邵阳学院附属第一医院检验科 湖南邵阳 422001
摘要：目的 探讨酶联免疫反应加速仪与立式洗板机在酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测丙型肝炎抗体中的应用。方法 选取我院2017年4月-2017年5月丙型肝炎患者血清38例，分别用四种组合（温箱孵育加手工洗板、温箱孵育加立式洗板机洗板、酶联免疫反应加速仪加手工洗板、酶联免疫反应加速仪加立式洗板机洗板）方法检测其丙型肝炎抗体。其中，对照组采用温箱孵育加手工洗板的传统方法进行检测，观察组则分别采用其他三种方法进行检测，最后计算出S/CO值，并对结果进行比较分析。结果 酶免反应加速仪加立式洗板机洗板和温箱孵育加手工洗板检测的结果，差异有统计学意义（P<0.05），而温箱孵育加立式洗板机洗板、酶免反应加速仪加手工洗板和温箱孵育加手工洗板检测的结果，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 在HCV-Ab检测过程中，可使用温箱孵育加手工洗板、温箱孵育加立式洗板机洗板、酶免反应加速仪孵育加手工洗板三种组合方法，不推荐酶联免疫反应加速仪与立式洗板机同时使用。
关键词：酶联免疫反应加速仪；立式洗板机；手工洗板法；酶联免疫吸附试验；丙型肝炎病毒抗体
丙型肝炎病毒（HCV）是一种经肠道外途径传播的肝炎病毒，现已成为输血后肝炎的主要病原，丙型肝炎病毒感染细胞后，除免疫杀伤作用引起肝脏炎症外病毒本身的基因产物对肝细胞也有直接致病变作用，丙型肝炎感染后约80%的新发HCV感染者转为慢性感染，其中10%~20%将进展为肝硬化，长期持续的慢性HCV感染患者中1%~5%进展为肝癌。因此HCV感染的准确诊断对于临床治疗以及患者心理影响等尤为重要[1]。早期诊断HCV感染，控制HCV的传播、评估抗病毒疗效主要依靠及时、准确的实验室检测方法[2]。HCV感染的临床检测指标主要有抗-HCV和HCV-RNA，此外还有HCV核心抗原，但目前尚未在临床实验室推广应用。由于HCV-RNA采用RT-PCR方法检测，对实验室有特定要求，因而临床实验室检测HCV感染的最常用的标志物是抗-HCV [3]。目前，临床实验室检测抗-HCV最常用的筛查方法是酶联免疫吸附法（ELISA）或化学发光法（CLIA）[1]。随着酶联免疫反应加速仪与立式洗板机相继被研制并陆续应用于临床，大大提高了酶联免疫吸附法检测抗原抗体的工作效率。单纯将酶联免疫反应加速仪或者立式洗板机应用于临床抗原抗体检测的研究比较多，但联合应用的研究暂时未见有报道，本文旨在探讨使用第四代丙型肝炎病毒抗体检测试剂，运用酶联免疫反应加速仪孵育加手工洗板、酶联免疫反应加速仪孵育加立式洗板机洗板、温箱孵育加立式洗板机洗板、温箱孵育加手工洗板等四种方法进行抗-HCV检测，比较检测结果之间差异是否具有统计学意义。
1 资料与方法
1.1一般资料
1.1.1 样本收集
收集我院2017年4月-2017年5月丙型肝炎抗体阳性患者血清标本共38例，分别置于-20℃条件下集中保存[4]。
1.1.2 仪器试剂
ELISA 酶免试剂由珠海丽珠试剂股份有限公司提供，为第四代酶免试剂、酶标仪（RT-6100）由深圳雷杜生命科学股份有限公司制造、37℃恒温水浴箱为上海跃进医疗仪器厂制造、NY/MMJ酶联免疫反应加速仪为上海复星长征医学科学有限公司研制、SK962 型全自动立式洗板机为深圳市盛信康科技有限公司研制。
1.2 方法与原理
1.2.1 检测方法与原理
使用珠海丽珠试剂股份有限公司生产的丙肝抗体检测试剂盒，根据酶联免疫分析双抗原夹心法原理，具体操作方法试剂盒使用说明书进行。使用常规温育法37℃恒温水浴箱第一步加生物素和样本孵育60分钟、第二步洗板后加酶标记物孵育30分钟、第三步洗板后加显色液显色30分钟；使用酶联免疫反应加速仪第一步加生物素和样本孵育30分钟、第二步洗板后加酶标记物孵育15分钟、第三步洗板后加显色液显色30分钟。分别读取各组的吸光度值，计算S/CO值。
1.2.2 NY/MMJ型酶联免疫反应加速仪工作原理
该仪器主要由主机、酶免反应室、高频发生器、加热、振动、自动控制等部件组成，它利用免疫反应中抗原抗体结合部分形状互补、凹腔内氨基酸侧键位置要有利于产生各种次级键，同时有序施加的高频电磁波能促使离子迁移和耦极子转动引起免疫分子振转的原理，从而使酶联免疫反应时间由原来的几十分钟甚至数小时在10min内完成，该仪器广泛应用于缩短酶联免疫反应[5]。
1.2.3 SK962 型全自动立式洗板机工作原理
全自动立式洗板法只有注液针，没有吸液针，利用单针反冲和回转离心的工作原理完成微孔的清洗与残留液体的清除工作[6]。
1.2.4 统计学分析
处理数据采用的是用SPSS19.0 统计学软件，计数资料选择t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
38例丙型肝炎抗体阳性标本分别用四种组合（温箱孵育加手工洗板、温箱孵育加立式洗板机洗板、酶免反应加速仪孵育加手工洗板、酶免反应加速仪孵育加立式洗板机洗板）方法进行检测，检测后分别读取各组的吸光度值，并计算S/CO值，四种组合检测的S/CO值分别采用t检验比较：酶联免疫反应加速仪加手工洗板与温箱孵育加手工洗板两者之间无显著性差异（P>0.05）；温箱孵育加立式洗板机洗板与温箱孵育加手工洗板两者之间无显著性差异（P>0.05）；酶联免疫加速仪孵育加立式洗板机洗板与温箱孵育加手工洗板两者之间有显著性差异（P<0.05）见表1。
3 讨论
从本文的实验结果可以看出，单纯使用酶联免疫反应加速仪温育可比使用常规温育方式大幅缩短丙肝抗体的检测时间（由以前的90分钟缩短为45分钟），且检测结果无显著性差异（P>0.05）。
近几年来出现的立式洗板机采用多孔单向注水反冲与离心脱水技术，具有洗板更加快速、洗液零残留以及免拍板等优点[7]，单纯使用立式洗板机洗板在大幅缩短洗板时间、降低生物安全风险、减少交叉污染等方面比传统手工洗板优势更明显，且检测结果无显著性差异（P>0.05）。
当酶联免疫反应加速仪与立式洗板机洗板组合使用时，其S/CO值要明显低于温箱孵育加手工洗板组合，检测结果有显著性差异（P<0.05）。
珠海丽珠试剂股份有限公司生产的丙肝抗体检测试剂盒，根据酶联免疫分析双抗原夹心法原理，以重组丙型肝炎病毒抗原（重组抗原），包含Core，NS3等的嵌合蛋白包被微孔板，加入生物素化的丙型肝炎病毒抗原（生物素抗原），包含Core，NS3等的嵌合蛋白和待测样本后，如果样本中存在丙型肝炎病毒抗体（抗体），则会与包被抗原和生物素抗原进行特异性反应，形成“包被抗原-抗体-生物素抗原”结构的免疫复合物，并结合在固相载体上。通过洗涤去除未结合的生物素抗原和抗体，再加入那根过氧化物酶标记的亲和素（酶标记物），则酶标记物会与上述复合物中的生物素抗原进行结合，形成“包被抗原-抗体-生物素抗原-酶标记物”结构的免疫复合物。通过洗涤去除未结合的酶标记物，再加入底物缓冲液和底物液，底物在酶的催化下生成蓝色产物。用终止液终止酶反应后，微孔中的蓝色溶液变成黄色，颜色深浅与样本中丙型肝炎病毒抗体的浓度在一定范围内成正比。
亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定（呈不可逆反应性）[8]，酶联免疫反应加速仪与立式洗板机洗板组合使用应该不会对其产生影响；但根据抗原抗体反应具有可逆性的特点，在一定条件下抗原抗体复合物可解离为游离的抗原和抗体，两者联合使用可能对其产生影响。
抗原抗体特异性结合后由四种分子间引力参与并促进其结合，分别为：静电引力、范登华引力、氢键结合力和疏水作用力，其中疏水作用力对维系抗原抗体的结合作用最大，静电引力和氢键结合力次之、范登华引力最小[9]。使用酶联免疫反应加速仪进行抗原抗体反应时，虽然增强了分子间的运动速度，但由于反应时间减少一半，从而导致四种分子间引力参与不完全，在较强外力（立式洗板机洗板）作用下，使部分抗原抗体复合物解离，引起抗原抗体复合物浓度下降，从而导致酶联免疫反应加速仪与立式洗板机洗板组合的S/CO值降低，而手工洗板外力作用很小，不会引起抗原抗体复合物的解离，对抗原抗体复合物浓度无影响，酶联免疫反应加速仪加手工洗板组合不会影响其S/CO值。使用常规的温箱孵育进行反应时，抗原与检测抗体充分结合，四种分子间引力能完全参与到反应中，使抗原抗体复合物结合牢固，即使有较强外力（立式洗板机洗板）的作用下，也不会引起复合物的解离，对抗原抗体复合物浓度无影响，温箱孵育加手工洗板、温箱孵育加立式洗板机洗板组合不会影响其S/CO值。
综上所述，单纯使用酶联免疫反应加速仪温育可比使用常规温育方式大幅缩短丙肝抗体的检测时间，单纯使用立式洗板机洗板在大幅缩短洗板时间、降低生物安全风险、减少交叉污染等方面比传统手工洗板优势更明显，但两者联合使用时，可引起抗原抗体复合物浓度下，导致降吸光度降低，对于弱阳性的标本可能出现假阴性，从而延误丙型肝炎患者的诊治。故在HCV-Ab检测过程中，从工作效率角度出发，温箱孵育加立式洗板机洗板、酶联免疫反应加速仪孵育加手工洗板两种组合方法对临床正确、快速诊断有积极意义，值得推广，但不推荐酶联免疫反应加速仪与立式洗板机同时使用。
参考文献：
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[8]王兰兰，李双庆，刘辉等. 临床免疫学和免疫检验[M]．人民卫生出版社，2005：98-99．
[9]王兰兰，李双庆，刘辉等. 临床免疫学和免疫检验[M]．人民卫生出版社，2005：14-15．
论文作者:曹新策,肖乐东
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第16期
论文发表时间:2017/11/24
标签：抗原论文; 抗体论文; 免疫论文; 板机论文; 手工论文; 复合物论文; 组合论文; 《中国误诊学杂志》2017年第16期论文;