江苏省苏州科技城医院
摘要：根据微生物药敏反映的相关理论与实践研究，目标对溶血性链球菌进行微生物鉴定，对其抗药性进行实验评估，深刻掌握溶血性链球菌的生物药敏机理和感染机制。方法本实验采用病料分离、PCR鉴定、镜检、药敏试验、攻毒试验与微生物化学试验等。结果显示左氧氟沙星、氟苯尼考、头孢曲松、阿莫西林与磷霉素等对该菌的抑制效果很明显，为溶血性链球菌的深层研究提供基层研究参考。
关键词：微生物；药物敏感性；溶血性链球菌；
1.材料与方法
1.1 病原菌分离及镜检
本实验于2016年4月采集溶血性链球菌，无菌接种于普通绵羊血平板。获得细菌后染色、镜检于纯化，并进行溶血试验分析。其中，染色用的是革兰氏染色，镜检、纯化步骤分别如下：
选取载玻片一张并拭净；用灭菌的接种环选取生理盐水一滴，放于载玻片中的中央，挑选取血平板上直径0.1毫米至至1.0毫米、半透明、灰白色、圆形、表面光滑、边缘整齐的单独菌群。将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内磨匀，涂成直径约1厘米尺寸的菌层。手持玻片，让菌膜朝上，通过火焰烘烤2至3次固定。将玻片置于空气中，使其自然干燥。加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1至2min，然后用水冲洗，滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1min，用水冲洗加95％酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复2至3次用水冲洗。然后加番红花红，染色约1min后保持干燥。干燥后用显微镜察看，如果革兰染色阳性、成对或有链状排列的球形细菌为可疑菌群。36℃ 纯培养可疑菌群, 24 小时 后再次进行革兰染色,对镜检为革兰染色阳性、成对、短链球菌,接种于无菌血平皿36℃培养26小时后, 并置于4℃冰箱储存备用。
1.2 培养基分析
称选取9.6g改良马丁液体培养基粉溶于180毫升超纯水，高压高温灭菌后，凉至60℃左右分装至试管中，每管2至4毫升，3℃储存。称选取16.05g改良马丁液体培养基粉溶于280毫升超纯水，缓慢加入5.5g琼脂粉，高压高温灭菌后，凉至60℃左右倒平皿，直径9厘米的平皿每皿15至20毫升，4℃储存。称选取16.05g改良马丁液体培养基粉溶于280毫升超纯水，缓慢加入5.5g琼脂粉，高压高温灭菌后，凉至60℃左右，缓慢加入5%血清和0.2%的裂解血，混合溶解倒平皿中4℃储存。
2.病原菌微生物化学试验
2.1 糖发酵实验
将实验菌株分别接入麦芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、菊糖、β至半乳糖苷、阿拉伯糖、肌醇、鼠李糖、甘露醇、卫矛醇、木糖和山梨醇等微生物化学试剂管中封存36℃培养26小时，察看分析实验结果。
2.2药敏试验
按标准纸片琼脂扩散法操作，将药敏纸片贴在划满病原菌种的血平皿上，放置26小时36℃温箱，并保持纸片间适度距离。本次实验共用9种药品：阿米卡星、新霉素、庆大霉素、阿莫西林、头孢曲松、磷霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考和磺胺甲恶唑等。
2.3 病原菌PCR鉴定
本实验所做的PCR鉴定内容，主要目的在于检验菌株是否含有GDH基因。溶血性链球菌的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族。通过核酸序列分析表明，GDH基因包括一个开放性框架，具有编码448个氨基酸残基，在细胞表面酶活性是NAD(P)H依赖型，作用底物为L一谷氨酸，其编码基因在SS2中存在。SS2的GDH有保守的抗原性，能与感染有毒溶血性链球菌的溶血性链球菌的血清反应，可作为检测溶血性链球菌的重要标志性抗原。若获得GDH基因，则证明该菌株为溶血性链球菌，而且较大实验结果可能会为溶血性链球菌。
2.3 PCR模板的制备
将菌株接入液体培养基，36℃摇床培养16小时后，按照DNA提选取试剂盒使用说明书进行DNA提选取：选取0.5至2毫升培养菌液，0.9万最高转速，离心30秒弃上清，提取菌体，尽可能会吸净上清。缓慢加入200微升缓冲液RB重悬洗涤细胞，0.9万最高转速，离心30秒,弃上清后将细胞吹打重悬于200微升缓冲液RB中。缓慢加入50至90微升溶菌酶上下混合溶解，36℃温浴1h。0.9万最高转速且离心2min，弃上清后将细胞吹打重悬于200微升缓冲液RB中。缓慢加入200微升结合液CB，立即急速摇动上下充分混合溶解，再缓慢加入20微升蛋白酶K（20mg/毫升）溶液，充分混合溶解，60℃置于9min。冷却后，缓慢加入90微升异丙醇，急速摇动上下充分混合溶解，此时可能会出现絮状沉淀。
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将上一步所得溶液和絮状沉淀都缓慢加入一个吸附柱AC中， 0.9万最高转速离心30秒，清空提取管中的废液。缓慢加入500微升抑制物去除液IR，1.2万最高转速 离心30秒，弃废液。缓慢加入600微升漂洗液WB，1.2万最高转速离心30秒，弃废液。缓慢加入500微升漂洗液WB，1.2万最高转速离心30秒，弃废液。将吸附柱AC放回空提取管中，13 000最高转速 离心2min，尽量出去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。选取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加90微升洗脱缓冲液EB，室温置于3至5min，1.2万最高转速离心1min。将得到的溶液重新缓慢加入离心吸附柱中，室温置于2min，1.2万最高转速离心1min。DNA暂时存放在4℃中，长期存放时放在至20℃环境。
2.4 病原菌毒力实验
血平皿活化菌种，挑选取单菌群，选取链球菌接种于马丁汤（加4%血红素），36℃培养16至18 小时，进行活菌计数。选取马丁汤培养基液0.2毫升静脉注射1.5～2.0kg家兔，接种2只兔子，同时进行活菌计数；设置空白对照2只，注射等量生理盐水。家兔死亡后，剖解家兔，选取心血接种血斜，36℃培养26小时。同时选取家兔心血分装小试管，置至21℃储存。
3.实验结果
3.1镜检结果及分析
将病料接种在鲜血培养基上，将各菌种纯化分离，察看可疑菌株生长良好，菌群呈圆形，光滑隆起透明，灰色的露珠状小菌群，并产生显著的β 型溶血。将在鲜血培养基上的可疑菌群接种在麦康凯琼脂培养基上无细菌生长。在普通培养基上有菌群生长但生长不良。挑选取鲜血培养基上的典型菌群，进行革兰氏染色、镜检，可见革兰氏阳性、短链状或单在的球菌，菌体直径0.1至0.2um。
3.2微生物化学试验结果及分析
主要针对溶血性链球菌的糖发酵的微生物化学试验，从实验结果中可以看出，葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖的微生物化学试验管均由蓝紫色变成黄色，菊糖由浅色变成粉色，且这些变色的微生物化学试验管均未发现有气体出现，综上所述，该病原菌可发酵以上5种糖类，但产酸不产气。而ONPC、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇、卫矛醇、甘露醇、山梨醇、木糖等的微生物化学试验管均未变色也未产生气体，说明该病原菌不能酵解以上糖类。以上实验结果与我们预期判断基本一致。
3.3药敏试验结果及分析
实验结果显示，药敏纸片从上顺时针分别是头孢曲松、磷霉素、阿米卡星、阿莫西林、氟苯尼考、新霉素、磺胺甲恶唑、左氧氟沙星等；其中中间为庆大霉素。磺胺甲恶唑、新霉素、庆大霉素和阿米卡星对该病原菌无抑菌性或效果很较小，其他药品抑菌环直径分别为：头孢曲松3.040厘米、磷霉素2.360厘米、氟苯尼考2.460厘米、左氧氟沙星1.634厘米和阿莫西林1.69厘米等。实验结果表明该病原菌对庆大霉素、阿米卡星、磺胺甲恶唑敏和新霉素感度低、抗药性强；对磷霉素、头孢曲松、阿莫西林、氟苯尼考、左氧氟沙星等敏感度高、抗药性弱，临床用药可供参考。
4.讨论
溶血性链球菌通常在扁桃体定居,可分为34个血清型, 在致病性血清型中2型的致病力最强, 发病率高, 流行范围广, 其次是1型和9型。镜检菌群形态和溶血现象与链球菌相符；微生物化学试验结果中，除菊糖和ONPC外，其他试剂管的情形符合预期判断情形；通过PCR检测该病原菌确带有GDH基因，GDH基因为溶血性链球菌特征性基因，因此，该病原菌为溶血性链球菌。经过的动物攻毒试验，各组织器官出现显著溶血性链球菌感染症状至至肺脏病变出血、脾脏肿大、肠系膜淋巴结出血、脑部出现出血水肿、心肌和肾脏病变等。溶血性链球菌是革兰氏阳性菌, 理论上很多药品对其有疗效。因此，对病溶血性链球菌或可疑溶血性链球菌采选取药品防治时，对于药品的选用应最好通过药敏试验来确定，防止抗生素使用不当或经常使用而产生耐药性。在对该链球菌进行药敏试验时，察看结果可见，左氧氟沙星、氟苯尼考、头孢曲松、阿莫西林与磷霉素等对该菌的抑制效果很明显，其次，每年要定期用链球菌弱毒活菌苗接种。溶血性链球菌病血清型较多, 不同溶血性链球菌场发生溶血性链球菌病的血清型可能会不同, 对药品的敏感性也不同。同一个血清型,即使在同一个溶血性链球菌场不同时期、溶血性链球菌只的不同生长阶段对药品反映敏感性也可能会不同。因此,定期对菌株进行耐药性监测也是控制和治疗溶血性链球菌病的必要措施。
参考文献：
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论文作者:许婷婷
论文发表刊物:《医师在线》2016年6月第11期
论文发表时间:2016/8/5
标签：链球菌论文; 溶血性论文; 培养基论文; 病原菌论文; 阿莫西林论文; 微生物论文; 头孢论文; 《医师在线》2016年6月第11期论文;