曾雪嘉[1]2004年在《转不同抗菌肽和几丁质酶基因烟草的抗病性研究》文中认为真菌病害是导致作物减产的重要因素之一，利用广谱抗真菌新资源和新基因培育持久抗病新品种是农业食品安全的重要保证。建立在分子遗传学、分子生物学基础上的基因工程技术为之提供了一条可行的途径。利用转基因技术将抗病基因转入植物，来提高植物的抗病性是目前培育抗病品种的重要策略之一。 本实验以本明烟(Nicotiana benthamiana)的叶盘为受体，通过农杆菌介导法将不同来源的基因(SPCEMA：加有信号肽的CEMA基因，AFP：来源于苜蓿的防御素基因，CHI：来源于苦瓜的几丁质酶基因以及双价SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA基因)导入烟草，进行了抗病性检测，并比较了不同转基因植株的抗病效果，从而为它们的进一步利用提供依据。其主要结果如下： 1．抗病检测体系的建立 通过对培养疫霉菌的培养基配方和培养方法的比较，确定疫霉菌在芝麻培养基上生长较好，且获得了一种能产生大量致病力强的游动孢子囊的培养方法，使疫霉菌游动孢子囊的量从5×10~4个／ml提高到1.5×10~5个／ml。同时确定了疫霉菌和赤星病菌的接种浓度，疫霉菌浓度为1×10~4个／ml，赤星病菌浓度为5×10~5个／ml。 2．转目的基因烟草的获得 取烟草无菌苗叶片，切成0.5cm~2大小的叶盘，放入OD_(600)值为0.1～0.2的农杆菌菌液中，轻轻振荡侵染5min后，立刻倾去菌液，取出外植体转入表面铺有一层滤纸的共培养基MSB_1(MSB_0+2.0mg／L BA+0.1mg／L NAA)上，24℃，暗处共培养3d。共培养完成后，将外植体直接转入筛选培养基MSB_2(MSB_1+500mg／L Cef+100mg／L Km)中进行分化培养，每3周继代一次。待抗性芽长出，将其切下转入生根培养基MSB_3(MSB_0+200mg／L Cef+150mg／L Km)中筛选生根。 3．转基因植株分子生物学鉴定 首先对筛选到的抗性植株进行GUS组织化学检测，初步筛选确定已转化植株。对GUS西南农业大学硕士学位论文摘要阳性的植株做PCR扩增检测，结果显示每个GUS阳性株系均显示与阳性对照相同的特异带，非转化植株未得到与阳性对照相同的特异带。初步证明6个基因已整合到烟草基因组中，获得的GUS阳性植株是转基因烟草。4.转基因植株抗病性检测4.1转基因植株T。代疫霉菌接种实验 将T0代转基因烟草进行疫霉菌接种实验，结果表明:转基因烟草与对照相比抗性明显增强，6个基因的病情指数从低到高依次为AFP-C川引.67%、APP一SPCEMA5833%、SPCEMA一CH160.87%、AFP63.71%、SPCEMA63.89%、CHI70.54%，而对照的病情指数则为100%。其中叁个双价基因烟草的抗病性较好。4.2转基因植株T:代赤星病菌接种实验 将T，代转基因烟草进行赤星病菌接种实验，结果表明:转基因烟草与对照相比抗性明显增强，6个基因的病情指数从低到高依次为AFP一CH137.sl%、AFP一SPCEMA39.69%、SPCEMA一CHI4O%、AFP51.25%、SPCEMA55.63%、CHI56.25%，而对照的病情指数则为100%.说明这六个基因对真菌病都有一定的抗菌作用，并能在后代中稳定遗传与表达。我们又从每个基因中随机选取了四个株系，接种烟草赤星病菌，比较各株系的抗病性。结果表明:不同基因不同株系间抗病效果有差异，以AFP一CHI基因为最好，其各个株系的病情指数均较低。5.转基因植株遗传稳定性鉴定 每个转基因烟草随机选取2个株系，萌发其T:代种子300粒左右，萌动后进行GUS染色，x。2适合性测验结果表明其外源基因的传递符合孟德尔规律，呈3:1单基因显性的孟德尔式分禺。
谢咸升, 董建臻, 李静, 李永利, 王圆圆[2]2011年在《抗菌肽控制植物病害研究进展及展望》文中指出总结了抗菌肽(AMPs)的研究概况,分析了转抗菌肽基因植物以及昆虫抗菌肽控制植物病原真菌的研究进展,展望了其研究趋势,可为开发利用可控制植物病害的抗菌肽提供参考。
谢咸升[3]2011年在《不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性及其Tricine-SDS-PAGE分析》文中研究指明本论文以饥饿处理后的黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫为试验材料,通过饲4株细菌、针刺后饲10株真菌、1株放线菌诱导免疫,经研磨、加热、冷冻离心法获得抗菌肽提取物,采用抑菌圈法测定其对24种植物病原真菌和2种动物病原细菌抑菌活性,利用叁等分法划分四种类型评价抑菌活性及抑菌谱;计算抑菌活性前3位处理的频次;用Tricine-SDS-PAGE法分离纯化、Gel-Pro analyzer软件分析不同菌源诱导免疫所产生的抗菌肽差异,测定主要活性成分的分子量。结果如下:1、不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性上存在明显差异不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性较好的有番茄灰霉病病菌、黄瓜灰霉病病菌、白菜黑斑病病菌、辣椒根腐病病菌等,其中采用球孢白僵菌(家蚕)诱导后的提取物对番茄灰霉病病菌最大抑菌活性直径达到6.23mm,而采用浅灰链霉菌诱导后的提取物对小麦根腐病病菌最大抑菌活性直径达到0.94mm。对番茄灰霉病病菌、甘薯软腐病病菌的高活性、中活性区处理数之和最高(32个),各占总处理数(60)的53%,而对甘薯黑斑病病菌高活性、中活性区处理数之和最低(2个),占总处理数的3%;对甜瓜炭疽病病菌无活性处理数最高(44个),占总处理数73%,而对金黄色葡萄球菌无活性处理数最低(4个),占总处理数7%。2、黄粉虫抗菌肽诱导处理间在抑菌谱方面存在明显差异与对照组相比,经枯草芽孢杆菌、Bt、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌诱导第1、2、3天诱导处理在高活性、中活性、低活性区抑菌水平抑菌谱数目增加,无活性抑菌谱数目明显减少,其中枯草芽孢杆菌诱导抑菌活性最为明显;经虫生真菌及生防放线菌浅灰链霉菌诱导处理绝大部分抑菌谱数在高活性区明显增加,中活性区增加,无活性区明显减少,而经普通真菌干酵母诱导处理基本维持在对照水平上。值得注意的是抗菌谱种类不尽相同。3、黄粉虫抗菌肽抑菌活性前3位诱导处理频次上存在明显差异频次顺序依次为生防细菌、虫生真菌、杀虫放线菌及动物病原细菌等,其中枯草芽孢杆菌诱导处理出现频次最高,达到11.5,球孢白僵菌(家蚕)、Bt、CK(水)诱导处理出现频次最低,达到2.6,最高频次是最低频次的4.4倍左右。生防微生物可以更好地诱导昆虫抗菌肽的表达。4、不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽种类有一定差异不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽种类不完全相同,同一菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽种类、数量随提取时间也存在一定差异。获得了4.2kD、5.2kD、6.6kD、6.9kD、11.0kD、12.6kD、13.2kD、14.7kD、17.8kD、18.7kD、23.6kD、24.4kD、25.1kD、25.3kD、25.8kD、26.0kD、27.6kD、28.5kD(已报道的在4.5kD左右)等一系列多肽条带(电泳纯)。例如对番茄灰霉病病菌效果好的球孢白僵菌(家蚕)诱导后第2天提取的黄粉虫抗菌肽表达了5.2kD、6.6kD、11.0kD、18.7kD等多肽。5、选择适宜的诱导方式和提取时间对发掘抗菌肽资源非常重要本研究发现:诱导物种类和提取时间对诱导抗菌肽的种类、数量和活性有较大影响;不同诱导方式和提取时间所获抗菌肽种类和数量上的不同,是其抑菌活性和抑菌谱差异大的主要原因;抗菌肽的诱导表达存在着复杂的调控机制;诱导型抗菌肽在抑菌活性中起主要作用。
丁志娟[4]2013年在《适用于单子叶植物的LIC载体的构建及动物抗菌肽在水稻抗病育种中的应用》文中进行了进一步梳理在过去的几十年间,研究人员用农杆菌转化法获得了多种转基因植物,该转化法依赖于农杆菌中存在的Ti质粒。目前应用较多的是传统双元载体和Gateway系统,但是传统双元载体使用时较复杂浪费时间,而Gateway系统虽然使用方便但是价格较昂贵,并未大量采用。在使用传统双元载体时经常会遇到多种问题：酶切位点不合适、同时连入多条片段困难等。而LIC双元载体可以弥补这些不足,并且使用价格便宜,但是用于单子叶植物转化的LIC双元载体并没有得到发展。因此,本文以pCAMBIA和pGA系列载体为基础,构建了一组用于单子叶植物转化的LIC双元载体,可用于基因表达分析、蛋白定位分析和启动子功能分析。这是一组可以快速构建的载体,且使用价格便宜。这套载体使用时不需要考虑多克隆位点的酶切位点是否合适,任何片段只须加15bp的特异接头即可连入载体,且每套载体均有Bar和Hyg两种抗性标记基因,所以同一基因可以同时连入两个载体用于不同植物的转化。并且,这套载体用于菌体筛选的抗性标记基因是Kan抗性基因,Kan相对稳定,筛选效率高,使用方便有效。这组载体为以后的顺利实验奠定了基础。植物基因工程是水稻抗病育种的重要方式,这种方式可以在不改变水稻原始性状的基础上使转基因植株获得预想的抗性性状。为了提高植物的抗病性,不同来源的抗性基因以被转化进入植物,包括植物本身的抗病通路的基因,以及来源于植物和非植物的抗菌肽基因。抗菌肽具有独特的抗菌机制,且具有广谱抗菌性,能作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,但是对正常的真核细胞几乎没有作用,且不易产生耐药性。将抗菌肽基因转化进入植物使植物获得抗病性已有较多的成功例子。本文首先通过对农杆菌转化过程进行优化,使转化效率得到了较大的提高。将来源于中国明对虾的叁种抗菌肽基因(ALF、WAP、Penaeidin)转化水稻,经检测,分别获得TO代转基因植株5、7、2棵,经PCR扩增、Southern Blot杂交验证与抗除草剂表型鉴定分析,证明目的基因稳定存在于T1代转基因植株基因组中。基于抗菌肽的广谱抗菌性,可以对己获得的转基因植株进行抗病性分析,期望能提高水稻的抗病性。
参考文献：
[1]. 转不同抗菌肽和几丁质酶基因烟草的抗病性研究[D]. 曾雪嘉. 西南农业大学. 2004
[2]. 抗菌肽控制植物病害研究进展及展望[J]. 谢咸升, 董建臻, 李静, 李永利, 王圆圆. 河北农业科学. 2011
[3]. 不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性及其Tricine-SDS-PAGE分析[D]. 谢咸升. 河北农业大学. 2011
[4]. 适用于单子叶植物的LIC载体的构建及动物抗菌肽在水稻抗病育种中的应用[D]. 丁志娟. 山东大学. 2013