聂栋[1]2005年在《α1-B糖蛋白前体基因的原核表达及功能鉴定与CYP4F2基因的肾脏靶向表达》文中研究表明第一部分 αl-B糖蛋白前体基因的原核表达及功能鉴定 前言 人类基因组计划已经初步完成,对人类功能基因的探索将是我们研究领域中的艰难任务。α1-B糖蛋白于1986年由Ishioka等人首次从人血浆中分离,2001年本研究组从人胎肝cDNA文库中克隆了人α1-B糖蛋白前体基因,为研究此蛋白功能提供了方便路径。在我们的前期研究中,通过对此基因表达谱及表达调控的研究,推测α1-B糖蛋白可以参与肝再生的进程,促进肝细胞增殖。在进一步研究中,由于从血浆中分离纯化α1-B糖蛋白很困难,利用毕赤酵母表达系统尚未获得α1-B糖蛋白的高效表达,所以利用DNA重组技术,使α1-B糖蛋白在原核细胞中表达,用复性后重组α1-B糖蛋白处理细胞,结合流式细胞仪及MTT方法,观察对细胞增殖的影响。同时,重组α1-B糖蛋白为制备α1-B糖蛋白抗体,获得下游蛋白,及研究蛋白质间的相互作用奠定了基础。 实验材料与方法 PCR扩增α1-B糖蛋白前体基因,构建重组原核表达载体pET28-a(+)-α1-B,转化宿主菌BL21(DE3);诱导表达α1-B糖蛋白,将包涵体蛋白提取、纯化和复性后,做Western印迹鉴定;流式细胞仪和MTT检测分析重组α1-B糖蛋白对细胞增殖的影响。 实验结果 构建的重组原核表达载体pET28-a(+)-α1-B经NheI,EcoRI双酶切,证实已连接上目的基因,测序结果显示基因编码正确;确定诱导温度为
杨裕华[2]2009年在《“劳倦过度、房室不节”肾阳虚模型小鼠及其以药反证脑基因表达谱的研究》文中指出目的:本研究旨在利用基因芯片技术探讨“劳倦过度、房室不节”肾阳虚模型小鼠及其补肾中药金匮肾气丸、右归丸治疗后脑基因表达谱的改变,“以药反证”,并在分子水平上研究药物的作用机理,同时还比较二方剂作用的基因变化。方法:对照组、造模组、金匮肾气丸组和右归丸组,各组雄性小鼠随机为10只、15只、10只和10只。四组均予正常喂养,对照组和造模组每天灌胃蒸馏水0.5mL/只,二治疗组每天分别灌胃金匮肾气丸混悬液0.5mL/只和右归丸混悬液0.5mL/只,造模组和二治疗组均采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养和雄鼠每日游泳至无力下沉共4周,以诱导产生“劳倦过度、房室不节”肾阳虚证。用36K mouse genome array鼠脑芯片检测正常对照组和肾阳虚模型组鼠脑基因,并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显着基因,并进一步查阅北京博奥生物分子注释系统,进行基因功能归类。为进一步验证芯片所检测的差异基因,还应用Real-Time PCR对部分差异显着基因进行检测验证。结果:造模组诱导成功“劳倦过度、房室不节”肾阳虚鼠模型,同时通过基因芯片检测,分别绘制了造模组/对照组与二治疗组/造模组基因表达谱的散点图。造模组/对照组共筛选出186个差异表达基因,其中上调基因150个,下调基因36个。金匮肾气丸组/造模组筛选出299个差异表达基因,其中上调基因114个,下调基因185个。右归丸组/造模组筛选出155个差异表达基因,其中上调基因64个,下调基因91个。二治疗组/造模组基因均上调的基因24个,分别占各组上调基因的21.05%和37.50%,其主要是与神经传递/信号转导、转录/翻译、激素、细胞周期和代谢相关的基因;二治疗组均下调的有35个基因,分别占各组下调基因的18.92%和38.46%,其主要是与转录/翻译、神经传递/信号转导、炎症/免疫、代谢以及影响多巴胺生成的限速酶有关基因。造模组/对照组上调基因而治疗组/造模组基因下调的有23个基因,其主要是与炎症/免疫、神经传递/信号转导等相关基因;造模组/对照组下调基因而治疗组/造模组基因上调的基因有6个,其主要是与细胞周期/细胞结构、神经传递/信号转导、转录等有关基因。结论:造模组上调基因主要涉及与炎症/免疫、氧化应激等有关基因,使得炎症/免疫和氧化反应增强,创伤、损伤反应和凝血机制增强,这些都是机体的保护性反应所致,还有多巴胺神经介质分泌减少引起多巴胺能神经紊乱。下调基因主要与激素(特别是黑色素浓集素和性激素)、细胞周期、信号转导/神经传递、代谢(特别是蛋白质代谢)和生长发育(特别是脑发育和精子发育、受精等)相关基因。金匮肾气丸、右归丸可使肾阳虚小鼠模型显着下调的激素、黑色素浓集素显着上调并促进细胞增殖,从而在基因水平上探讨了金匮肾气丸和右归丸的药物作用机理及其差别。
陈蕾[3]2008年在《染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱及手掌参醇提取物对其影响的研究》文中研究说明矽肺是由于长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘而引起的以肺间质纤维化为主要病变的全身性疾病,在我国属于法定职业病。1991～2002年我国职业病发病总数呈现明显的凹形反弹趋势。发病人数从20世纪90年代初的每年2.2万人逐步下降,1997年最低降至1万人后又呈反弹,2002年达1.5万人,其中主要是尘肺检出率显着回升,发病形势依然严重。卫生部公布的2006年全国共诊断各类职业病报告11519例,其中尘肺病8783例,占诊断职业病病例总数的76.25%。2006年职业病报告具有以下特点:尘肺病例比例增加,发病时间缩短,发病年龄趋于年轻化,未成年工职业健康损害严重。据不完全统计,截至2006年全国累计报告职业病676,562例,其中:尘肺病累计发病616,442例,死亡146,195例,现患470,247例;近15年平均每年新发尘肺病人近1万例。据报道,尘肺病每年对国家造成的直接经济损失约90亿元人民币,间接经济损失无法估计。而矽肺患者占了尘肺病例的近80%,表明矽肺是尘肺中危害最严重的职业病。而且,停止粉尘暴露,尘肺病依然进展;高浓度暴露,发病工龄缩短,发病年龄趋于年轻化,病情严重,死亡率高。并且,随着经济的发展,大量农村务工人员参与无防护措施的接尘工作,接触粉尘作业的人群还在急剧上升。ILO和WHO共同提出全球消除矽肺计划,在2010年使矽肺的发病率显着降低,到2030年完全消除矽肺。我国是尘肺大国,尘肺病人数、接触粉尘作业人数都居世界首位。直至目前,矽肺的发病机理仍然不完全清楚,无早期诊断的特异性指标。一经传统的后前位胸大片确诊,肺部病变已经无法逆转。而且也无特异性的治疗药物和方法,我国防治矽肺的药物主要有克矽平、磷酸喹哌、羟基喹哌、柠檬酸铝、矽肺宁、汉防己甲素以及某些中药等,但大多有一定的毒副作用。因此,研究矽肺早期病理机制,及寻找一种安全有效、低毒的新型抗纤维化药物,在矽肺病研究中已成为迫切需要解决的问题。研究目的为探讨矽肺发生及中药(手掌参)干预后的分子机制,以染矽尘大鼠为研究对象进行肺组织基因表达谱的比较分析,并初步对差异基因的功能进行探讨,以期从基因水平上揭示矽肺发生的分子机制,也为进一步探索更加有效、低毒的防治药物提供基础。研究方法2.1动物模型建立与处理本研究设定四个组,分别为对照组、染矽尘组、手掌参组(模型治疗组)和汉防己组(标准药物治疗组)。本研究采用SPF级近交群雄性Wistar大鼠,随机将大鼠分为四组,每组40只。染矽尘组与各治疗组采用气管暴露法,每只大鼠气管内注入浓度为50mg/ml的矽尘灭菌混悬液1ml,对照组注入0.9%NaCl注射液。染矽尘建模后第二天,手掌参组按手掌参提取物0.8g/100g的量给予,每天灌胃;汉防己组按汉防己甲素液5mg/100g的量给予,隔天灌胃;对照组、染矽尘组给予蒸馏水2ml,每天灌胃,如此直到将动物处死。以建模术时为0d记,模型建立后7d、14d、21d、28d和60d的5个时间点分别取8只大鼠处死,并将肺组织迅速投入液氮待用。采用HE染色和天狼猩红染色法,分别观察矽肺结节和Ⅰ、Ⅲ型胶原,并用Image-Pro Plus Version 4.5 for windowsTM图像分析系统对Ⅰ、Ⅲ型胶原进行定量。2.2基因芯片检测差异基因表达谱应用Illumina激光共聚焦光纤微珠基因芯片分析平台,经RNA扩增和标记、芯片杂交,并用BeadStation500激光共聚焦扫描系统进行扫描;用BeadStudio分析软件将扫描获取的荧光信号强度进行归一化处理,使用Illumina自行开发的算法求Diffscore值,比较一种基因探针在两种组织中的表达差异程度。采用DAVID生物信息学分析工具,采用Fisher精确概率检验,对差异基因的基因功能和生物学通路进行统计学富集分析。并用realrime-PCR的方法对差异基因进行验证。研究结果3.1染矽尘动物模型HE染色:在本次研究的各个时间点中,在注入矽尘后14d时动物出现明显变化,故本研究选用14d进行差异基因研究。主要表现为肺泡腔内肉芽肿进行性纤维化,成纤维细胞和平滑肌细胞增生并平行排列,肺泡壁增厚,可见胶原纤维积聚,肺泡结构破坏,出现斑片状纤维化。细胞结节数量多,体积大,可见巨噬细胞、浆细胞及反应性肺气肿。手掌参组HE染色结果介于矽尘组与对照组之间,肺泡炎和纤维化均有不同程度的减轻。3.2基因芯片检测筛选染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱本次芯片检测出的有效基因为22 107个,按照差异基因的筛选标准,筛选出染矽尘组与对照组的差异基因共1 567个,其中上调基因762个,下调基因799个。对基因功能进行分类,上调基因分为35个基因功能簇,下调基因分为20个基因功能簇,主要涉及:(1)细胞生命生化反应相关基因,包括细胞周期、细胞分化和增殖、细胞凋亡、细胞骨架、细胞信号转导、传递、氧化应激反应、DNA损伤应激反应、热休克蛋白等与毒性机制相关的基因;(2)与DNA、RNA和蛋白代谢,及与转录调节等生物过程相关的基因;(3)与氧化还原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶等分子功能相关基因;(4)以及细胞因子、趋化因子及免疫反应相关的基因等。按生物通路分析,萜类化合物、类固醇、ATP的生物合成、核黄素代谢等通路相关基因表达上调;而Wnt、TGF-β信号途径及淋巴细胞向内皮迁移通路相关基因表达下调。用real-time-PCR方法对SOD2和HMOX1基因进行验证,与基因芯片基因上调的趋势是一致的。3.3手掌参醇提取物对染矽尘早期大鼠肺组织差异基因表达谱的影响手掌参醇提取物对矽肺进程有逆转作用的差异表达基因共539个,其中上调基因308个,下调基因231个。按生物通路分析,与细胞粘附、Notch信号途径、淋巴细胞向内皮迁移、背腹轴形成、细胞通讯等通路相关的基因表达上调,与补体和凝血连锁、造血细胞系、尿素循环、阿耳茨海默病相关的基因表达下调。用real-time-PCR方法对SOD2和HMOX1基因进行验证,与基因芯片基因上调的趋势是一致的。研究结论本次芯片实验结果获取了染矽尘早期的差异基因表达谱,从生物信息学角度群体分析了差异基因表达谱,将众多与矽肺相关的基因分为若干功能相关的群体簇进行研究,这些差异基因主要涉及细胞周期、细胞分化增殖、细胞凋亡、细胞骨架、细胞信号转导、传递、氧化应激反应、DNA损伤应激反应、热休克蛋白等毒理相关基因;与DNA、RNA和蛋白代谢,及与转录调节等生物进程相关基因;与氧化还原酶、氧化磷酸酶、水解酶、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶等分子功能相关基因;以及细胞因子、趋化因子及免疫反应相关基因,由于篇幅所限,未对其一一进行讨论。差异基因功能分类的结果提示染矽尘早期可能存在复杂的基因调控网络。而手掌参提取物成分复杂,活性并不单一,可能多环节干预纤维化的形成,其作用机制可能是:(1)抗氧自由基;(2)抗RNS;(3)缓解血管损伤;(4)抑制淋巴细胞向内皮迁移。综上所述,本研究为进一步研究矽肺发病早期基因网络调控,发现手掌参的药靶基因及早期生物标志物提供了基础数据和研究方向。
吴兴中[4]2004年在《糖链磺酰化和岩藻糖基化结构与肿瘤细胞的转移》文中提出细胞中的糖链对许多细胞功能如生长发育具有重要的作用,抑制和切除细胞表面的糖链都会造成细胞的生长行为的改变,甚至凋亡死亡,而细胞表面的糖链对细胞黏附和迁移功能更是重要,某些 N-型糖链直接参与细胞与细胞外基质的接触和黏附作用,这种细胞与细胞外基质的作用和黏附在肿瘤转移过程中具有重要的意义。但是糖链的结构非常复杂,合成的时候没有既定的模板可以依照,不象核酸和蛋白质具有很好的规律性,糖链结构在相同的细胞表面有时候表现出复杂性,这些多样性的糖链正好是为了迎合细胞的功能所需要,所以在不同的功能阶段的细胞可能有不同的糖链结构表达,同时不同的糖链结构也会影响细胞的生物学功能。例如 N-型糖链中 β1,6GlcNAc 分枝的含量多少直接影响肿瘤细胞对细胞外基质如纤连蛋白、层粘蛋白黏附的强弱,剔除合成这种结构的糖基转移酶之后小鼠,或含有这种糖基转移酶的转基因动物,以及 knock out 小鼠和transgenic mouse 杂交后均可以显着地影响肿瘤在小鼠体内的转移能力。糖链还可以分布于不同的分子上,可以分布在糖蛋白分子,也可以在糖脂分子上。糖链合成主要依赖于细胞内的糖基转移酶,这些糖基转移酶的表达高低和活性的高低直接决定了糖链的合成;当然这些糖基转移酶具有高度的底物特异性,需要细胞内提供特异的糖链底物才能合成,如果缺乏特异性底物也会不能有效地合成糖链;此外糖链的合成还受很多其它因素的影响,糖链合成还受本身结构的影响,如果糖链出现一些终末糖基的时候,糖链合成可以停止。糖链中的岩藻糖基、唾液酸基和糖链磺酰化都是一些终末结构的糖基,本文将就糖链岩藻糖基化结构与糖链磺酰化结构的功能展开研究。全文共分六个部分,摘要如下一、磺酰化脑苷脂在肝癌细胞的表达 本部分研究观察乳糖基脑苷脂磺酰化结构在不同转移潜能的肝癌细胞中的表达,研究与肝癌细胞的转移潜能的关系。通过特异性单克隆抗体,采用免疫荧光染色和细胞酶联免疫两种方法,首先观察了高、低转移潜能的肝癌细胞中磺酰化脑苷脂(SM3、SM4)的表达水平,发现高转移性肝癌细胞 MHCC97H 表达磺酰化脑苷脂的水平明显高于低转移性肝癌细胞 MHCC97L,提示高低转移性肝癌细胞存在着磺酰化脑苷脂表达的差异。利用 10μmol/L 维甲酸处理高转移性肝癌细胞,抑制肝癌细胞的转移潜能以后,磺酰化脑苷脂的表达水平显着下降 3<WP=5>复旦大学 博士论文(P<0.05),接近低转移性肝癌细胞水平,但是磺酰化脑苷脂的前体分子半乳糖基神经酰胺水平并不降低,提示乳糖基脑苷脂的磺酰化作用受到了抑制。通过抗磺酰化乳糖基脑苷脂(SM3)单克隆抗体和抗磺酰化脑苷脂单克隆抗体(包括SM3, SM4)结合的比较分析,肝癌细胞表达差异的主要是磺酰化乳糖基脑苷脂。二、磺酰化脑苷脂在肝癌细胞的表达 为了研究高表达磺酰化脑苷脂对肿瘤细胞恶性行为的影响,本部分通过基因转染的方法建立了高表达磺酰化脑苷脂的细胞体系。磺酰基转移酶具有高度特异性,有些细胞即使高表达磺酰基转移酶基因,也不一定会有高的磺酰化产物合成。本部分通过脑苷脂磺酰基转移酶(CST)基因表达框架,插入到哺乳细胞表达质粒pCXN2 的克隆位点,构建成脑苷脂磺酰基转移酶的表达质粒。通过脂质体转染技术把这个表达质粒转染到人肝癌细胞 Hep3B 和黑色素瘤细胞 B16/F1 中,通过标记基因的筛选,获得转染细胞的克隆。进一步通过 Northern blot 分析筛选了高表达脑苷脂磺酰基转移酶基因的细胞克隆,对照载体质粒转染的细胞均没有 CST基因的表达,说明转染的细胞能够表达该基因;但是高表达 CST 基因不一定意味着细胞克隆具有高的脑苷脂磺酰基转移酶活性或其产物糖链的合成,因此通过特异性磺酰化脑苷脂单克隆抗体的检测,与这些克隆细胞进行结合,分别进一步筛选到了两个克隆细胞,在肝癌细胞克隆 CST 6 和 8,在黑色素瘤细胞为克隆CST 1 和 3。除了抗体的结合以外,本部分还直接提取了转染的肝癌细胞中酸性糖脂,进行薄层层析免疫印迹分析,结果发现转染的肝癌细胞中表达有较高的磺酰化脑苷脂,通过与标准品的对照以及单克隆抗体的识别,这种高表达的磺酰化脑苷脂主要为磺酰化乳糖基脑苷脂。黑色素瘤细胞也类似。本部分的研究显示CST 基因可以在肝癌和黑色素瘤细胞中高表达,并能够合成磺酰化产物。叁、高表达磺酰化脑苷脂对肝癌细胞转移的的影响 磺酰化脑苷脂是细胞中重要的酸性糖脂成分,对细胞的黏附具有重要的作用,但是不清楚磺酰化脑苷脂在肿瘤转移过程中起什么作用。本部分通过脑苷脂磺酰基转移酶(CST)基因的转染,使 Hep3B 肝癌细胞高表达磺酰化脑苷脂,再观察高表达磺酰化脑苷脂水平对肝癌细胞转移潜能的影响。通过细胞黏附试验发现CST 基因转染的肝癌细胞对玻连蛋白(vitronectin)的黏附显着增强,比未转染的或转染载体的肝癌细胞升高 3~4 倍,对层粘连蛋白的黏附也有轻度的加强。这些黏附作用通过竞争性抑制试验,发现半乳糖基神经酰胺可以部分抑制对玻连蛋白和层粘蛋白的黏附作用,半乳糖基神经酰胺是磺酰化脑苷脂分子的前体,没有磺酰基团,作为竞争性抑制剂。为了
王冰林[5]2005年在《马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探》文中认为马铃薯(Solanum tuberosum L.)是国际上第四大粮食作物。由致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是世界农业生产中最具破坏性的植物病害之一，在世界各地广为流行，晚疫病防治一直为国际社会所关注。由于水平抗性是由微效多基因控制的非小种专化抗性，抗性较为持久、稳定，所以选育广谱、持久的水平抗性品种已成为马铃薯晚疫病抗性育种的必然趋势。目前，研究人员已开展了水平抗性相关的数量性状位点(QTL)的定位以及差异表达基因分离、鉴定等工作，但这些基因在晚疫病菌侵染期间的动力学表达模式、参与的防卫代谢途径和调控机制以及水平抗性信号传导网络尚不清楚。为此，本研究应用cDNA微阵列技术，综合分析了1009条马铃薯晚疫病水平抗性相关的表达序列标签(ESTs)在晚疫病菌和不同非生物因子处理下的动态表达模式，并比较了这些ESTs在不同抗性马铃薯品种(系)中的表达差异，旨在揭示晚疫病水平抗性的分子基础，为有效利用水平抗性提供理论依据与技术策略。主要研究结果如下： (1) 以水平抗性马铃薯品系(QR；CIP Code：386209.10)叶片为材料，全面分析了1009条ESTs在晚疫病菌侵染过程中的动态表达模式。以每个样点在接种与对照样品中的杂交信号比值>2.2为标准，筛选出669个显着差异表达ESTs，经测序、比对、合并重复类型后，共得到348个代表不同基因的非重复序列片段(Singleton EST)，其中234个与已知功能基因(或ESTs)具有显着序列相似性，而其它114个则被暂定为未知功能ESTs(约占32.8％)。234个已知功能ESTs分属于13个功能类别，即细胞防御、初级代谢、次级代谢、能量代谢、信号传导、转录调控、蛋白质合成、蛋白质降解、细胞运输、细胞结构、结合功能蛋白、系统性反应和发育。根据鉴定基因的病原诱导表达模式，可将马铃薯对晚疫病菌的防卫过程大致区分为叁个明显时期，从而在分子水平上初步揭示了晚疫病菌侵染马铃薯叶片的自然过程，并预测了这些事件发生的时间顺序以及参与每个阶段的基因。这些基因的病原诱导表达谱可作为马铃薯防御机制深入研究的重要平台，并可为确定晚疫病水平抗性候选基因及其参与的防御路径、调控机制等研究提供线索。 (2) 在上述348个晚疫病抗性相关基因中，包括98个代谢相关基因。根据这些基因在晚疫病菌侵染后的动态表达模式，初步推断，共有11条代谢途径可被晚疫病菌诱导激活，即莽草酸途径、苯丙烷类途径、氧合脂类途径、多胺合成与降解途径、生物碱合成途径、乙烯(ET)合成途径、糖酵解途径、类异戊二烯途径、磷酸戊糖途径、叁羧酸循环和乙醛酸循环途径。这些代谢相关基因各自具有的特异性诱导表达模式暗示了上述途径可能在相互联系、彼此协调的代谢网络中发挥作用，从而共同参与了马铃薯抵御晚疫病菌侵染过程。位于上游的糖酵解和莽草酸途径对于满足下游的叁羧酸循环、类异戊二烯、生物碱合成和苯丙烷类等代谢途径所需的底
秦芳[6]2014年在《EDCs暴露对稀有鮈鲫脑中生殖调控相关基因表达及转录组的影响》文中认为环境中的内分泌干扰物（EDCs）能模拟体内激素，破坏人类和其他动物的正常内分泌功能。EDCs能影响神经内分泌系统的生殖调控，这种调控机制涉及下丘脑-垂体-性腺（HPG）这条生殖轴线的各个层面。HPG轴主要是由促性腺激素释放激素、促性腺激素和性类固醇激素叁种激素调节的。稀有鮈鲫被广泛用于水生毒理学的研究，是研究EDCs的一种理想模式鱼类。本研究首先克隆并使用叁种计算方法筛选了研究稀有鮈鲫mRNA表达所需的内参基因；其次采用实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测了经BPA/EE2暴露之后，稀有鮈鲫HPG轴上与编码和调控上述激素相关的12个基因在脑中和性腺中的表达情况。除此之外，还采用了高通量测序技术分析了EE2暴露之后稀有鮈鲫脑组织基因转录组特征。本研究主要包括以下结果：（1）在稀有鮈鲫中克隆得到了5个常用的看家基因：转录延长因子（ef1a）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapdh）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（g6pd）、TATA-box结合蛋白基因（tbp）和α微管蛋白基因（tuba1）。利用qRT-PCR的方法检测了稀有鮈鲫早期发育阶段全鱼组织（18-50dpf）、经EDCs暴露之后的幼鱼全鱼组织和成鱼性腺组织的β肌动蛋白基因（actb）和上述五个看家基因的mRNA表达稳定情况。根据geNorm、NormFinder及BestKeeper叁种计算方法对基因稳定性进行排序，从而筛选出最适合的内参基因。同样的，经EDCs暴露之后，对4个看家基因（actb、ef1a、gapdh和tuba1）在成鱼脑中表达的稳定性进行排序。结果显示actb基因在幼鱼发育阶段及EDCs暴露之后的幼鱼全鱼及成鱼性腺中表达最稳定；EDCs暴露之后成鱼脑中ef1a基因表达最稳定。EDCs影响了幼鱼g6pd和tuba1mRNA的表达，而未影响actb、ef1a、gapdh和tbp mRNA的表达。（2）克隆了编码稀有鮈鲫促性腺激素释放激素两个亚型（GnRH2、GnRH3）、促性腺激素释放激素受体1的两个亚型（GnRHR1A、GnRHR1B）、促性腺激素的两个β亚基（FSHβ、LHβ）和促性腺激素受体（FSHR、LHR）共8个基因的全长序列。通过系统发育树和氨基酸多重比对发现，稀有鮈鲫与其他鲤科鱼类的上述8个基因具有较高同源性。采用qRT-PCR的方法检测了GnRH2、GnRH3、GnRHR1A、GnRHR1B、FSHβ、LHβ、FSHR和LHR的组织表达情况，结果显示GnRH2、GnRH3、GnRHR1A、GnRHR1B、FSHβ和LHβ主要在脑中表达，而FSHR和LHR主要在性腺中表达。（3）qRT-PCR方法检测了8月龄稀有鮈鲫经过5和15μg/L BPA处理35天后脑中GnRH2、GnRH3、GnRHR1A、GnRHR1B、FSHβ和LHβ及性腺中P450芳香化酶（cyp19a1a）、FSHR和LHR表达量情况。同时观察了暴露之后卵巢的组织学变化，发现15μg/L的BPA抑制了卵母细胞成熟。15μg/L BPA能显着抑制卵巢和精巢中cyp19a1a的表达，此浓度的BPA会上调雌性稀有鮈鲫脑中GnRH3和GnRHR1A的表达。（4）3月龄稀有鮈鲫经过1、5、25和125ng/L EE2暴露3天和6天后，对脑组织中的FSHβ、LHβ和雌激素受体（esr1、esr2a和esr2b），性腺组织中的FSHR、LHR和cyp19a1a基因的表达量进行了检测。LHβ表达被显著抑制，而FSHβ的表达则没有受到影响。EE2经6天暴露后均能显着抑制esr2b的表达；1和25ng/L的EE2暴露6天能显着促进雌鱼esr2a的表达；esr1的表达未受EE2影响。皮尔逊相关性分析显示雄鱼脑中esr2a的表达与LHβ的表达负相关，雌鱼脑中esr2a的表达与LHβ的表达正相关，esr2b的表达与LHβ的表达负相关。在雄鱼中，EE2能够显着抑制精巢中FSHR的表达；而在雌鱼中，EE2能够显着促进卵巢LHR的表达。EE2均能显着抑制雌雄鱼性腺中cyp19a1a的表达。在精巢组织中FSHR和LHR的表达都与cyp19a1a正相关。（5）采用高通量测序技术研究了25ng/L EE2暴露7天之后稀有鮈鲫脑组织的转录组特征。构建了雌雄鱼脑中对照组及处理组共8个数字基因表达谱文库。每个文库均获得超过0.68Gb的reads。与对照组比较，雌鱼脑中有276个差异表达的基因，包括132个上调表达基因和144个下调表达基因；雄鱼脑中有194个差异表达的基因，包括110个上调表达基因和84个下调表达基因。GO功能富集分析表明雌鱼的差异表达基因主要参与生物过程，尤其在代谢过程中差异富集最显着；雄鱼的差异表达基因没有显着性富集。KEGG通路显着性富集分析发现EE2暴露之后，雌雄鱼脑中差异表达基因分别富集到92个和85个KEGG通路中。雌鱼脑中的差异表达基因主要富集于氧化磷酸化通路、核糖体信号通路和总代谢通路。综上所述，本文研究了BPA和EE2对雌雄稀有鮈鲫HPG轴的内分泌干扰作用。基于上述研究，它不仅能帮助我们了解EDCs可能的雌激素作用机制，也能为研究EDCs对其它脊椎动物乃至人类的危害及作用机理提供可靠的理论依据和基础。
秦炜炜[7]2010年在《模拟失重条件下microRNA-494抑制成骨细胞分化作用机制的研究》文中研究指明空间长期重力环境的改变会引起机体多个系统的变化,包括骨质疏松、肌肉萎缩、免疫系统功能不全、心血管系统适应性减弱等。通过物理训练和营养补充等措施的实施可以缓解肌肉萎缩、提高心血管系统的适应性,然而,目前尚没有办法对抗微重力引起的宇航员骨质流失,这是威胁长期进行太空工作宇航员身体健康的最主要因素之一。微重力导致骨质流失速度大约为每月减少2 %的骨矿物质密度,相当于绝经后妇女一年流失的骨量。研究表明,重力和机械负荷是保持骨骼完整性的重要因素,然而微重力环境引起骨质丢失的机制尚不完全清楚。已有的研究显示,失重引起的骨量减少是因为骨形成与重吸收之间的平衡被破坏,骨质形成减少,而重吸收保持正常或增加,最终导致了骨量丢失。由于成骨细胞分化是骨骼形成和维持骨量的关键步骤,所以目前被普遍接受的观点认为微重力导致的骨丢失的主要原因是成骨的细胞分化障碍,但是导致成骨细胞分化障碍的分子机制并不完全清楚。miRNA是一类长度约18-25nt的小分子RNA,存在于包括哺乳动物在内的多种有机生命内。miRNA通过完全或不完全互补的方式结合于靶基因的mRNA的3’UTR,负向调控基因表达。大约超过30 %的基因表达都受到miRNA的调控,表明miRNA调控基因表达这一现象是普遍存在的。miRNA在细胞增殖、分化、死亡等过程中发挥着至关重要的作用。许多研究认为,miRNA参与了对成骨细胞成骨过程的表达调控,是成骨细胞分化的重要的调节分子。本研究中我们以BMP-2诱导小鼠间充质多能前体细胞C2C12成骨分化为研究对象,探讨模拟失重状态下,成骨细胞分化过程中miRNA表达谱的改变,进而研究miRNA在失重性骨丢失中的作用及其分子机制。本研究的主要发现和结果如下:1.微重力抑制成骨细胞分化和成熟。我们首先在细胞水平上检测微重力对成骨细胞分化的影响。我们将C2C12细胞置于回转器培养,同时加入300 ng/ml BMP-2诱导分化,对照组不加BMP-2刺激。72小时后,Real-time PCR检测成骨细胞特异基因碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP),骨钙素(osteocalcin,OC),骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和Runx2,结果显示,在模拟失重环境下,成骨细胞分化受到显着抑制。成骨细胞分化过程有多条通路参与,我们检测了微重力对部分通路相关分子表达的影响。我们按上述方法处理C2C12细胞,72小时后收集细胞裂解液,Western blot结果显示,微重力引起BMPR2、FGFR2、Runx2的蛋白表达降低。尾部悬吊能够消除大鼠后肢机械负荷,是研究模拟失重的良好动物模型。本研究中我们采用核素骨扫描检测了悬吊大鼠骨质形成。我们发现,与对照组大鼠相比悬吊大鼠骨和关节中99mTc-MDP的聚集明显减少,而且差异随悬吊时间延长而增大。该结果说明,微重力引起骨代谢减弱,骨生成减少。2.微重力环境可以引起成骨细胞miRNA表达谱的改变。我们将C2C12细胞置于回转器中模拟失重培养,模拟失重培养细胞与对照细胞均加入BMP-2诱导其向成骨方向分化。72小时后,收集细胞提取总RNA并进行miRNA芯片检测。miRNA芯片筛选结果发现了7个显着差异表达的miRNA,其中表达上调的miRNA有2个,表达下调的miRNA有5个。Real-time PCR验证结果与芯片结果基本一致,其中mmu-miR-494模拟失重后表达水平明显升高,mmu-miR-18*, mmu-miR-122a, mmu-miR-301, and mmu-miR-340表达水平则显着降低,但mmu-miR-143的表达与对照组相比无显着差别。生物信息学方法预测表达上调的miR-494的靶基因参与成骨细胞分化,因此我们将关注的焦点放在对miR-494的研究上。给予BMP-2处理的C2C12细胞在模拟失重0、2、4、8、12、24、48和72小时后分别收集细胞检测miR-494表达水平的变化。我们发现,在模拟失重2小时,miR-494表达开始上升,并且随着失重时间的延长,miR-494表达持续升高。此外,我们分离了悬吊大鼠股骨近侧干垢端成骨细胞,检测其中miR-494表达水平,发现悬吊2周和4周的大鼠其成骨细胞内miR-494表达均明显上调,并随悬吊时间的延长而持续升高。该实验表明微重力环境能引起成骨细胞miRNA表达谱的改变,其中mmu-miR-494的升高十分显着,且其表达水平与模拟失重的时间正相关。3. miR-494抑制成骨细胞分化。为了验证miR-494对骨形成的作用,我们首先检测miR-494对细胞增殖和细胞周期的影响。我们将miR-494 mimics及其相应阴性对照(N.C.)转染C2C12细胞和MC3T3-E1细胞,MTT实验和流式细胞术分析结果表明,miR-494对细胞增殖和周期无明显影响。进一步的研究显示,在BMP-2存在时,miR-494能明显抑细胞ALP活性,但未给予BMP-2刺激时,这种抑制效果不显着,表明miR-494可能参与了对C2C12细胞成骨分化的抑制。随后,我们用Reai-time PCR、ELISA和Western Blot分别在mRNA水平和蛋白水平检测了miR-494对成骨细胞特异基因ALP、OC、OPG、Runx2表达的影响。与ALP染色和活性测定结果一致,转染miR-494后细胞中ALP mRNA表达降低,而且无论是否存在BMP-2,OC、OPG和Runx2表达也有所下降。ELIAS分析结果显示,过表达miR-494减少了细胞分泌OC和OPG。在BMP-2诱导下,Runx2蛋白表达上调,但是转染miR-494后Runx2的上调被抑制。Osx是Runx2下游基因,我们发现在BMP-2诱导分化的C2C12细胞中过表达miR-494抑制了Osx的表达。另外,我们还发现在C2C12细胞中过表达miR-494后,其成肌分化的相关基因表达发生了上调,而miR-494对C2C12细胞成脂分化无明显作用。我们的研究表明,miR-494能抑制细胞的成骨分化。4. miR-494通过调节Runx2、BMPR2和FGFR2的表达抑制成骨细胞分化。我们用生物信息学方法在包括miRanda、TargetScan、pictar和RNAhybrid databases等在内的多个网站进行miR-494靶基因预测,得到可能的靶基因超过1,000个。我们进一步从中筛选出参与成骨细胞分化的靶基因30个,并将这些基因3’UTR克隆入荧光素酶报告载体,与miR-494 mimics或N.C.共转染293A细胞,检测其相对荧光强度。结果发现,miR-494能显着抑制BMPR2、FGFR2和Runx2 3’UTR报告基因的荧光素酶活性,且抑制效率达到40-60 %。相反地,突变掉这些基因上miR-494的结合位点后,miR-494对荧光素酶活性的影响消失,表明miR-494可以结合并作用于上述基因的3’UTR。Western Blot和Real-time PCR结果显示,过表达miR-494明显抑制内源性BMPR2、FGFR2和Runx2的蛋白和mRNA表达。为了进一步确定miR-494是通过抑制BMPR2、FGFR2和Runx2的表达影响成骨细胞分化,我们合成了针对这3个基因的siRNA。将3种siRNA分别转染C2C12细胞72小时,成骨细胞特异基因表达下调,骨分化受抑制,其趋势与转染miR-494一致。我们的研究证明,miR-494通过直接下调和Runx2、BMPR2和FGFR2抑制成骨细胞的分化。5.转录因子MyoD可能参与了对miR-494的表达调控。为了探讨miR-494转录调控机制,我们对miR-494上游序列进行了生物信息学分析。分析结果显示,距离pre-miR-494 5’端2-3kb的上游序列在不同种属中有高度的保守性,提示这段序列可能参与了对miR-494的转录调控。进一步的分析表明该区域有多个Myod的结合位点,提示转录因子Myod可能参与了miR-494的转录调节。我们首先分析了模拟失重时,BMP-2诱导分化的C2C12细胞中Myod表达情况,发现随着失重时间的延长,Myod表达发生了上调,这与miR-494表达变化相一致。随后,我们在正常重力条件下培养的C2C12细胞中加入BMP-2,研究细胞分化过程中mi-494与Myod表达变化情况,Real-time PCR结果显示两者表达水平随诱导时间的延长同时下降。此外,我们还发现转染miR-494后,MyoD的表达水平也发生了上调。我们的研究初步显示了转录因子MyoD可能参与了对miR-494的表达调控。为了证实我们的推测,进一步的的相关实验还在深入进行中。6. miR-494 inhibitor能够部分缓解失重引起的成骨分化障碍。模拟失重时成骨细胞分化受抑制,miR-494表达升高。我们将针对miR-494的反义寡核苷酸,即miR-494 inhibitor及其相应对照N.C. inhibitor分别转染C2C12细胞,同时加入300 ng/ml BMP-2诱导分化,置于回转器模拟失重培养72小时,用Real-time PCR方法检测细胞成骨相关基因表达,发现抑制miR-494的表达能够使ALP染色增强,说明miR-494 inhibitor能够增加骨形成能力,部分缓解失重引起的成骨分化障碍。总之,我们发现miRNA参与失重性成骨细胞功能异常的发生。其中,我们对表达上调的miR-494功能和作用机制进行了较为全面的研究,发现在模拟失重时miR-494表达升高,而且与失重时间正相关。体外实验证明,miR-494通过降低其靶基因BMPR2、FGFR2和Runx2的表达参与成骨细胞分化。过表达miR-494抑制成骨相关基因的表达,从而抑制骨形成;降低内源性miR-494表达则促进成骨分化,并且能够部分缓解由于失重引起的成骨分化障碍。该研究将对预防和治疗失重性骨质疏松提供理论依据。
李盛陶[8]2018年在《体外重构N-糖基化途径中多萜醇寡糖前体的合成》文中指出N-糖基化是最重要最频繁的一种蛋白修饰,广泛存在于膜蛋白和分泌蛋白,对糖蛋白的化学性质、生理活性及免疫原性等至关重要。在真核细胞中蛋白质N-糖基化开始于内质网膜(ER)多萜醇寡糖前体(dolichol-linked oligosaccharide:DLO)的合成。DLO由14个单糖组成,它的生物合成由一系列糖基转移酶(asparagine-linked glycosylation:Alg)完成。目前虽然对DLO途径中的ALG基因都已克隆,但是对于这些糖基转移酶的生化功能解析长久以来几乎没有进展。在人体,Alg突变会导致先天性糖基化疾病(congenital disorders of glycosylation:CDG),不同患者的疾病严重程度不一,从出生早期死亡到能够存活至成年很久均有报道。但是目前还没有一种方法能够建立不同的突变与疾病严重程度之间的相关性。另一方面,高甘露糖型寡糖作为N-糖基化修饰之中的一大类广泛应用到糖芯片、疫苗及糖蛋白质量控制等各种生物学研究。目前生产高甘露糖型寡糖的方法为化学合成或从天然来源中分离提取,但是这两种方法都存在耗时耗力和效率低下等缺点。为了解决上述的问题,本论文通过体外重构真核生物DLO合成途径,建立定量检测Alg活性的LC-MS方法,对Alg进行了详细的功能解析及CDG相关的突变研究;进一步的利用化学酶法高效的合成了高甘露糖型寡糖。本论文的主要研究结果如下:(1)建立LC-MS定量检测技术用于Alg1的酶学性质研究。Alg1催化第1个甘露糖(Man)到底物GlcNAc2-PP-Dolichol(DPGn2)上形成产物DPGn2-Man。论文首先化学合成了结构简单、水溶性好Alg1的替代底物:GlcNAc2-PP-Phytanyl(PPGn2),原核表达纯化了酿酒酵母Alg1(35)TM(截掉N端跨膜域),并结合LC-MS技术,建立了定量检测活性的方法。随后对Alg1进行了详细的生化性质研究;以及通过对ALG1-CDG对应于酿酒酵母的保守性突变蛋白的酶比活测定,揭示出了突变导致酶比活下降的程度与CDG疾病的严重程度具有相关性。(2)证明Alg2存在替代催化路线。ALG2编码一个双功能甘露糖基转移酶,同时催化?1,3及?1,6-Man连接到DPGn2-Man上,形成分支结构的3甘露糖核心DPGn2-Man3,但是对于2个不同糖苷键的反应顺序仍存在争议。目前认可的顺序为:先形成?1,3-Man中间产物后,再生成?1,6-Man完成催化,这与30年前报道同时存在两种中间产物的结果相矛盾。本研究首先原核表达纯化了酿酒酵母Alg2,建立了定量检测活性的LC-MS方法。利用灵敏的LC-MS技术和特异性甘露糖苷水解酶(Mannosidase)处理中间产物,首次揭示了Alg2能以不同的催化速率通过两种方式形成最终的产物DPGn2-Man3,即最优先的催化途径为:首先形成?1,3,再形成?1,6;另外,还存在催化速率相对较低的替代合成路线途径:先形成?1,6,再形成?1,3。进一步的通过体外及体内实验相结合,确证了EX_7E motif、N-端细胞质区的短肽结构及3个G-loop motif对于Alg2的活性至关重要。(3)建立LC-MS定量检测技术用于ALG11-CDG的疾病严重程度研究。ALG11编码一个双功能甘露糖基转移酶,连续催化2个?1,2-Man到DPGn2-Man3上,生成DPGn2-Man5。本研究首先原核表达人Alg11,建立LC-MS定量分析活性的方法。检测了引起ALG11-CDG的7个突变Alg11的活性,揭示出了ALG11-CDG相关突变的活性下降程度与疾病的严重程度具有相关性。另外,鉴定了Alg11的EX_7E motif和2个G-loop motif。(4)化学酶法合成高甘露糖型寡糖。通过原核表达一系列甘露糖基转移酶,体外重构了DLO途径生成PPGn2-Man9的过程,能够以90%以上的转化率高效的生产高甘露糖型寡糖。另外,通过不同甘露糖基转移酶的组合,合成了一系列不常见结构的高甘露糖型寡糖。
王德仲[9]2015年在《抗CD20片段抗体在拟南芥种子中的表达及其所引起的内质网应激响应》文中研究指明分子农业（molecular farming）是指在植物中生产包括药用蛋白和工业蛋白在内的重组蛋白以及其他的次生代谢产物。目前已有多种哺乳动物来源的复杂蛋白在植物中获得了表达，如人血清蛋白、生长激素、抗体、疫苗、细胞因子等。在植物生物反应器的各种表达手段中，利用种子表达系统生产重组蛋白具有很多的优点。作为一种天然的储藏器官，种子提供了一个稳定的环境，适于重组蛋白的长期存储，并且有利于重组蛋白的运输。尽管经过多年的不断发展植物生物反应器已经获得了巨大进步，但是对于不同亚细胞位置定向表达重组蛋白对宿主细胞的内质网质量控制系统的影响却知之甚少。本研究中我们在野生型拟南芥Col-0和糖基化突变体TKO的种子中对抗CD20片段抗体进行了表达。首先我们通过PCR的技术分别将南芥2S2信号肽、大麦Amylase信号肽、内质网滞留信号SEKDEL与片段抗体的编码序列融合，构建了4套不同调控序列的植物表达载体，通过Floral Dip法对拟南芥进行了转化，经平皿筛选后共获得181株不同遗传背景和调控序列的转基因株系。通过Elisa、SDS-PAGE和Western Blot对转基因株系中重组蛋白的表达进行了鉴定。最高的表达量是通过融合拟南芥2S2种子储藏蛋白信号肽获得的，可达到总可溶性蛋白的6.12%。通过Endo H和PNGase F处理，我们对纯化后的几种不同N-糖基结构的重组蛋白进行了N-糖基结构分析。WTC2B8SEKDEL的N-糖基结构成高甘露糖型，TKO背景scFv-Fc不存在岩藻糖及木质糖的修饰，WTC2B82S2的N-糖基结构部分以高甘露糖形式存在，但绝大部分为复杂型。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）实验对重组蛋白的抗肿瘤活性进行了鉴定，结果表明不含有岩藻糖修饰的片段抗体具有更强的ADCC能力，而植物源scFv-Fc的CDC能力较Rituximab有所减弱。最后，在种子发育至13dpa（day post anthesis）时，我们通过qRT-PCR的方法对正常生长条件下和热激后宿主细胞的内质网应激反应进行了分析。基于内质网应激感应因子表达的变化，我们的结果表明在拟南芥种子中内质网定向表达重组蛋白对内质网的稳态施加了更大的压力，并且让其更易受到其他应激因素的胁迫。qRT-PCR的结果同样也表明重组蛋白的表达不仅上调了宿主细胞中ERAD（ER-associated degradation）相关基因的表达，并使其质量控制系统变得更为复杂。而宿主的质量控制系统不仅影响着内源蛋白的合成、修饰和分泌，同时也对重组蛋白的终产量有着巨大的影响，因此研究不同亚细胞位置定向表达对宿主内稳态的影响可以为制定最佳表达策略提供思路，特别是考虑到在商业化种植过程中一些环境因素同样可以造成宿主的内质网应激。
参考文献：
[1]. α1-B糖蛋白前体基因的原核表达及功能鉴定与CYP4F2基因的肾脏靶向表达[D]. 聂栋. 中国医科大学. 2005
[2]. “劳倦过度、房室不节”肾阳虚模型小鼠及其以药反证脑基因表达谱的研究[D]. 杨裕华. 山东中医药大学. 2009
[3]. 染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱及手掌参醇提取物对其影响的研究[D]. 陈蕾. 重庆医科大学. 2008
[4]. 糖链磺酰化和岩藻糖基化结构与肿瘤细胞的转移[D]. 吴兴中. 复旦大学. 2004
[5]. 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探[D]. 王冰林. 华中农业大学. 2005
[6]. EDCs暴露对稀有鮈鲫脑中生殖调控相关基因表达及转录组的影响[D]. 秦芳. 西北农林科技大学. 2014
[7]. 模拟失重条件下microRNA-494抑制成骨细胞分化作用机制的研究[D]. 秦炜炜. 第四军医大学. 2010
[8]. 体外重构N-糖基化途径中多萜醇寡糖前体的合成[D]. 李盛陶. 江南大学. 2018
[9]. 抗CD20片段抗体在拟南芥种子中的表达及其所引起的内质网应激响应[D]. 王德仲. 吉林大学. 2015
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