周艳君[1]2005年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中认为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS)是一种以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为主要特征的传染病。由于PRRSV以侵害免疫系统为主,且易发生变异,可造成持续感染,而且具有抗体依赖增强作用,致使对该病的诊断和预防带来了很大困难。而通过单克隆抗体技术对PRRSV抗原表位进行深入研究,不仅有助于了解PRRSV抗原结构与功能的关系,而且对该病的诊断以及设计安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意义。 本研究首先构建了含PRRSV CH-1a株各结构蛋白的重组表达载体pET30a-N、pGEX6p-rtM、pGEX6p-rtGP5、pET30a-GP4、pGEX6p-rtGP3和pGEX6p-rtGP2,并在大肠杆菌中进行了表达,利用PRRSV感染猪血清对表达产物进行Western blot分析,证实表达的六个融合蛋白都具有较好的反应活性。然后以PRRSV和表达的融合蛋白为抗原,免疫BAL B/c小鼠,最终共获得了16株针对N蛋白的单抗,15株针对GP5蛋白的单抗,5株针对GP3蛋白的单抗以及针对M蛋白、GP4蛋白和GP2蛋白的单抗各1株。 将N蛋白基因分为四个相互重迭的基因片段,对16株抗N蛋白的单抗进行鉴定,结果显示有7株单抗既能特异性识别ORF7-N2又能识别ORF7-N3的表达产物,其余9株单抗仅与全长的N蛋白发生反应,而不识别四个分段融合表达蛋白,推测9株单抗的抗原表位为构象依赖性抗原表位。将片段N2和N3相互重迭的部分(49-70aa)分成一系列小的基因片段,对7株单抗鉴定结果显示,有6株单抗能特异性识别融合多肽NEP3(49-58aa),而另外一株单抗N1H11对以上7个融合多肽均不识别,仅对49-70aa编码的肽段表现出了较弱的反应性,推测49-70aa仅是单抗N1H11抗原表位的一个组成部分。通过对NEP3从N端和C端进行一系列截短分析,确定了6株单抗抗原表位的主要功能区域,其中单抗N2H7识别的主要功能区域为H~(54)FPLA~(58)。单抗N2F7识别的主要功能区域为K~(52)PHFPLA~(58)。单抗N1A2、N1E3、N1G4、N2E5识别的主要功能区域为E~(51)KPHFP~(56)。对欧美分离株氨基酸的序列比较结果显示这叁个相互重迭的抗原表位在所有欧美分离株中都是高度保守的。而且利用PRRSV感染猪血清进行Western blot分析,结果表明抗原表位NEP3在PRRSV感染时具有较好的免疫优势。与LV株中由51-67aa和80-90aa共同组成的构象抗原表位不同,我们鉴定的抗原表位51-56aa、52-58aa和54-58aa虽然包含在这个构象表位之中,却是一个独立的线性免疫优势抗原表位,且位于核定位信号序列内部。 利用M基因两个相互重迭的片段M1(84-134aa)和M2(113-174aa)的融合表达产物对单抗M2B3进行检测,结果表明单抗M2B3既能识别M1又能识别M2基因片段的表达产物,推测其抗原决定区域位于二者相互重迭的部分112-134aa。选取二者重迭区域112-134aa并分别从N端和C端进行一系列截短,利用融合多肽ELISA对单抗M2B3进行鉴定,结果显示单抗M2B3不仅能特异性识别MEP1(112-134aa)而且还识别MEP2(117-134aa)和MEP3(112-129aa),但对其他融合多肽都不识别,据此确定117-129aa是单抗M2B3的主要抗原性区域。PRRSV感染猪血清中对MEP1～MEP3融合多肽进行Western blot分析结果显示,叁个融合多肽都能被感染猪血清特异性识别,因此确定表位117-129aa是PRRSV的优势抗原表位,
李琳[2]2014年在《高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原区域的鉴定》文中认为高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome，HP-PRRS）是一种烈性的病毒性传染病，病死率很高；HP-PRRSV可以导致机体免疫抑制而继发其他疾病。该病在全国范围内传播较广泛，极大的危害了我国养猪业的发展，经济损失十分严重。为制备HP-PRRSV HuN4株单克隆抗体(MAbs)，本研究以HP-PRRSV HuN4株免疫BALB/c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，通过间接免疫荧光（IFA）方法进行筛选，最终获得3株稳定分泌抗HP-PRRSV核（N）蛋白的MAbs的细胞株，分别命名为2E9、3G2和4E3，腹水针对HP-PRRSV HuN4的IFA效价为1:5120-1:10240。抗体亚类鉴定重链类型均为IgG1，轻链均为κ链。采用不同PRRSV毒株感染Marc-145细胞，IFA结果显示，3株MAbs与HP-PRRSV HuN4株，疫苗株HP-PRRSV HuN4-F112、JXA1-R、TJM-F92，经典疫苗株CH-1R、RespPRRSV-MLV均反应；而与欧洲株DV、HBL不反应，鉴定3株MAbs是美洲型与欧洲型的差异单抗。3株MAbs均能够特异性识别真核表达的HP-PRRSV HuN4株N蛋白。Western blot鉴定结果显示，3株MAbs均能够特异性识别HP-PRRSV HuN4株及原核表达的重组N蛋白，将ORF7基因截短成相互重迭的片段，在E.coli BL21（DE3）中和GST标签融合表达，利用Western blot分析重组蛋白与MAbs的反应情况，其中2E9识别的抗原区域初步鉴定为38-105aa、56-117aa区域。该结果为进一步研究HP-PRRSV N蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。
冷章明[3]2013年在《基于猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白及抗原表位的间接ELISA检测方法的建立》文中提出猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的病毒性传染病。该病以妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍,新生及断奶前仔猪高死亡率以及各年龄段尤其是仔猪的呼吸道疾病为特征。1987年该病第一次在美国被发现,1991年在荷兰分离到该病毒,1996年中国成功分离到了第一株PRRSV CH-1a株。目前该病流行于世界各养猪国家,给世界养猪业造成了巨大的经济损失,是威胁当前养猪业最重要的传染病之一。目前检测PRRSV抗体的方法有很多,在临床上主要是用ELISA的方法检测,其中以N蛋白和GP5蛋白包被居多,在临床上都有较高的符合率。本研究主要以纯化的重组N蛋白和人工合成的两个N蛋白抗原(P30和P32)表位做包被抗原,建立方法进行临床样本检测,并和商品化试剂盒(IDEXX和LSI)进行比较。主要研究内容如下：1.PRRSVORF7基因的克隆与表达通过实验室培养的PRRSV广东湛江株提取RNA做为模板,扩增ORF7基因,然后将扩增出来的基因克隆连接到表达载体pET32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,经过诱导表达并纯化出重组的N蛋白,大小为33KDa,并对N蛋白进行Western blot分析,证实其可以被PRRSV阳性血清识别,具有抗原性。2.PRRSV间接ELISA检测方法的建立及应用利用重组的N蛋白和人工合成的P30,P32等3个抗原,通过方阵滴定法确定最佳包被浓度和血清稀释倍数,并优化其相关的反应条件,建立了3种抗原的间接ELISA检测方法,并与商品化试剂盒(IDEXX和LSI)进行比较。通过已建立的重组N蛋白,P30, P32ELISA方法检测免疫猪群血清样本,与IDEXX商品化试剂盒比较的临床符合率分别为91.5%,88.3%,92.3%；与LSI商品化试剂盒比较的临床符合率分别为88.9%,77.1%,92%；同时通过本研究建立的3种方法检测感染猪群血清样本,与IDEXX商品化试剂盒比较的临床符合率分别为98.3%,95%,98.3%；与LSI商品化试剂盒比较的临床符合率分别为96.7%,90%,98.3%。以上结果可以看出3种ELISA检测方法的临床符合率都较高,其中P32为抗原的ELISA检测方法最好。
袁庆[4]2015年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白单克隆抗体制备与抗原表位筛选》文中认为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus),临床感染主要表现为发热,早产,流产,死胎和木乃伊胎等猪群的繁殖障碍和呼吸道症状。GP4蛋白是病毒粒子囊膜的组成部分,是该病毒的次要结构蛋白之一,是由ORF4基因编码的糖基化蛋白,少量存在病毒粒子中,由183或178个氨基酸残基组成,有4个糖基化位点,GP4能够诱导机体产生中和抗体,而且在细胞受体识别病毒粒子以及在病毒变异等方面具有重要意义。噬菌体展示技术研究抗原表位不仅可以证明抗原分子的具体结构与功能,还可以揭示抗原抗体的反应机制,已广泛用于研发多种多肽疫苗和新型药物。本实验以PRRSV-HUN4株为研究对象,制备了其GP4蛋白单克隆抗体并对其抗原表位进行了筛选和初步研究。本实验以原核表达的PRRSV GP4蛋白为免疫原免疫Balb/C小鼠,通过常规方法进行细胞融合,3轮亚克隆后,成功筛选出1株抗PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体,经亚类鉴定为Ig G2b型,该株抗体的稳定性与特异性较好,不仅能够与重组GP4蛋白反应,而且能够与PRRSV有良好的反应性。应用噬菌体随机肽库对制备成功的5F12单抗进行4轮生物淘选,得到10株阳性噬菌体,测序后结果为:10个噬菌体中有4个氨基酸序列相同,其12肽序列分别为AKFEVCSPVVLG、GVNQENMLHFSF、NPRIRLNFIRIG和SGVYKVAYDWQH,命名为phage-Ⅰ-Ⅳ。序列比对发现phage-Ⅰ和Ⅱ的12肽序列分别与PRRSV Hu N4株GP4蛋白第112至123位和第84至95位氨基酸序列具有很高的相似性。噬菌体竞争抑制试验与ELISA方法证实筛选出的亲和噬菌体与PRRSV及其GP4蛋白有很高的反应性,可以用于检测PRRSV及相关表位疫苗的研究,这为PRRSV病毒特性及其临床防治研究奠定理论和实验基础。
王玉娥[5]2003年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析》文中认为猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。本研究利用噬菌体展示技术，结合ELISA和基因表达等技术对PRRSV结构蛋白的抗原表位进行了鉴定与分析，为PRRSV的结构蛋白免疫特性与功能研究以及表位疫苗的设计等奠定了基础。 1．运用GoldenKey分子生物学软件对PRRSV BJ-4结构蛋白的抗原表位及其二级结构进行了分析和比较，从中筛选13段显示表位特征的氨基酸残基序列，用PCR技术扩增相应的核苷酸片段，将其插入到噬菌体表达载体M13KE，结果预测的13个表位可在噬菌体表面得以展示。 2．利用PRRSV BJ-4阳性血清和鼠源抗重组结构蛋白抗体，采用间接ELISA方法对噬菌体展示的表位进行了鉴定。结果表明，在预测的13个抗原表位中，鉴定出7个表位。GP2a的aa110～aa136(GP2110)可被鼠源抗重组GP2a抗体所识别；GP3的aa81～aa91(GP381)能够被PRRSV阳性血清和鼠源抗重组GP3抗体识别；GP4的aa53～aa67(GP453)和aa107～aa115(GP4107)可被PRRSV阳性血清和鼠源抗GP4抗体识别；GP5的aa30～aa39(GP530)、aa161～aa169(GP5161)和aa190～aa200(GP5190)可被PRRSV阳性血清和鼠源抗重组GP5抗体识别。其中，GP2110、GP453和GP530等3个抗原表位与已报道的抗原表位相似，其余4个抗原表位(GP381、GP4107、GP5161和GP5190)是新确认的PRRSV抗原表位。 3．采用噬菌体随机7肽库对单克隆抗体GE3识别的抗原表位进行了鉴定。从第叁轮亲和筛选的噬菌体中随机挑取17个克隆进行功能鉴定，结果表明8个克隆与mAb GE3具有较强的特异性结合力并可以被PRRSV阳性血清阻断，测序发现7个克隆具有核心序列：P／EKPHF，该序列与PRRSV N蛋白aa50～aa55(P／EKPHF)具有较高的同源性。用PRRSV阳性血清和鼠源抗PRRSV抗体采用间接ELISA进行鉴定，结果表明筛选到的噬菌体克隆可以与血清发生特异性反应，从而初步确定了单克隆抗体GE3所识别的抗原表位。 4．将编码单克隆抗体GE3所识别的抗原表位的核苷酸片段插入到原核表达载体pGEX-4T-2中，实现了GE3所识别的抗原表位在大肠杆菌中的表达。经SDS-PAGE分析表明，表达的GST-融合蛋白与预期大小相符。Western-blot分析表明表达产物与PRRSV阳性血清没有反应性，而ELISA分析表明表达产物可与PRRSV阳性血清和单克隆抗体发生反应。由此说明单克隆抗体GE3所识别的抗原表位可能是存在于N蛋白上以KPHF为核心的构象型表位。
蔡汝健[6]2018年在《广东省猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及防控措施》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状和断奶前后仔猪高死亡率为特征的传染病。该病于1987年首先在美国发现,1996年在我国首次被证实存在,由于PRRSV的高变异,于2006年出现了高致病性蓝耳病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失(蔡汝健等,2013)。为了更好的控制PRRS的发生,本研究对广东地区PRRS流行情况进行调查,在此基础上分离获得了1株具有经典毒株与变异毒株重组特征的PRRSV毒株GD-KP,并进一步开展了PRRSV毒株GD-KP分子生物信息学、致病性和免疫效果的研究,在此基础上提出了PRRS的综合防控方案。本研究收集2011~2015年广东不同区域疑似PRRS病料3080份,用RT-PCR进行PRRSV核酸检测,对PRRS在不同时间和不同地域流行情况进行研究。2011年~2015年5年期间,广东地区PRRSV样品核酸阳性率分别为49.3%、38.3%、34.8%、42.9%和18.8%。其中,粤东地区658份PRRSV核酸阳性率分别为42%、67%、48.1%、51%和11.9%;粤西地区1249份PRRSV核酸阳性率分别为53%、16%、32.2%、36.2%和15.5%。粤中地区537份PRRSV核酸阳性率分别为40%、46%、35.5%、51.6%、15%;粤北地区636份PRRSV核酸阳性率分别为62%、24%、23.2%、29.9%和32.9%。综上,粤东地区的PRRS流行最严重,粤北地区PRRSV检出率最低但呈上升趋势。为了进一步研究广东省PRRSV毒株演变规律,对PRRS疑似病料进行病毒分离,经IFA和RT-PCR鉴定,获得14株PRRSV分离株。对获得的14株PRRSV分离株进行Nsp2、ORF5基因核苷酸序列测定,将获得的Nsp2、ORF5基因序列与PRRSV参考毒株的序列比较。结果显示,PRRSV分离株与PRRSV参考毒株可分为4个亚群,14株PRRSV分离株位于其中2个亚群,除了PRRSV GD-KP株,其余13株分离株和PRRSV JAX1属于同一亚群。PRRSV GD-KP、QY2010、QYYZ和美国分离毒株NADC30属于新的亚群。对获得的14株PRRSV分离株与PRRSV参考毒株GP5蛋白中和抗原表位分析,结果表明,与亚群1的39位氨基酸亮氨酸L39(Leu)相比,亚群2、亚群3和亚群4在39位氨基酸分别突变为苯丙氨酸F39(Phe)、异亮氨酸I39(Ile)、丝氨酸S39(Ser)。亚群1、亚群2和亚群3的毒株(包括亚群4的NADC30株)在氨基酸38位为组氨酸H38(His),亚群4的GD-KP、QY2010和QYYZ(2011)毒株突变为酪氨酸Y38(Tyr)。将10株PRRSV代表毒株GP5蛋白抗原位点分析结果表明,与经典毒株(以VR-2332为代表毒株)相比较,变异毒株(以JXA1为代表毒株)在135~140位和180~185位氨基酸多了两个抗原位点,同时在190~198位少了一个抗原位点。PRRSV GD-KP株GP5蛋白既有经典毒株190~198位抗原位点又有变异毒株135~140位抗原位点,表明GD-KP毒株可能来源于经典毒株和变异毒株的重组。为了进一步了解PRRSV GD-KP株分子特征,应用生物信息学方法分析PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白的理化性质、可溶性、信号肽、跨膜区、亲(疏)水性、翻译后修饰位点、二级结构及抗原表位,并通过SWISS-MODEL程序预测GP5蛋白的叁维空间结构。结果显示,PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白通过综合β转角、亲水性、柔韧性、表面可能性区域以及B淋巴细胞抗原表位预测等原则找到一个共同区域在于30~40位氨基酸(氨基酸序列为SANGNSSSYSQ)之间,表明此区域为PRRSV GD-KP株GP5蛋白非常重要的抗原位点;糖基化位点预测分析发现GP5蛋白存在多个糖基化位点,分别位于第34~37、44~47和51~54位氨基酸;运用在线软件SignalP工具对PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白氨基酸进行信号肽预测,结果显示,其信号肽位于1~31位氨基酸之间;PRRSV GD-KP毒株GP5蛋白序列上有3个跨膜螺旋序列,分别位于15~34、66~88和103~125位氨基酸,1~14和89~102位氨基酸位于细胞膜外面,35~65和126~200位氨基酸位于细胞膜内。为了解分离获得PRRSV GD-KP株的致病特点,开展了GD-KP毒株对仔猪的致病性研究。结果显示,GD-KP株感染60日龄仔猪后,感染仔猪前4 d表现为食欲下降,精神萎靡,第5 d开始采食量和精神状态恢复正常。第11 d扑杀剖检,见肺心叶、肺尖叶中度病变,肺门淋巴结水肿、出血,脾脏轻度肿大,腹股沟淋巴结肿大、出血。组织病理检查见肺泡内存在大量坏死的巨噬细胞,淋巴小结中央坏死。以上结果表明PRRSV GD-KP株对仔猪具有一定的致病性,但不会引起仔猪死亡。在PRRS的防控中单一的疫苗难以达到有效防控的目的,为此,本研究采用4种不同的PRRSV疫苗组合,分别为第1组:14日龄同时免疫PRRS弱毒苗和灭活苗、第2组:14日龄免疫PRRS弱毒苗和35日龄免疫灭活苗、第3组:14日龄免疫PRRS弱毒苗和35日龄免疫弱毒苗,第4组:14日龄免疫弱毒苗。通过免疫后抗体滴度、病毒血症和生产参数评估PRRS疫苗对广东新流行毒株PRRSV类GD-KP毒株免疫效果。结果表明,14日龄免疫弱毒疫苗和35日龄免疫灭活疫苗组效果最好。最后,通过临床症状、生产指标和实验室检测评估猪群PRRSV的感染状态。针对不同的PRRSV感染状态制定相应的防控方案,并对其方案进行实施、评估。综上提出了“评估感染状态-制定防控方案并实施-效果评估”的猪繁殖与呼吸综合征的防控方案。
刘涛[7]2008年在《河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株ORF5基因的原核表达》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪繁殖障碍和呼吸道症状的传染病,对养猪业造成极大危害,控制这种传染病是生产上急需解决的问题,控制本病的关键之一在于生产高效的疫苗,但由于PRRSV变异很大,给高效疫苗的开发造成很大困难。本课题旨在从河北省本地猪场分离毒株,通过与已发表毒株的核苷酸和氨基酸序列进行对比,了解河北PRRSV的分子流行病学特点。并且以本地分离株为基础,克隆表达其诱导机体产生中和抗体的ORF5基因,构建成熟的原核表达系统,为今后基因工程疫苗的生产打下基础。本研究从河北省各地送检的六份疑似PRRS感染病料,经RT-PCR诊断试剂盒检测,阳性病料经处理后用Marc-145细胞增殖培养,其中沧州市送检病料接种Marc-145细胞后经过4代盲传后,开始出现细胞病变(CPE),经RT-PCR鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF5基因片段,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化大肠杆菌Top10,阳性重组质粒进行序列测定与分析。通过与国际代表毒株及国内主要毒株比较分析,发现河北PRRS HB-3(cz)株与北美洲株亲缘关系较近,而与欧洲株关系较远;HB-3(cz)株与所有其它河北毒株序列同源性很高,疏水性、抗原性基本一致;06年夏以来河北省流行毒株亲缘关系很近。设计另一对引物(P3/P4)从重组载体pGM-ORF5中扩增出缺失了N端28个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,构建ORF5基因的原核表达质粒;将重组质粒转化Rosetta-DE3,经IPTG的诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为42.0kDa的目的蛋白,经Western-blotting分析表明,该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别,具有免疫原性;并对表达条件进行了优化。这为进一步研制PRRSV新型疫苗及诊断试剂奠定了基础。
陈绍品[8]2017年在《P-Body组件蛋白DCP2、LSm1与PRRSV作用机理初探》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种高度变异及传染的单股正链RNA病毒,目前还没有得到有效的控制,给世界养猪业带来极大的损失。m RNA处理小体(processing bodies,P-Body)是细胞质内参与基因转录后调控的m RNA-蛋白质复合体,是不具有包膜的亚细胞结构。主要参与细胞的翻译抑制、RNA介导的基因沉默、m RNA降解等重要生命活动。P-body的装配能够影响病毒在细胞内的复制,同时病毒的复制又反过来影响P-body的装配。LSm1及DCP2定位于P-body中,是P-body的标志性蛋白,能够影响许多病毒的复制。为了探索PRRSV复制过程中与宿主P-body的相互作用关系,本研究运用分子生物学、基因工程、细胞生物学等实验技术,获取PRRSV核衣壳蛋白N、P-Body标志蛋白DCP2、LSm1基因序列,对其核苷酸序列与编码的氨基酸序列进行分析,构建携带N、DCP2、LSm1基因的原核表达质粒,诱导表达后纯化,免疫兔子制备高免血清。并从基因转录水平初步探索PRRSV复制过程中对宿主DCP2、LSm1的影响。1.PRRSV N基因的扩增及其编码蛋白高免血清的制备。PCR扩增出N基因编码区全长后,将其连接到p Cold I原核表达质粒上,得到重组质粒p Cold I-N。序列测定显示N基因核苷酸序列长度为372 bp。序列分析结果显示,PRRSV分离株E11105与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%,氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%,表明E11105毒株属于美洲型PRRSV,与中国高致病性PRRSV亲缘关系较近;预测N蛋白不具有信号肽,为非分泌蛋白,存在5个B细胞优势抗原表位。诱导表达重组N蛋白分子量约为16.7 k D,主要以不可溶性蛋白形式存在,但也存在可溶性蛋白。重组N蛋白纯化后免疫兔子,成功获得了针对N蛋白的高免血清。且针对可溶性N蛋白的兔源高免血清效价较高,为1:12800,而针不可溶性重组N蛋白的兔源高免血清效价仅为1:3200。试验结果为研究PRRSV N蛋白的功能特性及PRRSV致病机理奠定了基础。2.P-Body组件蛋白DCP2基因的扩增及高免血清的制备。利用PCR技术扩增出DCP2之后,将其连接到克隆质粒上进行测序,结果显示获得了DCP2基因两种转录变异体编码区全长,分别为转录变异体X1、X2,长度为1263 bp和1158 bp,DCP2转录变异体X1编码的氨基酸序列比X2编码的氨基酸序列在从第314个氨基酸至第349个氨基酸的位置多出36个氨基酸,其他地方完全一致。选取较长的转录变异体X1进行生物信息学分析,结果表明,DCP2转录变异体X1基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列在不同哺乳动物中的相似性较高,在94%以上,具有较高的保守性。预测Marc145细胞源DCP2转录变异体X1蛋白不具有跨膜结构和信号肽,是非分泌蛋白,具有良好的优势抗原表位。将DCP2转录变异体X1基因连接到p Cold I原核表达载体上,诱导表达的原核重组蛋白为不可溶性蛋白,纯化后免疫兔子,成功获得了针对DCP2转录变异体X1蛋白的兔源高免血清,效价为1:6400,试验结果为进一步研究DCP2的功能及其在病毒复制中作用的机制奠定了坚实基础。3.P-Body组件蛋白LSm1基因的扩增及原核表达质粒的构建。经过巢式PCR两轮的扩增后,成功得到了Marc145细胞源LSm1基因编码区全长,将其连接到p Cold I原核表达载体上,测序结果显示其长度为402 bp,编码133个氨基酸。其核苷酸序列与人类、灵长类相似性较高,其次是海洋哺乳动物类,最后是陆地野生动物及家畜,相似性为92.8%-99.8%,而其编码的氨基酸虽没有此规律,但氨基酸序列相似性都较高,相似性为97.8%-99.3%。预测此LSm1蛋白无跨膜区域,无信号肽区域,为非分泌蛋白,存在4个B细胞优势抗原表位。携带LSm1基因的重组原核表达质粒诱导结果显示,没有表达重组LSm1蛋白。研究结果表明LSm1蛋白在细胞内转录及表达水平可能较低,细胞c DNA须通过巢式PCR扩增两轮才能出现目的条带,LSm1重组表达蛋白不在本研究的表达系统中表达,需考虑通过更换表达系统、截短表达、融合表达等方法获得高浓度的LSm1重组原核表达蛋白。本试验为LSm1基因的扩增提供了参考,为获得LSm1人工表达蛋白与针对LSm1蛋白的特异性抗体,以及在细胞水平研究LSm1的功能机制及其在病毒复制中的作用奠定坚实基础。4.PRRSV复制对宿主LSm1、DCP2基因转录水平的影响。PRRSV接种Marc145细胞之后,分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h收集细胞提取总RNA反转录,利用q PCR方法检测PRRSV N基因、Marc145宿主细胞LSm1、DCP2基因转录水平。结果显示,随着PRRSV在Marc145细胞内的复制,宿主细胞LSm1转录水平各个时段明显增加,而DCP2转录水平0-8 h明显下降,8-48 h明显升高。这表明PRRSV的复制对宿主细胞P-Body标志性蛋白LSm1及DCP2的转录水平具有一定的影响。试验结果为后续进一步研究PRRSV复制与LSm1及DCP2的作用关系奠定了坚实基础。
朱海波[9]2011年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染引起的,该病1987年在美国首次发现,1991年在荷兰分离到病毒,我国于1996年分离到第一株病毒(CH-1a株)。目前该病流行于世界各养猪国家,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。Nsp7蛋白是PRRSV的一个重要的非结构蛋白,免疫原性高,已经证实,在感染PRRSV的猪体内含有针对Nsp7蛋白的特异性抗体,且抗体在体内的持续时间很久,另外,Nsp7在不同毒株之间具有很高的保守性,是建立PRRSV鉴别诊断方法的理想靶蛋白。但目前对Nsp7蛋白的抗原表位知之甚少,本研究主要利用单克隆抗体和合成多肽来确定Nsp7蛋白的抗原表位,从而为研制新型诊断试剂奠定基础。主要研究内容包括：1. PRRSV WUH1株Nsp7基因的克隆表达提取PRRSV WUH1株的总RNA,利用特异性引物通过RT-PCR扩增获得Nsp7基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,获得原核表质粒pET-28a-Nsp7。在IPTG诱导下6His-Nsp7融合蛋白获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为37KDa,主要以可溶性形式存在。Western blotting检测证实表达产物具有良好的免疫学活性。2.PRRSV WUH1株Nsp7蛋白单克隆抗体的制备将原核表达的PRRSV Nsp7蛋白经Ni-NTA柱纯化后作为免疫原,免疫6周龄BALB/C雌性小鼠,经细胞融合,间接ELISA方法筛选,共获得19株抗Nsp7蛋白的单克隆抗体(D1F9、D3G10、D1E9、B2B3、B3D6、B1F7、B2E11、B1F5、D1C11、C4G7、C2A8、C2D11、B2G3、C3C7、B1F8、C4B2、B4H10、B4E2、D1C10)。采用秋水仙素裂解法对筛选到的杂交瘤细胞株进行染色体计数,染色体数在90～105条之间。亚类分析显示除B1F7为IgM亚类外其余均IgG1。将19株杂交瘤细胞分别注射小鼠后,大量制备腹水。将构建的真核表达质粒PCAGGS-HA-Nsp7转染Hela细胞后,收集样品。经Western blotting和IFA验证表明除D1F9以外均能与真核表达的Nsp7蛋白发生特异性反应。3.PRRSV Nsp7蛋白抗原表位的确定结合相关生物学软件预测的Nsp7蛋白潜在的抗原表位的结果,将Nsp7蛋白截短成四个小的片段(pN71(1～116aa)、pN72 (56～163aa)、pN73 (112～213aa)和pN74(142～252aa)),分别构建这四个片段的原核表达质粒pET-28a-pN71、pET-28a-pN72、pET-28a-pN73和pET-28a-pN74。将构建好的质粒转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,四个融合蛋白均获得高效表达。通过Western Blotting和间接ELISA验证,结果发现：19株抗Nsp7蛋白单抗中13株抗体可直接或间接的与pN72发生反应。根据上述的结果,设计了一套包含整个pN72片段和其它潜在的抗原表位的16个短肽片段(SP1-SP16),每个多肽的长度约为15个aa,每相邻的短肽之间有5个aa的重复。通过间接ELISA的方法与19株抗Nsp7单抗进行反应,结果发现：D1E9,D1C10,D3G10与SP9和SP10有特异性反应,B1F5与SP10有特异性反应,其它的抗体与多肽之间均无反应。进一步将16个多肽分别与人工感染PRRSV在不同日龄采集的猪血清进行反应,发现只有SP10能被阳性血清识别,揭示了SP10也是PRRSV的一个特异性抗原表位。本研究首次鉴定了PRRSV Nsp7蛋白上的一个特异性抗原表位(SP10),为建立新型的鉴别诊断方法和开发基因工程疫苗提供了有用的信息,同时也为研究PRRSVNsp7蛋白与宿主免疫系统之间的相互作用奠定了一定的基础。
顾小雪[10]2006年在《PRRSV GP5蛋白AB表位基因表达与体液免疫特性研究》文中认为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度接触性传染病，以母猪的生殖障碍和生长猪及仔猪的严重呼吸道疾病为主要特征。是目前危害养猪业最严重的传染病之一。PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科，为有囊膜的不分节段、单股、正链RNA病毒。 该病毒有4种糖基化蛋白GP2、GP3、GP4和GP5，以及2种非糖基化蛋白M和N蛋白，其中GP5蛋白是PRRSV的主要保护性抗原，在动物体内可诱导产生中和抗体。GP5蛋白的外结构域中有一个高度保守的线性中和表位，即B表位(Aa37-45)(HLQLIYNL)和一高变异性的免疫优势非中和表位称为A表位，A表位的核心(Aa27-31)(A／VLAN)位于B表位的七个氨基酸之前。 为进一步研究GP5蛋白中和表位与非中和表位的关系，本研究根据GenBank数据库中的PRRSV S1毒株GP5的基因序列，设计合成了一对含有BamHI、EcoRI酶切位点的引物，PCR扩增其A、B抗原表位141bp双链DNA序列，分别克隆于原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pcDNA3中，经酶切鉴定及DNA序列测定，插入片段具有正确的阅读框。原核重组质粒pGEX-GP5AB转化大肠杆菌(E. coli)BL21感受态细胞，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)18℃诱导表达融合蛋白GST-GP5AB。SDS-PAGE电泳显示相对分子质量为30KD。用GSTrap FF亲和层析柱获得的纯化的蛋白，经Western blotting检测证明该重组蛋白具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白GST-GP5AB和真核表达质粒pcDNA3-GP5AB分5次免疫BALB／c小鼠，每次间隔3周，最后一次免疫后用ELISA、病毒中和试验和Westem blot检测抗PRRSV抗体。结果表明，重组GST-GP5AB蛋白可诱导产生PRRSV特异性ELISA抗体，获得的血清效价大约为1：880，经GST蛋白孵育后效价为1：400。Western-blot结果显示该融合蛋白与经过空载体pGEX-6p-1表达的GST蛋白孵育的抗血清反应后有明显的特异性条带。但是此抗体没有中和活性。同时，pcDNA3-GP5AB不能诱导免疫鼠产生PRRSV特异性抗体。 利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原，通过反应条件优化，建立间接ELISA
参考文献：
[1]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 周艳君. 东北农业大学. 2005
[2]. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原区域的鉴定[D]. 李琳. 黑龙江八一农垦大学. 2014
[3]. 基于猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白及抗原表位的间接ELISA检测方法的建立[D]. 冷章明. 华中农业大学. 2013
[4]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白单克隆抗体制备与抗原表位筛选[D]. 袁庆. 东北农业大学. 2015
[5]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白抗原表位的分析[D]. 王玉娥. 中国农业大学. 2003
[6]. 广东省猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及防控措施[D]. 蔡汝健. 华南农业大学. 2018
[7]. 河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株ORF5基因的原核表达[D]. 刘涛. 河北农业大学. 2008
[8]. P-Body组件蛋白DCP2、LSm1与PRRSV作用机理初探[D]. 陈绍品. 贵州大学. 2017
[9]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定[D]. 朱海波. 华中农业大学. 2011
[10]. PRRSV GP5蛋白AB表位基因表达与体液免疫特性研究[D]. 顾小雪. 南京农业大学. 2006
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