【摘 要】目的：对现阶段应用最为有效的HPLC法对维生素C咀嚼片中维生素C以及糖的含量进行同时测定进行分析，以判定其所具有的测定质量。方法：选用适量磷酸二氢钾进行超声提取，将其静置于阴凉处，直到冷却到室温后，便进行定容刻度，然后用适量清液进行过滤处理，选用相应色谱柱，实行分离，用磷酸二氢钾减去乙腈得到流动相，判定流速以及柱温，利用示差折光检测器来进行检验。结果：在10μg～100μg之间，每一种选取的物质都表现出良好的线性关系，而且，r≥0.9980，检出限为1μg，回收率为96.9%～101.0%，RSD为5.12%～8.51%。结论：通过本文的实验可以了解到，用HPLC法对维生素C咀嚼片中的维生素C以及糖进行同时测定，是一种又快又准确的方法，并且该方法还可以应用到葡萄糖以及果糖等众多物质的测定中。
【关键词】HPLC法；维生素C咀嚼片；维生素C；糖；含量测定
现阶段，相关人员对维生素C咀嚼片中糖的含量进行测定的过程中，选用的均是有容量法以及分光光度计法这两种方法。然而这些方法都是依靠糖的还原性来展开测定的，而维生素C本身所具有的还原性就比糖所具备的还原性大，因此，采用这些方法对维生素C咀嚼片中的糖含量进行测定，会出现干扰还原反应。为了能够准确测定出维生素C咀嚼片中糖的含量，同时还能够测定出维生素C的含量，本文就结合高效液相色谱法，简称HPLC，利用其所具有的高效液相色谱-示差折光法来展开测定研究，具体内容如下。
1、材料与方法
1.1仪器与试剂
高效液相色谱仪，配备四元梯度泵，脱气机，自动进样装置(可控温)，示差检测器;超纯水;超声波萃取仪。葡萄糖(＞99%，批号:50－99－7)、果糖(＞99%，批号:57－48－7)、蔗糖(＞99%，批号:57－50－1)、维生素C标准品(优级纯，批号:20130504);维生素C咀嚼片(批号:20130825);乙腈(色谱纯，批号:A998－4);磷酸二氢钾(分析纯，批号:790210－3);乙酸铵(分析纯，批号:20101118)。
1.2方法
1.2.1配制标准的溶液
精确称量出100mg的葡萄糖、果糖、蔗糖以及维生素C的标准品，将这四种物质分别放置到容量均为10ml的容量瓶中，然后选用适量的磷酸二氢钾溶液，选用的量控制为0.02mol/L，将磷酸二氢钾溶液分别倒入这四个容量瓶中，充分溶解后进行定容处理，控制好混合标准液的浓度，将其控制为10mg/ml。
1.2.2色谱条件
色谱柱:Xbridge Amide(4.6mm×250mm，3.5μm);流动相:0.02mol/L磷酸二氢钾(pH=5.7)－乙腈(25∶75，V/V);流速:0.8ml/min;柱温:35℃。
1.2.3处理样品
称取适量的粉碎性样品，样品要均匀粉碎，同时要确保称取量的准确性，将称取的样品放到准备好的容量瓶中，该容量瓶的容量为100ml，然后放入磷酸二氢钾溶液，溶液浓度为0.02mol/L，加入的溶液量为80ml，然后进行超声提取处理，时间控制为20min，随后将溶液静置，直到冷却到室温后进行定容和刻度。取用0.45μm的滤膜对上清液进行过滤处理，最后利用HPLC对过滤后的滤液进行分析处理。
2、结果
2.1选择适合的检测器
就果糖、葡萄糖以及蔗糖的属性来说，其属于多羟基醛酮，而且这些物质在紫外区会出现末端吸收的情况，虽然吸收的系数相对来说较低，而且也没有较好的灵敏度，但是毕竟有吸收情况，所以检测结果难免会出现误差，从这一点上来说，利用紫外检测器对这些物质进行测定并不合适。而利用流动相作为磷酸盐缓冲体系，所以没有选用灵敏度相对来说较高的蒸发光散射检测器进行检测工作。因此，检测最终选择的检测器就是示差折光检测器，一般来说，含有丰富维生素C的保健食品，其中的成分都按照百分含量来计算，在检测上，也只有示差折光检测器能够满足检测的要求。
2.2色谱柱选择
维生素C、果糖、葡萄糖和蔗糖的极性较大，选择通用型较强的C18色谱柱，各成分几乎不保留，无法达到基线分离，所以选择氨基柱进行分析。本次试验在相同的流动相条件下，比较了依利特HypersilNH2(4.6mm×250mm，5μm)、XbridgeAm-ide(4.6mm×250mm，3.5μm)和AgilentZorbaxNH2(4.6mm×150mm，5μm)这3种色谱柱，最终确定了柱效高、分离度好的XbridgeAmide柱子作为本实验所用的色谱柱。
2.3流动相的选择
流动相使用水－乙腈(25∶75，V/V)时，果糖、葡萄糖和蔗糖有较好的分离度，维生素C的酸性较强(pKa=4.17)，在氨基柱上的分析条件比较苛刻。分别使用0.1%氨水(pH=9.2)、0.02mol/L磷酸氢钾(pH=5.7)、0.02mol/L磷酸氢钾(pH=3.4)作为水相，在pH=9.2和pH=3.4这2种情况下进行测定，30min内未见维生素C流出;在pH=5.7的情况下，维生素C在8.66min时流出，峰形略微前展，这可能是由于酸性物质在氨基柱上分析，存在一定的离子交换引起的。为改善峰形的前展，分别使用0.02mol/L乙酸铵(pH=5.7)和0.02mol/L硫酸钠作为水相。在使用0.02mol/L乙酸铵的情况下，30min内未见维生素C流出;0.02mol/L硫酸钠虽然对维生素C的前展略有改善，但却影响了果糖、葡萄糖和蔗糖的分离度。综合考虑各种因素，最终选择0.02mol/L磷酸氢钾(pH=5.7)－乙腈(25∶75，V/V)为流动相。
2.4标准溶液和典型样品色谱图分析
分别取标准溶液和典型样品按上述色谱条件进行测定，结果维生素C、果糖、葡萄糖和蔗糖的保留时间分别为8.660min、9.867min、11.557min和16.087min，分离效果良好。
2.5标准曲线与线性范围
分别取上述标准溶液1.0μl～10μl进样，各组分以含量(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程和相关系数如表1所示，相关系数r≥0.9980，在10μg～100μg时线性关系良好(表1)。
表1 各检测物质的线性关系和相关系数
2.6精密度和回收率测定
向已测典型样品试样中加入各混标量4.00g，加0.02mol/L磷酸二氢钾溶液溶解并稀释至100ml，按上述方法进行测定，每个样品连续测定5次，根据加标量与检出量计算回收率和精密度。结果显示，各物质的回收率为96.9%～101.0%，精密度的RSD为5.12%～8.51%，能够达到分析方法的要求。
3、结论
众所周知，人体中重要的元素中就包含着维生素C，可以说，维生素C是人体必不可少的一个营养元素，如果人体少了这种营养元素，就会很容易患上坏血症。最近几年，相关人员发现维生素C还能够起到增强机体免疫力，对抗肿瘤的效用，同时其还能够起到阻碍化学致癌的作用。
为了能过检测出维生素C咀嚼片中维生素C以及糖的准确含量，采用了HPLC法，利用该方法可以通过测定维生素C以及糖的含量，本文就借助高效液相色谱法来进行分析，该方法不仅具有较高的回收率，而且具有良好的重复性，可以说，这是一种简单、高效、快捷的测定方法，这一方法不仅可以应用到维生素C咀嚼片的测定中，同时也可以应用到葡萄糖以及果糖等多种物质的测定中。因为本文的实验选择了维生素C咀嚼片作为实验的主要对象，所以其他的试剂是否也适用，就要求相关的人员进行进一步的探究，以进一步确定HPLC法测定的应用范围。
参考文献：
[1]曾翔云.维生素C的生理功能与膳食保障[J].中国食物与营养，2015(4):52－54.
[2]刁春霞，张雪梅，刘波.干红葡萄酒中总糖测定方法的改进[J].中国酿造，2016(5):165－166.
[3]张永勤，薛长湖，汤浩源，等.还原糖的可见分光光度法研究进展[J].食品与发酵工业，2014，33(5):97－99.
[4]张昉，高蓉.维生素C检测方法研究进展[J].中国卫生检验杂志，2015，19(2):457－460.
[5]李学梅，杨章萍，丁友昌，等.高效液相色谱法测定保健食品中维生素C、芦丁的研究[J].中国卫生检验杂志，2014，12(4):416－417.
论文作者:陈春凤
论文发表刊物:《世界复合医学》2017年第5期
论文发表时间:2017/9/5
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