株洲县疾控中心检验科 湖南株洲 412100
【摘 要】目的：观察沙门氏菌致食源性疾病分离方法及多态性。方法：取2015年4月-2016年5月对疑似不合格食品、蛋品样本从从业人员中收集的71份检材作为研究对象，对材料样品进行增菌、分离培养并进行多态性分析。结果：71份检材共分离出190株病原菌，分离得到的可疑菌落有的在XLD上生长出纯黑色的单菌落，有的在HE上长出黑色周围无色半透明的单个菌落，有的在BS琼脂平板上生长出灰绿色菌落。对于可疑典型菌落分别标注：S1-S11，与国家标注所述沙门氏菌形态一致；190株病原菌中11株进行PCR检测，11株分离株均扩增出443bp的特异亮带，而大肠杆菌标准菌株中阴性对照则无条带扩增，提示分离的菌株均为沙门氏菌。结论：沙门氏菌致食源性疾病发生率较高，应结合流行病学调查资料、临床资料以及病原菌鉴定及扩增DNA多态性分析，及时采取有效的措施进行干预。
【关键词】沙门氏菌；食源性疾病；分离方法；多态性
随着人们生活水平的不断提高，国内外食品安全事件频发，视频安全问题受到了全世界各国的广泛关注。当食源性疾病爆发，如何采取有效的方法完成病原菌鉴定并及时采取有效的措施干预降低事故蔓延成为关键问题[1-2]。目前，临床上病原菌鉴定方法相对较多，如：乳胶凝集试验法、酶联免疫吸附试验、PCR法等，但是对于高准确性检测更多的基于生化反应，借助现代信息化手段提高鉴定准确率。为了探讨沙门氏菌致食源性疾病分离方法及多态性。取2015年4月-2016年5月对疑似不合格食品、蛋品样本从从业人员中收集的71份检材作为研究对象，报道如下。
1.资料与方法
1.1临床资料
取2015年4月-2016年5月对疑似不合格食品、蛋品样本从从业人员中收集的71份检材作为研究对象。其中，13份牛肉粉，10份果脯、7份面包、8份鸡粉、5份鸡肉粉、9份牛肉膏、9份淀粉、7份虾粉、3份酱油粉。取样遵循无菌操作进行。
1.2 试验及仪器
为了保证试验的顺利完成，采用的主要仪器和试剂主要由沙门氏菌属多价诊断血清、沙门氏菌参考菌、大肠杆菌、缓冲蛋白冻水、恒温培养箱、生物梅里埃微生物分析系统、凝胶成像系统等。
1.3 方法
对材料样品进行增菌、分离培养并进行多态性分析。（1）病原菌分离、培养。①前增菌。无菌称取25g样品，加入225mL带玻璃珠（直径为3-4mm，约50粒）的BPW的三角瓶中，旋涡振荡1min，充分混合均匀，连续培养10h，温度控制在36℃。②选择性增菌。轻轻摇晃培养过的前增菌液，分别无菌吸取1mL，转种在10mL无菌TTB的增菌液及10mL的无菌SC增菌液中进行连续24h培养。③病菌的分离、培养[3-5]。将制备的增菌液轻轻摇晃，无菌挑取增菌液，分别接种在XLD琼脂平面、BS琼脂平面及HE琼脂平面上，根据国际要求进行培养，培养完毕后观察各个平板上是否存在典型或可疑的沙门氏菌，根据划线区域数量选择视样品的污染程度而定，通常选择能分离到的单菌落为宜。利用沙门氏菌参考菌株大肠杆菌作为对照。将获得的病原菌进行初步筛选，对于疑似沙门氏菌继续进行生化试验和血清学凝集试验[5]。（2）多态性分析。利用随机引物5’-AGCGGGCCAA-3’对分离培养获得的病菌进行随机扩增多态分析。设置反应总体系下：35uL培养菌种加入3.5uL含有10×buffer、20um引物、2.5nM MgCl2、1.5U Taq酶、2.0uL细菌DNA粗制模板。设置PCR循环参数：94℃下进行3min预变性，94℃下1min、36℃下1min、72℃下1min，连续进行30次循环，然后72℃下10min延伸，在1.0琼脂糖凝胶上放置17uL扩增产物进行电泳，连续电泳1.5h，采用凝胶成像系统对相关数据进行处理。
1.4统计分析
采用SPSS18.0软件处理，计数资料行 检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（ ）表示，P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1 病原菌分离、培养结果
71份检材共分离出190株病原菌，分离得到的可疑菌落有的在XLD上生长出纯黑色的单个菌落，有的在HE上长出黑色周围无色半透明的单个菌落，有的在BS琼脂平板上生长出灰绿色菌落。对于可疑典型菌落分别标注：S1-S11，与国家标注所述沙门氏菌形态一致，见表1。
3.讨论
沙门氏菌是食源性疾病中常见的病原菌，可以随污染的食物、饲料和水源等经口感染进入小肠，并且在人体中定植，产生相应的肠毒素，引起腹泻、呕吐。同时，细菌侵入肠下部的集合淋巴结以及淋巴滤泡，经过淋巴达到肠系膜淋巴结并大量增殖，毒素进入血液时会伴有发热、全身不适等症状。本研究中，71份检材共分离出190株病原菌，分离得到的可疑菌落有的在XLD上生长出纯黑色的单菌落，有的在HE上长出黑色周围无色半透明的单个菌落，有的在BS琼脂平板上生长出灰绿色菌落。对于可疑典型菌落分别标注：S1-S11，与国家标注所述沙门氏菌形态一致[7]。同时，为了进一步验证病原菌的类型，对病原菌进行多态性分析，结果显示：190株病原菌中11株进行PCR检测，11株分离株均扩增出443bp的特异亮带，而大肠杆菌标准菌株中阴性对照中则无条带扩增，提示分离的菌株均为沙门氏菌。因此，相关检验检疫部门应该及时采取有效的措施进行干预，加强对原料的检验、卫生监督及卫生处理，保证卫生处理安全、有效。同时，相关部门还应该加强卫生知识的宣传教育，提高自我防护能力，加强劳动保护，改善劳动条件，提高高危人群的抗病和防病能力，必要时可以接种相关疫苗，保证从业人员的安全[8]。对于沙门氏菌致食源性疾病确诊患者，则应该及时采取有效的方法进行治疗、干预，提高临床治疗效果，促进患者早期恢复。
综上所述，沙门氏菌致食源性疾病发生率较高，应结合流行病学调查资料、临床资料加强病原菌鉴定及扩增DNA多态性分析，及时采取有效的措施进行干预。
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论文作者:周爱华
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年2月第2期
论文发表时间:2017/3/20
标签：沙门氏菌论文; 病原菌论文; 菌落论文; 多态性论文; 琼脂论文; 食源性论文; 菌株论文; 《中国蒙医药》2017年2月第2期论文;