性的胞浆染色和核仁染色。以200TCID50的PRRSV分别与两种不同浓度纯化的特异性卵黄抗体等体积混合,结果表明：经1：2稀释(浓度为：0.72mg／m0)的anti-PRRSV IgY能完全中和病毒,1：4稀释(浓度为：0.36mg／ml)可抑制50%细胞孔出现病变。anti-N-IgY浓度为1.39 mg／ml不能抑制100TCID50PRRSV增殖。
袁宝[5]2007年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白原核表达及其抗体检测方法的建立》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸系统综合征(PRRS)是严重危害养猪业的一种病毒性传染病。病毒核衣壳蛋白(N蛋白)在病毒粒子中含量较高,免疫原性强,而且高度保守。根据GenBank上公布的PRRSV VR2332 N基因核苷酸序列设计引物,并应用RT-PCR方法扩增出N蛋白的目标基因。将PCR产物克隆到pMD18-T载体,经BamH I和Xho I双酶切,连接表达载体pGEX-4T-1,获得了重组质粒pGEX-4T-1-ORF7。将连接产物转化到Rosetta表达菌中,IPTG进行诱导表达,使核衣壳蛋白得到高效表达。应用超声破碎菌体后,回收包涵体,并对包涵体进行复性。纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定,并用Western-blotting检验其特异性。在此基础上,应用重组N蛋白作包被抗原,优化反应条件后,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征血清抗体的重组N蛋白ELISA检测方法。将采自河北、吉林两省多个猪场的192份猪血清样品分别用建立的间接ELISA检测并与全病毒作为包被抗原比较,二者的符合率达96.5%(185/192)。采集血清样品355份,采用本方法检测PRRSV抗体,结合样品背景进行结果分析,阳性血清266份,阳性率74.9%。未免疫猪场血清145份,检出阳性血清56份,阳性率38.6%。
姜丽英[6]2008年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制》文中提出猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并己成为危害养猪业最严重的传染病之一。在PRRSV编码的各种蛋白中,核衣壳蛋白(N蛋白)作为病毒粒子中含量最高、免疫原性最强的结构蛋白之一,对于PRRS的诊断及监控防治具有重要意义。本研究以江苏地区的分离株SY株PRRSV为研究对象,在克隆并鉴定该病毒N基因的基础上,进行N蛋白的原核表达,并制备相应单克隆抗体,为检测方法的建立及结构蛋白的研究奠定了基础。1、PRRSV N基因的克隆及原核表达根据GeneBank发表的PRRSV ATCC VR-2332株N基因序列,设计并合成一对引物,利用RT-PCR方法扩增N基因片段。将扩增片段克隆至pGEM-T Easy载体中,构建N基因重组载体pGEM-T-N。经核苷酸序列测定,克隆的基因片段长372bp,为N基因开放性读码框的全长序列,编码123个氨基酸。将N基因片段连接至pGEX-6P-1表达载体中,经抗性筛选和限制性内切酶分析,获得阳性克隆pGEX-6P-1-N。将pGEX-6P-1-N质粒转化E.coli BL21感受态细胞,筛选到重组菌pGEX-6p-1-N/BL21,用IPTG诱导重组菌表达N蛋白。经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得的融合蛋白分子量约为36.5kDa,大小与预期相一致,且具有良好的抗原特异性。对融合蛋白表达条件进行优化,确定诱导剂IPTG的浓度为0.8mM,诱导时间为4h。融合蛋白以包涵体形式出现,经含有尿素的溶液洗涤得以初步纯化。2、PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究通过在Marc-145上增殖PRRSV,将收获的病毒经差速离心和PEG沉淀进行初步提纯和浓缩。将浓缩的病毒以及GST-N融合蛋白分别免疫BALB/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆,共获得10株能稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为P1A1、P1A2、P1C5、P2D3、P2G7、P5E5、P6G7、P7F2、P7E8和N1H4。单抗N1H4亚类为IgM,其余均属于IgG1。所有单抗具有良好的特异性,与PPV、PRV、PCV2、HCV无交叉反应。Weasern-blot分析结果进一步证实所获单抗是针对病毒的核衣壳蛋白,且能与之发生特异性结合反应。采用相加ELISA方法,对单抗识别的抗原表位进行分析,初步表明P6G7和N1H4同其它单抗识别不同的抗原表位。利用这些单抗初步建立了间接ELISA、Dot-ELISA和间接免疫荧光(IFA)等特异性检测PRRSV抗原的方法,为进一步建立敏感性高、特异性强、简便快速的PRRS诊断方法打下了基础。
王明珍[7]2010年在《江苏地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及其病原核衣壳蛋白的原核表达》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并己成为危害养猪业最严重的传染病之一。2006年以来,我国暴发了一种以高热、高发病率、高死亡率为特征的“猪高热综合症”。通过国内学者的大量研究,证实高致病性PRRSV变异株是“猪高热综合症”的主要病因。1. RT-PCR检测方法的建立和PRRSV Nsp2基因序列的分析为了快速鉴别高致病性PRRSV和经典毒株,根据GenBank公布的基因序列,在Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,经典毒株扩增片段为734bp,而高致病性PRRSV扩增片段为644bp,建立了能区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法。利用建立的方法对采集的江苏地区临床病料进行了检测,结果表明临床病料阳性率为40%,且流行毒株都是PRRSV变异株。利用设计的欧洲型PRRSV引物对临床样品检测,未检测到欧洲型PRRSV。对18株PRRSV分离株的Nsp2基因序列分析,结果表明,18株病毒的Nsp2基因扩增大小均为644bp。与美洲型代表毒株VR-2332的氨基酸同源性在57.5%-68.7%,与高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82.2%-97.6%、80.4%-95.3%。且18株病毒的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1相同。2.高致病性PRRSV RD2007的分离和鉴定选取PCR检测阳性样品,组织研磨无菌化处理,离心取上清接种于单层的Marc-145细胞,结果在培养第2代时,细胞出现明显病变,主要表现为细胞聚集、成簇,发生裂解。将细胞悬液进行RT-PCR检测扩增出644bp大小的片段,用抗PRRSV N蛋白单抗做间接免疫荧光检测,结果感染细胞可见绿色荧光。证明本研究分离到一株PRRSV,命名为RD2007。3.高致病性PRRSV RD2007株的全基因组序列分析为了解RD2007株的基因变异情况,通过RT-PCR分段扩增并测定RD2007株的全基因组序列,序列分析结果表明:RD2007株属于美洲型毒株,Nsp2蛋白中存在30个氨基酸的不连续缺失。与经典毒株VR-2332的全基因组核苷酸同源性是89.2%,与国内分离株的JXA1株的基因组核苷酸同源性在99.1%,遗传进化分析表明RD2007与国内高致病性PRRSV亲缘关系较近,有着共同的祖先。4. PRRSV N基因的克隆及原核表达根据GeneBank发表的PRRSV ATCC VR-2332株ORF7基因序列,设计并合成一对引物,利用RT-PCR方法扩增ORF7基因片段。将扩增片段克隆至pGEM-T Easy载体中,构建N基因重组载体pGEM-T-N。将ORF7基因片段再克隆至pET32a表达载体中,通过酶切分析,结果获得阳性表达质粒pET32a-N。然后将pET32a-N质粒转化E.coli BL21感受态细胞,在28℃IPTG0.5mM 5h的条件下获得了PRRSV N蛋白的高效表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得的融合蛋白分子量约为35kDa,与预期大小一致,且融合蛋白为可溶性表达。
李敏华, 王倩, 田志军, 金涛[8]2019年在《一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定》文中研究表明为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107～aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。
参考文献：
[1]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核可溶性表达和间接ELISA抗体检测方法的初步建立[J]. 王俊, 代军飞, 马炳, 丁耀忠, 欧云文. 中国兽医科学. 2018
[2]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的高效可溶性表达和检测血清抗体的间接ELISA方法的建立[D]. 陈义平. 扬州大学. 2003
[3]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备[D]. 邵烈刚. 西南大学. 2009
[4]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其N蛋白卵黄抗体的制备与鉴定[D]. 万晓媛. 浙江大学. 2009
[5]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白原核表达及其抗体检测方法的建立[D]. 袁宝. 吉林大学. 2007
[6]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达及其单克隆抗体的研制[D]. 姜丽英. 扬州大学. 2008
[7]. 江苏地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及其病原核衣壳蛋白的原核表达[D]. 王明珍. 扬州大学. 2010
[8]. 一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[J]. 李敏华, 王倩, 田志军, 金涛. 中国预防兽医学报. 2019
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