黄长形[1]1996年在《汉滩病毒囊膜糖蛋白G_1和G_2在大肠杆菌中表达及表达产物免疫原性研究》文中进行了进一步梳理汉滩病毒是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，病毒的基因组由大、中、小三段RNA组成，大片段编码RNA聚合酶，中片段编码囊膜糖蛋白G1和G2，小片段片编码核蛋白。囊膜糖蛋白上有中和和血凝抗原位点，可诱导中和抗体和保护性细胞免疫反应；核蛋白上虽然没有中和抗原位点，但可诱导保护性细胞免疫反应。 本研究分别用三种不同大肠杆菌表达载体(PBV220、PKK223-3和PGEX-4T-4)构建了囊膜糖蛋白G1和G2的表达质粒，首先用PCR方法扩增G1和G2编码区基因，将PCR产物克隆到T-载体中，从T-载体克隆质粒中用不同的内切酶切下G1和G2编码区基因，分别克隆到三种表达载体中构建G1和G2的表达载体质粒，同时用缺失突变的方法构建两个分别含G1和G2氨基末端编码区基因的表达质粒。将表达质粒转化大肠杆菌TG1。
汪毅[2]1998年在《汉滩病毒核衣壳蛋白主要线性抗原表位的研究》文中指出汉坦病毒是一种有囊膜、分节段的单股负链RNA病毒，基因组由L、M、S三个片段构成。L片段编码病毒RNA聚合酶，M片段编码囊膜糖蛋白G1和G2，S片段编码核衣壳蛋白NP(简称核蛋白)。囊膜糖蛋白上具有中和及血凝抗原位点，可诱导中和抗体和保护性细胞免疫反应；核蛋白上虽无中和性抗原位点，但仍可诱导保护性细胞免疫。 血清学研究表明，汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原性，病人对核蛋白的抗体应答不仅出现早，且滴度高。进一步研究发现，核蛋白N端约100个氨基酸大部分具有亲水性，且能被病人、免疫动物血清及许多单克隆抗体所识别，运用缺失突变法表达的汉坦病毒核蛋白N端多肽保持了天然完整NP良好的抗原性和免疫原性，已用于肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征的血清学诊断，但该抗原表位精确的一级结构及其基因定位迄今尚未明确。噬菌体表面呈现技术的出现为大量快速地筛检基因——多肽文库提供了可能。 本研究首先采用噬菌体表面呈现技术建立了汉坦病毒代表株汉滩病毒76-118株S基因随机多肽片段的噬菌体文库，用单克隆抗体对其进行筛检，确定了汉滩病毒核蛋白的主要线性抗原表位，并在此基础上。用pGEX融合蛋白表达
高娟[3]2004年在《热休克蛋白与汉滩病毒蛋白形成复合物的研究及该复合物的诱导表达》文中进行了进一步梳理热休克蛋白(Hsps)作为一类“分子伴侣”，在生理状态下，与多种蛋白质在细胞中结合来参与蛋白质的折叠、装配及转运；在应激情况下，参与组织细胞抗损伤及自身保护，是细胞生存所必需的一类蛋白质。Hsp70是一个高度保守的蛋白，其在蛋白的转运、折叠以及抗原的加工提呈过程中均具有重要作用。研究表明，Hsp70可作为一种分子载体，增强与其结合蛋白的抗原性。汉滩病毒(HTNV)是肾综合征出血热的致病病毒汉坦病毒(HV)中的一型，其核蛋白(NP)具有很强的抗原性和免疫原性，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应的靶细胞—巨噬细胞中存在NP抗原，NP抗原系CTL识别的主要抗原之一。本实验在本室过去证实HTNV感染实验动物体内Hsp70与NP存在形态共定位和蛋白分子相互结合的基础上，进一步研究了该感染模型中病毒NP、病毒囊膜糖蛋白G2与Hsp70、Hsp27及Grp94的相互关系，并在此基础上构建以Hsp70为载体、NP为靶抗原的针对HFRS的DNA疫苗，同时在原核体系中分析Hsp70的表达条件并诱导其高效表达。 1．HTNV感染中病毒蛋白与多个热休克蛋白的相互关系。将初生乳鼠脑内接种HTNV，取8d后发病死亡鼠脑组织制备石蜡切片以及组织匀浆 第四军医大学硕士学位论文液，免疫组化检测组织中病毒蛋白与HsP70、Hsp27及G印94的表达，用双抗体夹心EUSA、免疫共沉淀及Westem Blot方法分析病毒蛋白和以上多个HsPs的关系。结果发现病毒感染后组织中NP、GZ、HsP70及Grp94表达均有明显提高，Np与Hsp70、Hsp27、G印94及GZ与Np、Hsp27同时存在蛋白分子相互结合关系，形成Hsps一病毒蛋白复合物。 2.在真核体系中诱导表达Hsp70一P复合物。通过PCR方法突变NP的编码基因S的终止码得到S2，将其与hsp70基因连接并克隆入真核表达载体peDNA3.1(+)，构建peDNA3.1(+)/52一hsp7o。脂质体介导该融合表达质粒转染COs一7细胞，免疫组化检测NP一Hsp70复合物的表达情况。结果显示转染peDNA3.1(+)/52一hsP70的细胞胞浆中出现该复合物的表达。 3.在原核体系中高效表达Hsp70。将hsP70基因克隆到高效原核表达载体p入IAL一cZX中构建质粒pMAL一cZX/hsp70。转化大肠杆菌DH5a，用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。以SDS一PAGE及研七stem Blot检测并以凝胶薄层扫描分析表达水平。结果显示HsP70以融合蛋白形式出现表达，改变诱导的温度和时间目的蛋白表达总量及可溶性部分所占比例不同，本实验中Hsp70表达量最高的条件是IPTG终浓度为0.3~o比，37℃诱导sh，而可溶性表达的条件以20℃诱导ZOh，IPTG终浓度0.3~ol几为佳。 综上所述，本实验证明HTNV感染后有HsPs一病毒蛋白复合物形成，为研究HsPs在病毒感染复制中的作用以及抗病毒感染方面提供了实验资料;同时成功构建可表达Hsp7o一核蛋白复合物的融合真核表达质粒，并原核高效表达了HsP70，为针对HFRS的DNA疫苗的研制打下基础。
参考文献：
[1]. 汉滩病毒囊膜糖蛋白G_1和G_2在大肠杆菌中表达及表达产物免疫原性研究[D]. 黄长形. 第四军医大学. 1996
[2]. 汉滩病毒核衣壳蛋白主要线性抗原表位的研究[D]. 汪毅. 第四军医大学. 1998
[3]. 热休克蛋白与汉滩病毒蛋白形成复合物的研究及该复合物的诱导表达[D]. 高娟. 第四军医大学. 2004