左正宏, 吴春旭, 桂慕燕, 陈元霖, 洪满贤[1]2006年在《家蚕精子介导报告基因gfp和egfp转移技术的研究》文中指出探讨家蚕精子介导基因转移技术能否有效地将外源基因导入并整合到家蚕基因组中,使之稳定遗传.分别进行了含gfp报告基因的pG350载体和含egfp报告基因的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体的精子介导基因转移实验.结果表明,导入线性pG350载体,在14个G0代实验蛾区的DNA样品中,有5个PCR检测为阳性,阳性率为35.7%;对G1代的PCR与Southern blot检测的结果证明,导入的gfp基因存在于G1代的家蚕基因组中.导入不同浓度或构型的pMD-Fib-IE-EGFP与pEGFP-N3载体时,对G0代的PCR检测结果表明,导入线性pMD-Fib-IE-EGFP组的PCR阳性率为61.2%,而导入环状质粒组的PCR阳性率为57.1%;导入环状pEGFP-N3组的PCR阳性率为46.2%;对部分PCR阳性蛾区进行Southern blot检测结果表明,导入的egfp基因整合在G0代家蚕基因组中.本研究的结果表明,家蚕精子介导基因转移能够将外源基因有效地导入、整合于家蚕基因组,并可遗传至G1代.
吴春旭[2]2002年在《家蚕精子介导基因转移技术的研究》文中研究表明本文探讨了家蚕精子介导基因转移技术(交配囊注射法)能否有效地将外源基因导入并整合于家蚕基因组中使之稳定遗传，以及转移的外源DNA浓度、线性化与否等对外源基因转移效率的影响。在同源重组绿色荧光蛋白表达载体pG350的基础上，以pMD18-T为质粒载体，用egfp基因替换gfp基因，构建了家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子BmNPV-IE控制下的增强型绿色荧光蛋白表达载体pMD-Fib-IE-EGFP。采用本实验室建立的蚕蛾交配囊直接注射法(将外源DNA直接注入处女蛾交配囊中再与同种雄蛾交配产卵)，历时3年，先后进行了2次家蚕精子介导基因转移实验。2000年用线性化的pG350进行家蚕精子介导基因转移实验，在14个G0代实验蛾区的DNA样品中有5个DNA样品PCR检测为阳性，阳性率35． 7％，对G1代的PCR与杂交检测证明导入的GFP基因存在于G1代的家蚕基因组中；2002年实验用了pMD-Fib-IE-EGFP和pEGFP-N3两个质粒进行基因转移实验，pMD-Fib-IE-EGFP以线状和环状两种构象分别用了2． 0、 1． 4、0． 7mg/mL 叁个浓度共6组进行外源基因转移实验，pEGFP-N3以1． 2mg/mL环状的条件进行外源基因转移实验。对得到的G0代97个蛾区DNA样品进行了PCR和杂交检测。在注射pMD-Fib-IE-EGFP的6组(X20、 X14、 X07、 H20、 H14、 H07) 中PCR阳性率分别为55． 0％(11／20) 、78． 6％(11／14) 、53． 3％(8／15) 、50． 0％(8／16) 、58． 3％(7／12) 和71． 4％(5／7) ，注射pEGFP-N3的一组PCR阳性率46． 2％(6／13) ，对PCR阳性的DNA样品进一步做杂交检测的结果表明导入的EGFP基因整合在G0代家蚕基因组中。 紫外灯荧光检测，2次实验都未看到实验组与对照组家蚕间有显着 差异，而2002年实验取家蚕4龄幼虫生殖细胞观察，有部分实验家蚤的 生殖细胞在紫外光下发绿色荧光。 本研究的结果证明了精于介导基因转移方法（交配囊注射法）能将 外源基因有效地导入并整合于家蚕基因组，导入的外源基因可能是以串 联多拷贝的形式整合于家蚕基因组中，整合的外源基囚叶＠传午G；代。
张业顺, 夏定国, 张国政, 唐顺明, 沈兴家[3]2007年在《家蚕精子介导转基因技术体系的优化》文中研究表明为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。
刘丹梅[4]2013年在《柞蚕新型转基因载体构建和精子介导转化研究》文中研究指明柞蚕是我国特有的一种野外饲养的经济昆虫。相比于家蚕,柞蚕由于其种群和生长环境的特殊性使其在抗病害能力、耐气候变化能力等方面具有显着的优势,是不可替代的重要生物资源。因此,开展柞蚕转基因研究,对于了解柞蚕重要基因功能,通过转基因柞蚕育种技术改善柞蚕丝品质,提升柞蚕市场竞争,以及利用柞蚕作为生物反应器,开发柞蚕资源的新用途等都具有十分重要的意义。本文在前期研究的基础上,对柞蚕转基因载体进行了改造,优化了启动子、转座子和报告基因等重要的转基因元件,构建了新型的柞蚕双元转基因载体；利用荧光标记技术对精子介导途径进行了观察；克隆了人工拼接的蜘蛛拖牵丝基因片段,利用精子介导途径对柞蚕进行转基因研究,获得了报告基因整合和表达的初步证据。主要研究内容和结论如下：(1)通过染色体步移的方法扩增得到了全长为1927bp的柞蚕肌动蛋白A1启动子,其与家蚕肌动蛋白启动子核心区域同源率为92%,具有典型的真核生物启动子特征。通过对启动子功能区域的删除研究,确定了启动子的表达调控区域。发现A1启动子的F4片段具有较强的正向调控功能,可在转基因研究中作为强启动子调控柞蚕基因的表达,在TATA box上游可能存在抑制元件,对基因表达起到负向调节的作用。(2)利用Tail-PCR方法加长柞蚕丝素基因5’和3’端序列,并与GFP标记基因融合,构建了新的丝素基因同源表达框Fib-GFP。将上述表达框与A1驱动的红色荧光蛋白基因一同插入到piggyBac转座子两个重复序列之间,得到柞蚕基因转移载体pBac[Al-DsRed+Fib-GFP];利用柞蚕肌动蛋白A1启动子改造辅助转移载体,得到辅助载体pBacAlHelper。将Al-piggyBac表达框插入到包含反向重复序列的转移载体上,构建柞蚕双元基因转移载体pBac[Al-DsRed+Fib-GFP]-Al-piggyBac。通过对Sf9细胞进行转染实验,证明两种转移系统都能够正常工作,而且整合效率比较表明双元表达载体比转移载体与辅助质粒的双质粒载体系统具有更高的整合效率,具有在柞蚕个体转基因研究中应用的潜力。(3)利用FITC示踪技术研究了柞蚕精子与DNA吸附及转移途径,并建立柞蚕的精子介导转基因体系。将柞蚕精液与FITC标记的外源DNA混合后,荧光显微镜下检测到精子头部有荧光现象,表明柞蚕精子具有摄取外源DNA的能力。将FITC标记的外源DNA导入柞蚕雌蛾体内,在荧光显微镜下观察外源DNA进入雌性生殖系统的运动过程,证实了昆虫通过精子介导实现转基因的途径。利用精子介导将携带GFP基因的载体导入蚕卵,在蚕卵中观察到瞬时表达的绿色荧光,通过RT-PCR和Western blot检测结果证明绿色荧光蛋白基因可经精子介导实现转移和表达。(4)利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的蜘蛛拖牵丝蛋白基因(ASP)。将得到的拖牵丝蛋白基因(ASP)分别构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,成功实现了ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中的表达。(5)将蜘蛛拖牵丝蛋白基因(ASP)克隆至柞蚕双元基因转移载体上,利用精子介导法进行柞蚕转基因实验,经过分子鉴定,证明蛛丝与GFP融合基因在柞蚕丝腺中得到表达。
周文林[5]2007年在《家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF转基因载体的构建及应用研究》文中提出家蚕(Bombyx mori),又名桑蚕,属鳞翅目家蚕蛾科,是迄今为止数百万种昆虫中仅有的被驯化并大规模人工饲养的经济昆虫。其幼虫具有一对发达的绢丝腺,能够大量合成分泌丝蛋白。近几年,以转基因家蚕表达外源蛋白的技术体系正被逐步建立。但现有的技术体系存在外源基因表达量不高,筛选工作量大等问题。本研究以丝蛋白基因启动子构建新的基于piggyBac转座子的家蚕转基因载体。克隆丝素蛋白重链基因(fibroin heavy chain,fib-H)、轻链基因(fibroin light chain,fib-L)启动子,并以生物信息学手段分析启动子元件;构建fib-H、fib-L启动子控制红色荧光蛋白(Discosoma red fluorescent protein,DsRed/drFP583)报告基因的瞬时表达载体,进行家蚕体内及BmN培养细胞中的瞬时表达试验;构建分别以fib-H、fib-L启动子控制外源基因的转基因载体;以piggyBac转座子介导进行家蚕培养细胞的转基因研究;以构建完成的转基因载体初步进行家蚕转基因研究。研究结果获得了fib-H启动子(EF540776,489 bp)、fib-L启动子(EF540777,606 bp),fib-L来源的polyA加尾信号序列(EF216676,289 bp),fib-L第一内含子来源的增强子序列(enhancer)(DQ679478,375 bp),新霉素抗性基因(neomycin resistance gene,neo~r)等元件;瞬时表达证明克隆的启动子在家蚕后部丝腺组织具有特异性活性,同时发现其在家蚕卵巢来源的BmN培养细胞中亦具有一定的活性;以克隆的元件构建二种新的转基因载体,除了已有的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因外,载体中包括分别以fib-n、fib-L启动子控制外源功能基因hGM-CSF(humangranulocyte-macrophage colony stimulating factor,粒/巨噬细胞集落刺激因子)并带有polyA加尾信号的表达元件、促进转录活性的增强子元件、可与GFP进行双重筛选的neo~r基因表达元件;以带有neo~r基因表达元件和GFP报告基因的piggyBac转座子载体转化家蚕BmN细胞,以终浓度800μg/mL的G418(Geneticin)筛选3个月,获得稳定转化细胞,呈现绿色荧光细胞数约75%,PCR鉴定证实细胞基因组DNA中外源基因的存在;构建的转基因载体初步进行家蚕转基因试验,幼虫2龄3 d观察到3条蚕体表具有绿色荧光斑点,蛹期观察到3个表现明显绿色荧光的个体。本研究构建的转基因载体可促进转基因家蚕生物反应器生产外源蛋白的深入研究。
王宇[6]2006年在《家蚕（Bombyx mori）piggyBac转座子转基因载体的构建及转基因方法的研究》文中认为家蚕(Bombyx mori)是一类重要的经济昆虫,目前作为生物反应器表达了多种外源蛋白,特别是其丝腺能够产生大量的丝蛋白,而成为研究的热点。但还存在许多不足,如外源基因的有效导入、整合、表达及转基因个体遗传稳定性等问题,仍需进一步深入研究。首先,本研究构建了基于转座子piggyBac的表达载体和辅助质粒。将家蚕细胞质肌动蛋白基因BmA3(cytoplasmic actinBmA3)启动子(不含信号肽序列)与转座子piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒(pARTR1.2);将BmA3启动子(含信号肽序列和部分编码区)与绿色荧光蛋白基因(gfp)融合,插入到人工合成的转座子piggyBac两反向末端序列间,进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体(pZAGFP),在此载体中设计了一个多克隆位点区,便于外源基因的插入。其次,从家蚕(Bombyx mori)品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA,用RT-PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋白轻链cDNA,序列分析表明,该片段全长为798个碱基。比较4种不同品种来源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列,同源性在98.0%-99.4%之间,推测的氨基酸同源性在98.0%-99.6%之间,四个品种间发生的变异比较一致地集中在不同位置的8个碱基上。提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA,利用PCR扩增技术获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段和终止子片段,长度分别约为1.2 kb和0.45kb,分别与J-139 L链基因相应区域进行比对,同源性高达98.8%和99%。结果表明,启动子片段包含一些典型的调控元件和多个可能参与
郭学双[7]2010年在《含双荧光报告基因的转基因载体的应用》文中研究表明绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白自发现以来,就因易于检测、荧光稳定、无毒害、种属通用性、易于构建载体、可进行活细胞定位定时观察等特性而得到广泛应用。其应用领域涉及生命科学的各个领域,包括研究基因表达的调控元件、增强子捕获、蛋白定位、研究基因表达的时空特性和空间定位、发育分子机理、筛选药物、临床检验、转基因动物和植物的筛选标记以及对病毒颗粒定位、蛋白质相互作用等方面。因此我们构建了含双荧光报告基因的不同转基因载体分别用于不同目的的转基因实验。首先,为了探索团头鲂β-actin启动子在家蚕BmN细胞和家蚕体内的活性,将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒混合,通过脂质体介导转染BmN细胞和利用精子介导法导入家蚕受精卵,48 h后,可以观察到同时发绿色荧光和红色荧光的家蚕细胞,7天后,可观察到蚕卵具有绿色荧光和红色荧光,表明来自团头鲂的β-actin启动子在家蚕BmN细胞中具有活性,随着稳定转化细胞的传代,绿色荧光稳定存在,而红色荧光会逐渐减弱直至检测不到,暗示β-actin启动子不能在家蚕中用于驱动外源基因稳定表达。然后,为探索来源于昆虫的piggyBac(PB)转座子在鲤科鱼转基因中的适用性,在PB转座子基础上构建了两个转基因载体:pigA3GFP-CMVDsRed-IEneo与pigA3GFPAβDsRed,每个转基因载体分别与辅助质粒pigA3、pigCMV组合对草鱼肾脏细胞CIK进行共转染,都得到了同时具有绿色荧光和红色荧光的CIK细胞,说明启动子PAβ、PA3、Pcmv在CIK细胞具有启动活性。根据转化细胞可稳定传代和PCR验证结果,认证外源基因插入到细胞基因组,证明PB转座子在CIK具有转座活性。将辅助质粒pigA3分别与转基因载体pigA3GFP、pigA3GFPAβDsRed以脂质体-精子介导法共同导入金鱼卵细胞,根据绿色荧光和红色荧光的共表达筛选转基因金鱼,再经PCR、Southern杂交鉴定,表明得到了转基因金鱼,说明PB转座子在金鱼体内具有转座活性。此外,为了探索家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(dsRed)的表达载体pIZT-DsRed。用该载体转染家蚕卵巢细胞系BmN,并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的细胞系,表明表达载体pIZT-DsRed可以作为转基因载体在BmN细胞使用;进一步以野生型家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染该细胞系,荧光观察发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot实验结果证实多角体中含有GFP蛋白,显示多角体病毒可以将病毒粒子以外的其他成分包埋进多角体,表明多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋现象。
王彬彬[8]2015年在《突变对家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因结构及功能的影响研究》文中研究表明乙酰胆碱酯酶(acetylcholinestrase, AChE, EC 3.1.1.7)是一种重要的丝氨酸水解酶,其经典功能是在神经传导中,将神经递质乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)催化水解为乙酸和胆碱,终止神经冲动,维持正常的神经传导。AChE主要存在于神经元和肌肉接头处,终止神经冲动向肌肉细胞的正常传递。AChE是有机磷(OPs)和氨基甲酸酯(CBs)类杀虫剂的作用靶标。杀虫剂与AChE活性中心位点丝氨酸残基结合,占据酶的催化区域,ACh不能进入和降解。ACh长时间结合在乙酰胆碱受体(AChR)上,持续刺激肌肉细胞,引起昆虫抽搐甚至死亡。此外,AChE还与神经发育、神经细胞分化与迁移、突触的形成有关；AChE参与造血细胞的增殖与分化,参与巨核细胞的形成；AChE还与肿瘤增殖、细胞凋亡有关。AChE表达量的增加、膜锚定的增加、特定位点的突变是昆虫抗药性增加的重要原因。家蚕AChE有两种类型(AChE1和AChE2),家蚕AChE1对农药相对敏感。为了研究特定位点的突变(A286S、G312A、L537S)对家蚕AChE1结构、活性以及对农药敏感性的影响,本研究利用原核表达系统表达了突变前后的AChE1基因(wace1和mace1),经过分离和纯化制备了有活性的AChE,研究了活性及抑制动力学的变化；对突变前后的AChE1结构进行了预测,分析了影响AChE1功能的原因；将wace1及mace1转入BmN细胞,研究其在细胞中的表达特征,并进一步确定突变对AChE1活性及抑制动力学的影响；构建了家蚕通用型基因打靶载体(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk),并利用此载体对BmN细胞acel进行敲除；将mace1转入到家蚕,构建携带mace1的家蚕。主要研究结果如下：1 wace1和mace1的原核表达及功能分析为了研究突变对AChE1活性和抑制动力学的影响,本研究利用原核表达系统,对家蚕野生型AChE1 (wAChE1)和突变型AChE1 (mAChE1)进行了表达；经过复性和纯化得到有活性的AChE1,两者活性差异不显着；用10-6M的毒扁豆碱和10-3mg/mL的辛硫磷孵育后, mAChE1的剩余酶活力分别比w AChE1高4.42%和8.86%。结果表明,突变对AChE1酶的活性无明显影响,但降低了其的对毒扁豆碱和辛硫磷的敏感性。2 wAChEl和mAChE1的结构分析为了探究突变对AChE1结构的影响,本研究对突变前后AChE1的二级结构及叁维结构进行了预测和分析。结果发现,突变改变了AChE1的二级结构和叁维结构,影响了催化活性中心部位的空间构象。A286S、G312A突变后的氨基酸残基大于原先的残基,突变后氨基酸侧链伸向活性中心部位,距离仅有2.80 A和3.68 A。推测这影响大分子抑制剂与活性中心丝氨酸残基的结合,是mAChE1抑制剂敏感性降低的原因。3 wacel和mace1转基因细胞构建为了研究wace1与mace1在家蚕细胞中的表达特征及蛋白活性,本研究将vace1与mace1连接到转基因载体pIZT/V5-His,转入BmN细胞,通过筛选和鉴定得到转基因细胞。经过PCR和Western检测,acel在细胞中正常表达。测定了wace1和mace1转基因细胞中acel表达量,分别是对照的21.51倍和21.69倍。对转基因细胞AChE活力的检测显示,wace1和mace1转基因细胞AChE活力分别比对照组高10.62%和20.21%。用10-6M毒扁豆碱和10-3mg/mL辛硫磷分别与wace1和mace1转基因细胞酶液孵育后,mAChE的剩余酶活力比wAChE分别高7.47%和17.41%。结果表明,转入acel可以显着提高acel的表达量,acel特定位点的突变可以降低AChE对抑制剂的敏感性。4家蚕通用型基因打靶载体的构建及应用为了构建适合在家蚕中使用的通用型基因打靶载体,方便实现家蚕的简单基因敲除、条件基因敲除及基因敲入,打靶阳性个体的筛选。本研究以pBluescript ⅡSK+为骨架,插入了一个Actin3启动子驱动的GFP报告基因和一个IE启动子驱动的正向选择标记基因(新霉素磷酸转移酶基因,neo),并在其两侧各添加一个方向相同的FRT位点,以方便打靶成功后去除正向筛选标记基因,在GFP上游加入多克隆位点(multiple cloning site, MCS) MCSII,在MCSII和下游FRT两侧加入一个方向相同的LoxP以方便实现条件基因敲除,在两个LoxP外侧各加一个多克隆位点,加入一个attP以方便基因的敲入,加入一个Actin3启动子驱动的负选择标记基因(单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,HSV-tkl),构建家蚕通用型基因打靶载体(pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk)。为了验证基因打靶载体的可行性,本研究利用此载体对家蚕BmN细胞的ace1进行了敲除。克隆acel的两段序列到家蚕通用型基因打靶载体,分别做为上下游交换臂,转染BmN细胞后,采用G418进行筛选,经筛选后细胞可见绿色荧光,表明GFP和neo正常表达。通过PCR鉴定,外源基因与基因组发生同源重组。结果表明构建的家蚕通用型基因打靶载体可用于家蚕基因打靶。5 mace1转基因家蚕的制备本研究将pIZT-mace1与脂质体混合,用精子介导法进行转基因,产下的蚕卵正常催青饲养至化蛹,记为GO代。利用体视荧光显微镜对绿色荧光蚕蛹进行筛选,取荧光蚕蛹,正常化蛾并交配产卵,催青饲养,记为G1代,并依次类推。提取G2代蚕蛾基因组,PCR鉴定GFP和转入的mace1,结果检测到GFP和mace1,表明转基因家蚕构建成功。本研究首次研究了突变对家蚕AChE1结构和功能的影响,发现叁个关键位点的突变,改变了AChE1的结构,降低了其对抑制剂的敏感性；构建了家蚕通用型基因打靶载体,利用此载体对家蚕acel进行打靶；构建转基因载体,并将mace1转入家蚕。本研究阐明了家蚕AChE1叁个位点的突变可以降低对抑制剂的敏感性,为研究AChE突变与抗药性的关系提供新的思路；为家蚕基因敲除和转基因提供素材；也为培育家蚕抗药性新品种提供材料。
李文利[9]2003年在《柞蚕丝素基因转移载体的构建及转基因柞蚕的研究》文中提出柞蚕是完全变态的绢丝类昆虫，生长至五龄后期合成并分泌一种丝素蛋白，约占蚕丝的80％。柞蚕丝素蛋白在结构上与家蚕不同，家蚕丝素蛋白是山两条多肽链通过二硫键连接而成，而柞蚕丝素蛋白是由一条多肽链构成的。因此，我们根据柞蚕丝素蛋白这一特点，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，并采用精子介导法进行转基因的研究。目前，国内外还未见有关这方面的研究报道。 本文运用PCR、RLM-RACE等方法，克隆并分析了柞蚕丝素蛋白基因，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，利用同源重组的原理通过精子介导法对柞蚕丝素蛋白基因进行基因打靶，探讨了柞蚕转基因的可能性。主要研究内容和结果如下： 利用PCR方法从柞蚕基因组中分离出丝素基因5’端与3’端部分片段。其中5’端片段长度为1330bp，它的5’端上游由CAAT box、TATA盒、prim transcript所组成。将其与家蚕、天蚕的相应序列进行比较发现，柞蚕与天蚕的同源率要远远高于家蚕的相应序列。用RLM-RACE方法确定了柞蚕丝素基因转录起始位点的第一个碱基位于ATG上游-27碱基处。从序列中可以看出：若转录起始点第一个核苷酸标为+1，则TATA盒位于-25处；CAAT盒位于-70处，符合真核生物的启动子特征。通过对启动子区域的删除分析，确定了该启动子的核心区域在ATG上游约260bp范围内。 克隆的丝素基因3’端片段为1400bp，它包括13个多聚丙氨酸结构域和由100bp组成的3’端非编码序列(UTR)。它与另外一条已知的序列同源性非常高，其同源率为90％，在比较中还发现它缺失了一个重复序列，在获得的序列中共有5个Chi样与重组热点有关的序列。 以克隆的柞蚕丝素基因5’和3’端片段作为同源重组序列，组建成柞蚕丝素基因转移表达载体pFG-1和pFG-2，将绿色荧光蛋白基因插入到该载体的相应位点。通过对五种昆虫细胞进行转染试验表明，在其中的樗蚕细胞(Sc)、草地贪夜摘要蛾细胞(S份)、HighFive细胞系中绿色荧光蛋白得到表达，由此可以证明该载体的构建是正确的。而在果蝇细胞系(S2)、Gv一1细胞系中没有发现有绿色荧光的细胞，说明该载体具有种属特异性。 将构建的柞蚕丝素基因转移载体，采用精子介导的方法进行了转基因柞蚕研究。通过PCR检测发现有n.09%的蛾区表现为阳性，在其五龄幼虫期检测的阳性率为3.27%。将PCR检测阳性的幼虫经过进一步的Southern blot、Northern blot和Western blot检测，结果发现，在部分幼虫中绿色荧光蛋白基因(GFI，)己经整合到柞蚕染色体上并在丝腺内得到表达。
袁进[10]2005年在《睾丸内注射和体内电穿孔法建立转基因小鼠的实验研究》文中研究指明转基因动物在医学、生命科学、生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景,因此科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。近几年来,随着科学技术的发展,体内基因转移已成为用于基因治疗、生物学分析等领域非常受欢迎的一种技术,体内电穿孔技术就是其中之一。 精原干细胞是精子的前体细胞,是雄性动物中唯一可以自我增殖、更新并向下一代传递遗传信息的细胞类型。对精原干细胞的操作和修饰在建立转基因动物模型、制备乳腺生物反应器等方面有重要意义。为了探讨将外源基因注射到在体睾丸生精小管内并进行体内电穿孔以建立转基因动物的可行性,我们首先设计了低压(30～110V/cm)和高压(500～900V/cm)两组不同的体内电穿孔参数对SPF级KM雄鼠睾丸进行在体电穿孔,以观察不同的电穿孔条件对SPF级KM雄鼠睾丸损伤程度和生殖能力的影响,从而筛选出合适的体内电穿孔参数。并在此基础上,我们对插入有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒pCE-29DNA进行2种不同的处理:(1) pCE-29DNA+转染试剂(in vivo jetPI~(TM)+台盼蓝(TB);(2) pCE-29DNA+台盼蓝(TB)。然后将这两种不同
参考文献：
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[6]. 家蚕（Bombyx mori）piggyBac转座子转基因载体的构建及转基因方法的研究[D]. 王宇. 四川师范大学. 2006
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