何立智, 谢敏, 赵会安[1]2000年在《胰腺癌微卫星不稳定性及其临床病理特点的研究》文中提出胰腺肿瘤的发生目前认为与癌基因Ｋ ｒａｓ的激活以及抑癌基因ＤＰＣ4、Ｐ16、Ｐ5 3,ＦＨＩＴ的失活有关。而微卫星不稳定性 (ＭＳＩ)可能代表了肿瘤发生的另一种机制。我们用 5条染色体上的 6个微卫星位点对 41例胰腺癌标本进行ＭＳＩ的检测和分析 ,现将
赵作伟[2]2006年在《DNA错配修复系统缺陷与胰腺癌发生的相关性研究》文中研究指明目的 胰腺癌是一高度恶性肿瘤,近几年来发病率有逐年上升趋势,严重威胁着人类的生命健康。由于胰腺癌在临床上缺乏特异表现,恶性程度高,极易出现转移,就诊时3/4病人已属晚期。因此,提高胰腺癌的早期诊断率,并根据胰腺癌的分子和基因异常变化进行胰腺癌的预后评估以及治疗方案的选择已成为改善胰腺癌预后的关键。 近年来许多学者们发现了另一重要的致癌机制,即人类DNA错配修复系统(mismatch repair system,MMR)缺陷诱导肿瘤发生。研究发现错配修复基因的改变可引起微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI),使癌基因、抑癌基因的突变积累,导致癌基因激活和抑癌基因失活,最终引起细胞恶变,肿瘤形成。 DNA错配修复基因位于癌基因和抑癌基因的上游,它们首先在遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)中分离,其由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成,正常表达可保持遗传物质的完整性和稳定性,保证DNA复制的保真性。在此后的研究中人们逐渐发现MMR基因不仅与HNPCC这样的遗传性肿瘤发生相关,还与一些散发性肿瘤也有密切的联系。hMSH2和hMLH1是目前广泛研究的DNA错配修复基因。 微卫星不稳定性(MSI)是指微卫星中重复单位数量的增减,即简单序列重复次数的增减。微卫星不稳定性是DNA错配修复基因表达异常的重要表现。已有大量的实验证实MSI存在于HNPCC、部分散发性结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等当中,并且是由于错配修复基因的异常造成的。更多的关于散发性结直肠癌和胃癌的研究进一步证实了MSI和hMLH1蛋白表达缺失、hMLH1启动子高甲基化之间有确切关系。胰腺癌属于HNPCC相关性肿瘤,其与MMR关系可能更为密切,由于胰腺癌具有不易
何立智[3]2000年在《胰腺癌微卫星不稳定性及其临床病理特点的研究》文中提出目的 研究微卫星不稳定性（MSI）在胰腺癌中发生的情况，并探讨MSI胰腺癌的临床病理特点。 方法 用PCR方法检测41例胰腺癌标本的6个位点MSI，接着分析MSI胰腺癌与临床病理特点的关系。 结果 在胰腺癌中，6个位点MSI发生率有明显差异（P=0.0312）；41例胰腺癌73％（30/41）有一个位点出现MSI，其中≥2个位点MSI占50％（15/30）。临床Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌MSI检出率100％（10/10），明显高于Ⅲ、Ⅳ期的65％（20/31 P=0.0268）；胰腺癌MSI的发生与肿瘤部分病理及年龄、性别无明显关系（P＞0.05）。 结论 MSI可能是胰腺癌发生的早期事件，在肿瘤发生发展中起重要作用。
杨月琴[4]2006年在《中国人nm23H1、KAI1基因遗传不稳定性及肿瘤临床病理特性的相关性研究》文中研究指明研究背景 恶性肿瘤起病隐匿,微小癌灶的浸润和转移难以及时探查和治疗,是患者生存率低的主要原因。为此,阐明肿瘤浸润及转移的机制,确立可靠的预后指标和治疗靶点极为重要。 研究发现,随着肿瘤进展和转移的发生,肿瘤细胞内抑癌蛋白的表达量减少,逐渐失去对肿瘤细胞生长、转移的抑制,表现为肿瘤的浸润与转移。而抑癌基因的失活是编码蛋白量减少的重要机制之一。为揭示抑癌基因失活的机理,国内外针对P53、P16等抑癌基因作了大量研究,结果表明基因的遗传不稳定性改变,即微卫星不稳定性(microsatellite instablility,MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH),可能是产生基因突变,导致抑癌基因功能失调,引起肿瘤发生的重要因素。 微卫星是由2-6个核苷酸组成,具有高度多态性的简单串联核苷酸重复序列。MSI是指由于复制错误导致微卫星的增多或减少。LOH是指一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现缺失或变异。大量研究表明,抑癌基因MSI与LOH在肿瘤的多步骤发生过程中起着重要的作用。MSI首先是在遗传性非息肉性结直肠癌(heredity non-polyposis colorectal cancer,HNPCC)中发现的,后在各种散发性肿瘤如大肠癌、胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均发现MSI。研究表明MSI的发生提高了随机突变率,更重要的是导致了肿瘤相关基因的突变,可能是引起肿瘤发
殷德涛[5]2003年在《喉鳞癌中FHIT基因纯合性缺失、甲基化、表达及其微卫星不稳定性研究》文中提出喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的1％～8.4％。近年来，世界大多数地区喉癌的发病率及死亡率均有明显增高趋势，严重威胁着人类的健康与生命。多年来，尽管人们对喉癌的病因、病理、诊断和治疗等进行了深入的研究，但其发病机制仍不十分明确。同大多数恶性肿瘤一样，喉癌的发生是一个多因素、多步骤、复杂的渐进过程，其病程的发展和演进也同样涉及多个抑癌基因的失活和(或)癌基因的激活。研究表明，在喉癌中频发3号染色体短臂丢失，提示该区域可能存在与喉癌发生密切相关的抑癌基因。 1996年，Ohta等利用外显子捕获法从上皮癌细胞系3p14.2区域克隆出一个候选的抑癌基因，该基因包含染色体脆性部位FRA3B及家族性肾细胞癌相关的t(3;8)断裂位点，并含有编码组氨酸三联体的功能区，故命名为脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，FHIT)基因。FHIT基因共有10个外显子，其中外显子5～9为编码外显子。研究表明FHIT蛋白是一典型的Ap3A(5’，5”-P1,P4-triphosphate)水解酶，能特异性水解Ap4A生成ADP和AMP。而Ap4A参与了DNA不稳定性研究的复制和细胞周期，FHIT功能丢失导致Ap4A在细胞内的堆积，最终导致细胞恶性增殖及肿瘤形成。在裸鼠体内，向缺乏内源性FHrr蛋白的癌细胞中导入野生型FHIT基因可抑制肿瘤的形成。在消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤等许多人类肿瘤中均发现高频FHIT异常转录本。大多数研究表明，FHIT基因为一抑癌基因。 然而，FHIT基因与喉癌关系的研究报道较少，多集中在FHIT基因一些微卫星位点的杂合性丢失(1055 of heterozygosity，LoH)分析，且尚无明确定论。对于喉癌中FHIT基因结构的改变研究更为鲜见，仅国内一位学者报道，且仅检测了喉癌中FHIT基因转录本的异常。关于喉癌中FHIT基因纯合性缺失、甲基化这些重要的基因结构改变和FHIT蛋白在喉癌中的表达情况以及它们与临床资料的相关性分析，迄今国内外均未见文献报道。 为了深入探讨FHIT基因与喉癌发生发展的关系，本研究选取了41例喉鳞癌及其相对应的喉正常粘膜，采用多种分子生物学技术进行研究，将为阐明喉鳞癌发生的分子机制及FHIT基因在喉鳞癌发生、发展中的作用提供理论依据。本研究分为以下两部分: 第一部分:喉鳞癌中FHIT基因纯合性缺失、甲基化、表达及其l高床意义 方法: 1.采用外显子特异PCR(exon一speeifie PCR)扩增方法，检测41例喉鳞癌及其相对应的喉正常粘膜中FHIT基因全部编码外显子的纯合性缺失。 2.应用PCR一based酶切甲基化技术，研究了上述标本中FHIT基因启动子区甲基化状态。 3.应用免疫组化SP法，检测上述标本中FHIT蛋白和PCNA(proliferating eell nuclear antigen，peNA)的表达。郑州大学2003年博十论文喉鳞癌中FHIT纂因纯合性缺失、甲基化、表达及其微仪星不稳定性研究 4.同时探讨了上述改变与喉鳞癌临床病理特征的关系。 5.统计学分析:应用SPSS 10.0版统计软件包，采用xz检验、FISher精确概率法、t检验及方差分析对所有资料进行统计学处理。以P<0.05作为差异有显著意义的检验标准。 结果: 1.喉正常粘膜组中，FH工T基因编码外显子ES~Eg均成功扩增，无一例发生纯合性缺失，而对应的喉鳞癌组，ES一Eg纯合性缺失率分别为26.8%(11/41)，14.6%(6/41)，9.8%(4/41)，29.3%(12/41)和7.3%(3/41)。两组在各外显子中的纯合性缺失均有极显著性差异(P<0.01)。 2.ES、ES纯合性缺失均与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关，ES纯合性缺失还随着肿瘤病理分级的增高而增高(P<0.05);ES、ES纯合性缺失有明显的相关性(P<0.01);E6、E7、Eg纯合性缺失与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、TNM分期、病理分级及淋巴结转移均无明显关系(P>0.05)。 3.FHIT基因编码外显子总纯合性缺失率为41.5%(17/41)。在TNM分期I一11期，总缺失率为26一%，显著低于Hl一IV期的61.1%;而在无淋巴结转移组及有淋巴结转移组，总缺失率分别为66.7%和26.9%。两组之间均具有统计学意义(P<0.05)o4.喉正常粘膜组中，无一例出现化，而在喉鳞癌组中，有24.4%(l 0/41)显著性差异(P<0.01)。FHIT基因启动子区甲基出现甲基化，两组之间有极 5.FHIT基因启动子区甲基化状态与喉鳞癌病理分级及淋巴结转移有关(P<0.01)，而与患者性别、年龄、肿瘤发生部位及TNM分期均无明显关系(P>0.05)。郑州人学2003年博士论文喉鳞癌中FHIT幕因纯合性缺失、甲基化、表达及其微卫星不稳定性研究 6.喉正常粘膜组和喉鳞癌组，FHIT蛋白阳性率分别为100.0%(41141)和46.3%(19/41)，两组之间有极显著性差异(P<0.01)。喉鳞癌中，在TNM分期I一11期和111一W期组，FHIT蛋白阳性率分别为69.6%和16.7%;而淋巴结转移阳性组FHIT蛋白阳性率为20.0%，显著低于无淋巴结转移组的61 .5%。两组之间均有显著性差异(P<0.05)。 7.喉正常粘膜组和喉鳞癌组中，PCNA标记指数分别为9.98士2.34和50.71士13.64，两组之间有极显著?
陈国安[6]1999年在《DNA错配修复缺陷在肺癌发病中的作用》文中研究表明目的：探讨肺癌组织中错配修复(MMR)基因功能缺陷、微卫星改变及其靶基因BAX、TGF β RⅡ基因移码突变的关系以及它们在肺癌发病中的作用，为临床诊断及预后判断提供参考性标志。方法：50例新鲜肺癌标本，通过PCR、RT-PCR、SSCP、PAGE-银染、免疫组化等方法对3P13-26及2P21-22六个微卫星标志的不稳定性及杂合性丢失、BAX基因、TGF β RⅡ基因移码突变、五种错配修复基因(hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH6)蛋白表达、mRNA表达、基因点突变及hMLH1启动子甲基化状态进行了系统研究。结果如下： 1．肺癌组织中有中等频率的微卫星不稳定性(MSI)和杂合性丢失(LOH)。MSI发生率为6％-34.7％，总的发生率(≥1个位点)为52％(26／50)，若≥2个位点异常则为42％(21／50)；LOH发生率为8％-14％，总的发生率(≥1个位点)为44％(22／50)，若≥2个位点异常则为8％(4／50)；MSI和／或LOH的发生率(≥1个位点)为72％(36／50)，若≥2个位点异常则为48％(24／50)。 2．微卫星改变与肺癌组织类型和分化程度有关。肺鳞癌LOH发生率(60％，15／25)明显高于肺腺癌(26.3％，5／19)；低分化肺癌MSI(77％)、MSI和／或LOH(71％)明显高于高、中分化肺癌。 3．肺癌组织中存在一定比例的MMR蛋白不表达。单种蛋白表达阴性率为19.6％-30.4％，总的不表达(≥1种蛋白)率为63％(29／46)。蛋白表达与肺癌临床
王玲玲[7]2010年在《胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源及临床病理意义的研究》文中认为胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。普通型胃腺癌伴神经内分泌分化,是指胃腺癌中出现分化的神经内分泌(NE)细胞,但其数目在癌组织成分中所占比例较小,不足50%,并且这些分化的NE细胞多以单个或者细胞巢的形式分散存在。我们以往的研究结果显示,大肠腺癌、胃腺癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中NE细胞的发现率分别为41.5%,39.6%,38.1%,21%和17.9%,并发现在大肠癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中,高分化腺癌NE细胞的发现率明显高于低分化腺癌,而胃癌则相反,低分化腺癌中NE细胞的发生现率明显高于高分化腺癌。这些差异性是否与肿瘤所在部位的胚胎起源、肿瘤病因学、组织发生学的不同及遗传学改变有关,仍处于探索研究阶段。因此,通过分子生物学的方法认识NE细胞的性质,有助于更深入的认识胃癌发生、发展的机理,并为临床诊断和治疗提供依据。目前国内外对非神经内分泌肿瘤中NE细胞的研究较少,特别是用分子遗传学方法研究普通型胃腺癌中单个NE细胞的起源方面尚未见报道。关于胃腺癌中NE分化的发生机制存在许多不同的假说,多数学者认为NE细胞和上皮细胞均来源于内胚层多潜能干细胞。在肿瘤发生及演进过程中,内胚层的多潜能干细胞受激素、局部微环境及基因组不稳定性的影响,使某些被抑制的基因组密码发生随机脱抑制,在RNA水平选择性激活两种以上调节机制,最终导致基因产生双向或多向分化。然而,这些推测仅建立在形态学观察的基础之上,缺乏可靠性。这些散在的NE细胞是否存在基因水平的改变,它们是肿瘤的实质成分,还是仅仅作为肿瘤的间质成分存在,尚无明确定论。激光捕获显微切割技术(Laser capturemicrodissection,LCM)可以使研究者可以获得形态完整的单一细胞或细胞群进行遗传学研究,解决了目的细胞的捕获难题。由于该技术在切除和提取细胞过程中不产生热量,对目的细胞没有任何损伤,即避免了邻近细胞的污染,又不会损伤DNA、RNA。目前国际上很多研究,其样本的获取都是利用了LCM技术。DNAMicro-kit试剂盒可以对微量组织或LCM捕获的细胞进行DNA抽提,联合应用Repli-g扩增试剂盒进行全基因组扩增,可以获得足量DNA用于后续的实验研究。野生型p53(wt-p53)作为抑癌基因,在正常组织中参与了细胞周期调控、细胞凋亡等过程,发生突变或缺失时,将丧失上述功能,使细胞增殖失控,凋亡受阻,从而引发肿瘤。错配修复功能的完整是细胞DNA准确复制和基因组稳定的基本保证。该功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。MLH1基因是错配修复基因家族的重要成员之一,具有修复DNA碱基错配,增强DNA复制忠实性,维持基因组稳定性降低自发性突变的功能。E-cadherin(上皮型钙粘蛋白)是一种介导同种细胞相互黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白,对细胞极性的建立,维持上皮细胞正常形态至关重要。抑癌基因PTEN在正常组织中参与了DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞间相互作用及抑制血管生成等过程。当PTEN发生突变或缺失时,将丧失上述功能,不但减少对细胞凋亡的调控,还可以促进细胞进入增殖周期,导致细胞的无限增殖。干细胞在分化过程中,染色体有丝分裂不均衡,可造成部分基因在两种分化的细胞中同时出现等位基因的改变(如增益、丢失、突变等),通过对微卫星改变(包括微卫星不稳定和杂合性丢失)及突变、CGH等的检测可推测组织细胞的克隆性来源。我们在全基因组范围内选取多个微卫星位点,联合p53突变检测,对普通型胃腺癌NE细胞进行分子水平上的研究,以期明确NE细胞的克隆性起源。我们制备了组织芯片,联合应用免疫组化方法检测CGA、p53、MLH1、E-cadherin、PTEN等5个指标在胃癌中的表达情况,结合随访资料,综合分析上述指标的表达与伴有NE分化胃癌的临床病理参数及预后的关系,为胃癌的诊断及预后评估提供理论指导。材料和方法本实验收集浙江省人民医院2001-2003年间胃腺癌及正常胃粘膜新鲜标本120例。首先用冰冻切片-嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A,CgA)免疫组化方法对上述标本进行初筛,确定含NE细胞较多的组织,经红外线激光捕获显微切割获取500个左右单个NE细胞,应用DNA Micro-kit抽提试剂盒及Repli-g全基因组扩增试剂盒进行DNA抽提和全基因组放大,全基因组范围内选取26个微卫星位点,结合PCR-SSCP-银染色检测NE细胞和腺癌细胞微卫星改变情况,联合PCR-测序检测基因p53突变发生情况,推测胃腺癌中NE细胞的克隆性起源。收集浙江大学医学院附属第一医院和绍兴市人民医院手术切除胃癌标本共220例,另取31例同期非肿瘤胃黏膜组织作为对照。制备组织芯片,联合应用免疫组化检测CGA、p53、MLH1、E-cadherin、PTEN等5个指标在胃癌中的表达情况,结合随访资料,综合分析上述指标的表达与伴有NE分化胃癌的临床病理参数及预后的关系。结果1、免疫组化-激光捕获显微切割:120例胃腺癌新鲜组织中,含有中-大量NE细胞的占25.0%(30/120),在20倍物镜下捕获腺癌中单个NE细胞500个左右。2、微卫星分析结果:30例样本中MSI总发生率为27.4%,LOH总发生率为17.9%,各样本MSI发生率高于LOH。从不同细胞微卫星改变发生率比较,NE细胞与腺癌细胞发生率无明显差异。各样本MSI及LOH发生率与胃癌的临床病理参数之间无明显相关性。从两种细胞LOH及MSI一致性来看,例2、3、5、6、11、12、18、24、27、30在NE细胞和腺癌细胞中发生了完全一致的微卫星改变,其余样本除例7和10外,其他18例微卫星改变的差异无统计学意义。3、p53突变结果:30例样本中NE细胞和腺癌细胞p53突变主要集中在外显子7和8,从p53突变的一致性上看,样本4、14、21、27的NE细胞和腺癌细胞均发生了外显子7、8的一致性突变,例7的两种细胞突变不一致,例17仅腺癌细胞发生了突变。腺癌细胞p53突变有6例(20.0%),NE细胞p53突变有5例(16.7%)。临床病理资料显示多为浸润性低分化腺癌,TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期。统计学分析显示p53突变与胃腺癌分化程度、TNM分期、血管浸润和淋巴结转移相关(P＜0.05)。4、结合微卫星改变及基因突变结果,30例伴NE分化的普通型胃腺癌中,27例NE细胞与腺癌细胞起源于同一干细胞,NE细胞作为肿瘤成分,本身具恶性且分泌激素促进肿瘤生长。其余3例微卫星改变及基因突变不一致,可能是激素或微环境作用的结果,有待于进一步研究。5、胃癌中CGA蛋白表达率为47.7%,其表达与胃癌分化程度相关,低、未分化组的阳性率较高。在p53阳性组中NE分化占46.5%,且NE分化与胃癌浸润深度呈正相关,与患者的生存时间呈负相关,CGA阳性表达患者的预后较差。6、p53蛋白在胃癌中的表达率为45.0%,明显高于正常对照组,其表达与胃癌TNM分期、浸润深度呈正相关。在NE分化胃癌中,p53蛋白表达与浸润深度和远处转移呈正相关。生存分析显示,阳性表达患者预后差。7、在胃癌中E-cadherin蛋白阳性率为为15.5%,低于正常胃粘膜表达率,其阳性表达与TNM分期及脉管侵犯呈负相关,阳性表达患者的生存率显著高于阴性者。8、MLH1蛋白在胃癌中的阳性表达率为15.9%,较正常对照组低。MLH1蛋白在NE细胞阳性组胃癌中的表达与TNM分期呈负相关,生存分析显示,阳性表达患者有较好的预后。9、PTEN蛋白在胃癌中的阳性率为27.3%,阳性表达与胃癌各临床病理参数及预后之间均无相关性。结论1、在分子水平证实胃腺癌中NE细胞与腺癌细胞起源存在一致性。2、NE分化与p53蛋白表达能促进胃癌的浸润和转移,提示预后不良。3、MLH1、E-cadherin有抑制胃癌进展的作用,可为预后评估提供理论指导。
翟瑜[8]2003年在《食管癌癌组织微卫星DNA序列不稳定性的研究》文中研究说明目的：食管癌是危害人类生命健康的主要疾病之一，是我国常见的恶性肿瘤。其发病以华北地区为高，据1980年统计，其死亡率为9.7/10万，占恶性肿瘤死亡率的第四位(9)。多年来，世界各国医务工作者对食管癌的诊治进行了不懈地研究和探索，但因其早期临床症状不明显，待就诊时，常已发展至中、晚期，造成手术及放疗、化疗后效果不理想。随着分子生物学技术的发展和完善，对肿瘤的研究已进入基因水平。学者发现，在参与肿瘤发生、发展的有关基因中，除癌基因和抑癌基因外，还存在另一种癌相关基因，即错配修复基因(Mismatch Repair Gene, MMR)。MMR突变子表型最常见的是微卫星DNA序列不稳定性(Microsatellite Instability, MSI)。微卫星和MSI是近年有关肿瘤研究中的一个热点，它是继癌基因和抑癌基因之后，肿瘤发病分子机制的又一重大进展。微卫星DNA是指一类不编码的、数量可变的、广泛存在于原核和真核基因组中的核苷酸重复序列，以二核苷酸重复序列为常见。它多位于基因的非编码区以及染色体的近端粒区，遵循孟德尔遗传规律。MSI是指由于DNA复制错误(Replication errors)引起的简单重复序列的改变，表现为肿瘤组织与其相应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变。MSI最早在1993年发现<WP=4>于遗传性非息肉性结肠癌(Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer, HNPCC)，后又陆续在胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、小细胞肺癌等肿瘤中发现。迄今为止，几乎每一类型的肿瘤都已被证明有MSI的存在。产生MSI的主要原因是MMR功能缺陷，不能正常发挥错配修复作用，引起复制差错，导致基因组不稳定，进而引起癌变。有关MSI在食管癌中的表现，因国内外的研究刚刚开始，结果不尽一致。本实验试图对食管癌和MSI的相关性做进一步研究，力求找到一种筛查食管癌高发区易感个体新的分子方法，对高风险个体进行早期诊断，以利于设计有针对性的治疗方案。材料与方法：所采用标本均为2001年8月至2003年1月在河北医科大学第四医院胸外科行食管癌手术切除的病例。本组共30例食管癌患者，男17例，女13例。年龄42～72岁，平均年龄57.2岁。病理类型：鳞状细胞癌23例，腺癌2例，小细胞癌5例；其中高分化～中分化癌20例，低分化癌5例，未分化癌5例；PTNM分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期16例，Ⅲ期13例；病理证实有区域淋巴结转移者14例，未证实有区域淋巴结转移者16例。所有病人均无肿瘤家族史，亦未接受过放疗及化疗。所有病例均记录居住地、生活习惯等一般情况。每一病例割取肿瘤中心部位的癌组织及同一标本远离癌组织5cm以上的食管正常粘膜，用蛋白酶K消化、酚氯仿异戊醇提取正常组织和癌组织基因组DNA。选取位于3p21.1～3p14.3的D3S1067和位于18q22.3～18q23<WP=5>的D18S58两个微卫星位点，按下列条件进行PCR扩增：D3S1067：(1)预变性94℃，3min；(2)变性: 94℃，30s；退火: 59℃，30s；延伸: 72℃，30s。40个循环；(3)72℃延伸5 min。D18S58：(1)预变性94℃，5min；(2)变性: 94℃，45s；退火: 59℃，30s；延伸: 72℃，45s。35个循环；(3) 72℃延伸10min。PCR产物经7%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，EB染色，在凝胶呈像系统上观察摄影。将肿瘤组织与相应的正常组织比较，若肿瘤的某一等位基因出现条带的增多或位置的改变，则评价为微卫星不稳定(MSI)；若等位基因为纯合子，记为无信息(UI)。结果：1. 不同位点MSI差异较显著(见Table 2)。30例食管癌组织中，D3S1067和D18S58两个位点均正常的有18例，8例在D3S1067位点出现MSI，为26.7%，频率较高；6例在D18S58位点出现MSI，为20%；2例在两个位点同时有MSI的表达(见Table 2)。2. 食管癌中3号染色体，尤其是3p14～3p21位点的重排频率较高。3. 23例鳞状细胞癌中，MSI阳性者有6例，为26.1%；2例腺癌的MSI阳性有1例；5例小细胞癌均为MSI阳性，即100%。可见，食管小细胞癌MSI阳性率明显高于食管鳞状细胞癌，其差异在统计学上有非常显著意义(P<0.01) (见Table 3, Figure 1,2)。4.病理分级中，20例高～中分化食管癌标本，其MSI阳性者有6例，阳性率为30%； 10例低～未分化标本中6例检测到MSI，阳性率是60%。PTNM分期Ⅰ～Ⅱ期标本中MSI阳性率为41.2%，Ⅲ期的阳性率为38.5%，其差异在统计学上无显<WP=6>著意义(p>0.05) (见Table 3)。食管癌标本中有区域淋巴结转移的MSI阳性率为35.7%，无区域淋巴结转移的阳性率为43.7%，差异无统计学意义(P>0.05) (见Table 3)。癌组织侵及粘膜、粘膜下层和肌层标本MSI阳性率为36.4%，侵及全层和食管外组织标本的阳性率是42.1%，差异无统计学意义(P>0.05) (见Table 3)。结论：1. MSI与食管癌的临床病理类型有关，尤其是与食管小细胞癌的发生关系密切。2. 研究未发现MSI与食管癌的临床分期、细胞分化程度、癌组织浸润深度和有无区域淋巴结转移等参数相关。3. 在3p、18q位点均检测到较高频率的MSI，说明食管癌在多个染色体位点均存在微卫星不稳定现象。4. 3p21位点检测到较高频率的MSI现象，说明3p是食管癌相关的热点区域，3p位点基因的改变在食管癌发生过程中具有较重要意义。5. 本实验只发现MSI与食管癌的临床病理类型有关?
刘丽[9]2008年在《胃癌相关性分子标记物的研究》文中提出目的本研究拟从CDH1基因序列再测序、miRNA表达及微卫星片段分析三个角度研究探讨胃癌的相关性分子标记物,并探讨研究方法的可行性,为进一步深入研究胃癌的机制提供参考。方法CDH1基因序列再测定的研究抽提汉族胃癌肿瘤组织和对应正常胃粘膜组织的基因组DNA,抽取正常健康人外周血基因组DNA。采用Applied Biosystems公司的CDH1基因再测序引物,分别进行PCR。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物纯化后再进行测序反应。NaAC/EDTA法进行测序反应产物纯化。甲酰胺变性,上测序仪进行毛细管电泳。电脑软件自动采集信号、分析原始并读出序列图谱。采用SeqScape v 2.1.1软件进行序列比对,寻找基因变异位点。miR-21、miR-145及miR-155的表达提取石蜡包埋的肿瘤组织和正常胃组织的总RNA,采用美国Applied Biosystems公司设计的特异茎环状引物进行逆转录反应,以U6为内参照基因,实时定量PCR技术检测miR-21、miR-145和miR-155的表达。根据实时获得的反应初始浓度的Ct值,分别计算各样本的ΔCt值,再以2~(-ΔCt)值进行t检验分析。微卫星不稳定研究提取冻存的胃癌组织和正常对照组织的基因组DNA。采用多重荧光PCR方法,在同一管内进行D2S123、D17S250、D5S346、Bat-25和Bat-26五个引物对的PCR反应。PCR产物变性后,在ABI3100测序分析仪上进行毛细管电泳。采用GeneMapper 3.0软件进行比对、判读微卫星不稳定。BAT25的调查性测序研究提取健康人群的基因组DNA进行BAT25的测序分析,调查BAT25在汉族人群中的真实数据情况,为病理诊断MSI提供参考依据。结果CDH1基因序列再测定的研究1)在散发性胃癌中发现11个CDH1基因变异位点,其中-49位点G＞T突变为新发现变异。-1030位点的A基因型和-284位点的A基因型与散发性胃癌的低分化显著相关。2)在家族性胃癌成员中除发现散发性胃癌具有的变异外,另外发现8处新突变,均未见报道。这8处位点都位于邻近编码区的内含子处。miR-21、miR-145及miR-155的表达1)miR-21和miR-145在胃癌和正常胃黏膜组织中的表达丰度高于miR-155在正常胃组织和肿瘤组织中的表达丰度。2)胃癌组织的miR-21表达显著高于正常组织的miR-21表达。3)胃癌组织的miR-155表达显著高于正常组织的miR-155表达。4)miR-145在肿瘤组织中的表达与正常组织无显著性差异,但总体来看,其在肿瘤中的表达低于正常组织。微卫星不稳定研究1)MSI胃癌在检测的散发性胃癌中阳性率达到35.1%,与文献报道的阳性率类似。五个位点中,BAT25在MSI中的阳性率最高,为85.0%;其次为BAT26,为45.0%;发生频率最低的位点是D17S250(5.0%)。2)MSI胃癌与MSS胃癌在性别、肿瘤分化程度、组织学分类、淋巴结转移、临床分期及TNM分期、Hp感染等方面无统计学差异。但MSI与MSS胃癌在年龄方面表现一定的差异。另外,MSI胃癌与hMSH2的低蛋白表达相关。BAT25的调查性测序研究1)BAT25在健康汉族人群中表现为单碱基准单态性。2)BAT25在作为微卫星位点判断肿瘤的微卫星不稳定时应同时设立正常对照进行实验。结论癌症基因组再测序技术能够发现并筛查出更多与癌症疾病相关的基因突变。我们应用基因序列再测序技术对CDH1基因在散发性胃癌和家族性胃癌成员中的变异进行筛查,共检测出19处CDH1基因变异,其中发现9个新的突变位点。-1030位点的A基因型和-284位点的A基因型趋向于胃癌的低分化。家族性胃癌成员比散发性胃癌具有更多的突变位点。CDH1基因多处变异的生物学意义有待进一步研究。miRNAs与肿瘤的发生、浸润和转移相关。在肿瘤研究中,miRNAs的研究应首先着眼于在肿瘤和正常组织中表达有差异的miRNAs。本研究采用石蜡包埋组织进行miRNAs表达研究,证明miRNAs在胃癌发生中起着重要的作用,发现胃癌与miR-21和miR-155的过表达相关,部分胃癌与miR-145的低表达相关。福尔马林固定、石蜡包埋的标本可以用来较好地进行大规模回顾性研究中miRNAs的表达研究。多重荧光PCR方法可以很好地用来检测胃癌的微卫星不稳定状态,较传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳更方便、精确。汉族散发性胃癌的MSI与性别、肿瘤分化程度、组织学分类、淋巴结转移、临床分期及TNM分期、Hp感染等方面无显著性相关。胃癌MSI的发生与错配修复基因hMSH2的低表达相关。本研究中BAT25发生MSI的阳性率最高。本研究首次用测序方法证实中国健康人群BAT25具有单碱基准单态性,并且建议在利用BAT25进行MSI分析时,应同时设立正常对照。
郑枫芸[10]2007年在《中国人胃癌KAI1、SFRP1基因遗传不稳定性的研究》文中指出研究背景恶性肿瘤起病隐匿，微小癌灶的浸润和转移难以及时探查和治疗，是患者生存率低的主要原因。为此，阐明肿瘤浸润及转移的机制，确立可靠的预后指标和治疗靶点极为重要。研究发现，随着肿瘤进展和转移的发生，肿瘤细胞内抑癌蛋白的表达量减少，逐渐失去对肿瘤细胞生长、转移的抑制，表现为肿瘤的浸润与转移。而抑癌基因的失活是编码蛋白量减少的重要机制之一。为揭示抑癌基因失活的机理，国内外针对P53、P16等抑癌基因作了大量研究，结果表明基因的遗传不稳定性改变，即微卫星不稳定性(microsatellite instablility，MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，可能是产生基因突变，导致抑癌基因功能失调，引起肿瘤发生的重要因素。微卫星是由2～6个核苷酸组成，具有高度多态性的简单串联核苷酸重复序列。MSI是指由于复制错误导致微卫星的增多或减少。LOH是指一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现缺失或变异。大量研究表明，抑癌基因MSI与LOH在肿瘤的多步骤发生过程中起着重要的作用。MSI首先是在遗传性非息肉性结直肠癌(heredity non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)中发现的，后在各种散发性肿瘤如大肠癌、胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均发现MSI。研究表明MSI的发生提高了随机突变率，更重要的是导致了肿瘤相关基因的突变，可能是引起肿瘤发生的一个重要机制。若DNA复制错误的结果是等位基因片段的缺失，则导致LOH的发生。研究发现与抑癌基因相关的杂合性微卫星位点常伴有等位基因的丢失，即LOH的发生。所以分析LOH已成为目前检测抑癌基因失活、发现和定位新的肿瘤抑制基因的重要手段之一。KAI1(Kang AI 1)基因是近年发现的一个新的肿瘤转移抑制基因，Dong等首先从前列腺癌细胞系中分离鉴定，能抑制鼠前列腺癌细胞肺转移但不影响其致瘤能力。有研究证明，在多种癌组织和细胞系中检测到KAI1在分子水平上的表达，然而它在胃癌中的表达情况，国内外报道较少，且结论尚有争议。胃癌KAI1基因的遗传不稳定性研究尚鲜见报道。SFRP1(Secreted Frizzled Related Protein 1)基因定位于8p11.2，其编码一种分泌型糖蛋白，它可能与受体竞争结合Wnt蛋白，或直接与Wnt蛋白结合，由此阻断了Wnt信号传导通路。目前发现，有十几种已知的高发性癌变(如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌等等)都出现Wnt信号传导途径的失调，越来越多的学者偏向于认为SFRP1基因的遗传学改变和SFRP1蛋白的表达失活，导致Wnt通路异常活化而引发肿瘤，而国内外研究尚未结合肿瘤临床病例资料分析其SFRP1基因遗传不稳定性及SFRP1蛋白表达下调的临床学意义。研究目的研究KAI1基因D11S1344、D11S1326位点和SFRP1基因D8S505、D8S1722、D8S1180位点微卫星不稳定(microsatellite instablility，MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，对肿瘤KAI1蛋白、SFRP1蛋白表达的影响，阐明KAI1基因、SFRP1基因遗传不稳定性与肿瘤进展的关系，为揭示抑癌基因作用机制和肿瘤转移机制提供实验依据。研究方法(1)苯酚-氯仿抽提法，提取石蜡包埋的胃癌组织基因组DNA。(2)PCR-单链构象多态性(SSCP)、常规银染检测位点的遗传不稳定性。(3)Envision免疫组织化学检测蛋白表达。(4)Leica-Qwin计算机图像分析蛋白表达。(5)SPSS软件统计分析相关性。研究结果(1)胃癌KAI1基因遗传不稳定性及肿瘤临床病理特性的相关性研究：①胃癌KAI1蛋白阳性检出率为55.4％。②随着癌组织浸润程度的进展，其阳性率呈降低趋势(P＜0.01)；KAI1蛋白表达率在无淋巴结转移组(83.9％)显著高于淋巴结转移组(20.0％，P＜0.01)；在TNMⅠ+Ⅱ期(82.8％)明显高于TNMⅢ+Ⅳ期(25.9％，P＜0.01)。③56例胃癌D11S1326，D11S1344位点的SSCP分析中，均未出现MSI或LOH。(2)70例胃癌D8S505、D8S1722和D8S1180位点的SSCP分析中，均未出现MSI或LOH。结论在胃癌的发生发展中，KAI1基因D11S1326，D11S1344位点未见遗传不稳定性改变。KAI1蛋白表达与胃癌组织浸润、淋巴结转移及恶性进展密切相关。KAI1蛋白表达水平可能成为评估肿瘤细胞转移潜能的一个重要指标。在胃癌的发生发展中，SFRP1基因D8S505、DSS1722和D8S1180位点未见遗传不稳定性改变。SFRP1基因的遗传不稳定性可能不是影响胃癌发生与恶性进展的主要因素。在不同肿瘤中，SFRP1基因遗传不稳定性的抑癌机制可能也具有差异。
参考文献：
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[7]. 胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源及临床病理意义的研究[D]. 王玲玲. 浙江大学. 2010
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[9]. 胃癌相关性分子标记物的研究[D]. 刘丽. 南京医科大学. 2008
[10]. 中国人胃癌KAI1、SFRP1基因遗传不稳定性的研究[D]. 郑枫芸. 浙江大学. 2007
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