魏聪1 张春燕2 肖斌2 邵军2（通讯作者）
(1 泸州医学院附属中医医院检验科 四川泸州 646000)
(2 泸州医学院生物化学教研室 四川泸州 646000)
【摘要】 目的：建立丹参作用后人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系，提高其分辨率和重复性。方法：丹参作用于人肾小管上皮细胞，提取全蛋白，按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离，并对各个关键因素进行了优化。结果：最终选择的裂解液配方是1%TBP，4%CHAPS，0.2%Bio-Lyte，40mmol/L Tris，8mol/L尿素，2mol/L硫脲；使用pH 4～7的IPG胶条，电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整；改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色。从而获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱。结论：成功建立了丹参作用后人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系，具有较高的分辨率和重复性，为进一步较为系统、全面、准确的评价丹参及其复方制剂的作用机制和药效提供方法学基础。
【关键词】双向电泳 蛋白质组 丹参 人肾小管上皮细胞
【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）01-0097-02
Establishment of Two-dimensional Electrophoresis System for Proteomes from salviae miltiorrhizae treated Human Kidney Tubular Epithelial Cells
WEI Chong1, ZHANG Chun_yan2 , XIAO Bin2, SHAO Jun2
(1Clinical Lab of Traditional Chinese Medicine Hospital, 2Department of Biochemistry, Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan, 646000, China. e-mail: zcy_2004_116@163.com )
【Abstract】 Objective: This study aimed to establish a system of two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) for separation of proteomes from Human Kidney Tubular Epithelial Cells. Methods: After the cultured HK-2 cells were treated by salviae miltiorrhizae，the proteins were extracted, and separated by 2-DE in standard conditions with an optimization for each important experimental parameter. Results: The lysis buffer containing1%TBP, 4%CHAPS, 0.2%Bio-Lyte, 40mmol/L Tris, 8mol/L urea, 2mol/L thiourea was applied to extract proteins from cells. The passive rehydration scheme of samples was used to help the separation of large molecular weight proteins in the IPG gel. Electrophoresis parameters recommended by Bio-Rad Corporation were adjusted adequately. In the process of silver staining, a sufficient washing operation ensured a week background of 2-DE maps. Conclusions:Under above optimized conditions, 2-DE maps with high resolution have been reproducibly obtained. Therefore a 2-DE separation system for proteomes from HK-2 cells has been successfully established.
【Key words】Two-dimensional gel electrophoresis Proteome salviae miltiorrhizae Human Kidney Tubular Epithelial Cell
现代生命科学技术的发展推动了农业现代化前进的步伐。蛋白质组学作为后基因组时代研究的核心内容之一，其研究技术已渗入到农业领域。蛋白质组(proteome)是指由一个细胞的基因组所表达的全部相应的蛋白质。蛋白质组学(proteomics)是对蛋白质的表达方式、功能及相互作用的全面研究；或是对一种细胞、组织或生物体内蛋白质特征的全面探索及描述[1-2]。而双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）作为蛋白质组研究的三大核心技术之一，是目前分离复杂蛋白质组分最常用的工具。
由于肾小管上皮细胞对缺血缺氧高度敏感，所以在肾缺血再灌注损伤（renal ischemia reperfusion injury, RIRI）中最早出现损伤的部位便是肾小管，因此临床上患者肾功能的恢复主要取决于肾小管上皮细胞损伤与修复过程动态平衡的最终结果[3]。
丹参，又名紫丹参，为唇形科植物丹参（salviae miltiorrhizae）的干燥根及根茎，主产于四川、安徽、江苏、河南、山西等地。近年来研究发现丹参提取物对RIRI具有保护作用[4-5]，但具体机制不甚明了。
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本实验旨在建立丹参作用后人肾小管上皮细胞蛋白质组的双向电泳分离体系，以进一步探讨丹参对细胞的药理作用，了解其对细胞、组织器官或生物体的综合作用，以期为全面准确地评价丹参及其复方制剂的分子机制和药效作用提供有力的技术保障。
1 材料与方法
1.1 实验细胞株
人肾小管上皮细胞株（HK-2），由四川大学华西医学中心内科实验室提供。
1.2 主要实验试剂
电泳试剂均购自Bio-Rad公司；分子量标准蛋白购自碧云天公司；琼脂糖为日本进口分装。
1.3 实验方法
1.3.1 HK-2的药物作用及蛋白的提取
人肾小管上皮细胞株（HK-2）传代后，高糖DMEM培养液常规培养，生长2～3d至80%左右密度，加入500mg/mL的丹参 (即丹参的生药浓度为500mg/mL)，对照组加入等量的培养基，再将HK-2置CO2培养箱中常规培养20min。20min后，弃去培养液，生理盐水洗涤3次，加入细胞裂解液（1%TBP，4%CHAPS，0.2%Bio-Lyte，40mmol/L Tris，8mol/L尿素，2mol/L硫脲），4℃震荡30min。4℃，12000rpm离心1h，收集的上清液即为蛋白质提取物。用Bradford法测定各样品的总蛋白含量，分装，-80℃保存，备用。
1.3.2 等电聚焦电泳（IEF）
将－20℃保存的17cm pH 4～7 IPG胶条室温放置10min，沿壁在泡胀槽中加入300μl胶条泡胀液（8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS，2 ml/L Bio-lyte，40 mmol/L DTT，微量溴酚蓝），将胶条胶面向下轻放入泡胀槽中，在胶条表面加入2ml矿物油防止水分蒸发。每100μg蛋白质样品溶于450μl样品水化液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS，20℃泡胀16h。聚焦条件根据Bio-Rad公司推荐方案优化后，总伏时数约为80000。
1.3.3 SDS-PAGE电泳
第二向电泳采用10% SDS-PAGE。将平衡后的IPG胶条置于SDS凝胶（T为10%，C为2.6%，20cm×20cm）上缘，琼脂糖包埋，加电极缓冲液，设定稳流10mA/胶条垂直电泳15min后，增加电流至20mA/胶条，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。
1.3.4 染色
电泳结束后，采用改良硝酸银法。即：银染固定液（50% 甲醇，5% 乙酸）固定凝胶1 h；50％乙醇洗涤液于50℃洗涤2次，30min/次；敏化液（0.2%硫代硫酸钠）敏化1min；超纯水洗涤3次，1min/次；加入新鲜配制的银染液（0.2% AgNO3、0.75ml/L甲醛）避光银染20min后用超纯水漂洗2次，1min/次；加显色液（2%无水碳酸钠、0.0004%硫代硫酸钠、0.5ml/L甲醛）作用4～15min后，终止液（1%乙酸）终止反应。
2 结果
以pH 4～7的IPG胶条为一向进行等电聚焦，以SDS－PAGE作为二向进行垂直电泳，按上述步骤对丹参作用后人肾小管上皮细胞裂解蛋白进行电泳，最后用改良硝酸银法染色得到具有较高分辨率的2-DE图谱(见图1)。
3 讨论
3.1 药物作用细胞的方式
药物作用细胞主要有2种方法。一种是含药血清作用细胞，这种方法药物对于细胞的毒副作用比较小，但是实验流程比较烦琐，适合药物作用时间较长；另一种就是将生药直接作用于细胞，对细胞的毒副作用可能比较大，但方法简单。本课题小组在前期的研究中发现药物对细胞作用20min左右，细胞信号强度强[6]。所以本研究采用对细胞也作用20min，时间比较短；而且丹参中各成分对细胞几乎没有什么毒副作用。因此本研究采用了后一种方法，即直接将生药丹参作用于培养3天的HK-2细胞。
3.2 裂解液组成的优化
对于不同来源的样品，需要采用不同成分组成的裂解液才能达到较好的裂解效果[7]。本实验优化比较了多种裂解液配方对2-DE效果的影响，其中裂解液A的组成是40mmol/L DTT，4%CHAPS，0.2%Bio-Lyte，40mmol/L Tris，8mol/L尿素。结果发现大量蛋白停留在了第二向的起始位置，说明大量蛋白质发生了沉降，需要调整尿素、去垢剂等的浓度。在裂解液中添加了2mol/L硫脲（裂解液B）后，显著增强了裂解液的溶解能力及防沉降能力，从而大大改善了2-DE的分离效果。
3.3 IPG胶条的选择
当使用pH值3～10的IPG胶条进行2-DE分离时，人肾小管上皮细胞蛋白绝大多数分布在pH4～7范围之内。因此，我们选择使用pH为4～7的胶条进行人肾小管上皮细胞蛋白质组的双向电泳分离，既保证了能够检获到绝大多数的蛋白斑点，又保证了2-DE图谱较高的分辨率。
3.4 染色方法的优化
双向电泳凝胶的染色通常采用灵敏度较高的银染方法。但影响银离子还原的物质会大大降低银染的灵敏度，其中又以电泳试剂SDS对银染的影响最大[8]。因此，电泳凝胶在固定后，必须充分洗脱。在改良硝酸银法染色中，我们增加了超纯水漂洗的时间，并将50%乙醇加温至50℃进行洗涤，尽量除去SDS。实验中发现，这一步骤至关重要。若不加热洗涤，即使延长洗涤时间，凝胶的背景仍然较深。敏化阶段采用0.2%硫代硫酸钠进行增敏。这是因为银的络合剂硫代硫酸钠可防止自由银离子还原为金属银，减少非特异性染色，降低背景。增敏后的漂洗应充分，否则会因硫代硫酸钠洗脱不完全而致背景加深。
4 结论
本研究对影响丹参作用后的人肾小管上皮细胞蛋白质组2-DE分离的几种关键因素进行了对比摸索，确定了最佳实验条件，获得了高分辨率及重复性的2-DE图谱，建立了适用的双向电泳分离体系，为后续实验研究提供了有力的技术保障。
参考文献
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论文作者:魏聪1,张春燕2,肖斌2,邵军2
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第1期供稿
论文发表时间:2014-4-2
标签：电泳论文; 丹参论文; 肾小管论文; 蛋白质论文; 作用论文; 细胞论文; 双向论文; 《医药前沿》2014年第1期供稿论文;