王中强[1]2004年在《天然乳铁蛋白和重组乳铁蛋白的体内、体外抗菌效果及机理研究》文中研究说明本试验以临床使用的抗生素为对照，选取大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌和乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌为试验菌株，采用肉汤微量稀释法、薄层琼脂糖孔穴扩散法和时间动态曲线法等方法在体外测定了天然乳铁蛋白(LF)、乳铁蛋白肽(Lfcin)以及重组猪乳铁蛋白(rPLF，包括草地夜蛾Sf9细胞和试验蚕蛹)的抗菌效果，并通过原子力显微镜等手段探讨了抗菌机理。饲养试验挑选90头、28日龄断奶、平均体重7.0kg左右的杜长大叁元杂交断奶仔猪，按要求分成对照组(不添加rPLF、不添加抗生素)、抗生素组(不添加rPLF、添加20mg／kg黄霉素和110mg／kg金霉素)和rPLF组(添加含rPLF的蚕蛹，不添加抗生素)。每个处理组3个重复组，每个重复组10头仔猪(公母各半)。试验猪采用自由采食，自由饮水方式饲喂，预饲期5天，试验期15天。饲养试验结束时，称重，记录耗料，统计试验期内的腹泻率。饲养试验结束后，随机从各组中选出3头试验猪，在自由饮水情况下禁食24小时后屠宰，取结肠内容物进行肠道菌群分析。结果表明： (1)天然的牛乳铁蛋白(BLF)表现出比人乳铁蛋白(HLF)更高的抗菌活性，以大肠杆菌E．coli ATCC 25922为例，牛乳铁蛋白对它的最小抑菌浓度(MIC)是1500μg／ml，人乳铁蛋白的则是2000μg／ml。经过蛋白酶水解的天然乳铁蛋白具有更好的抗菌活性，其中尤以胃蛋白酶的水解效果最佳，同时水解后牛乳铁蛋白的活性也高于水解后人乳铁蛋白的活性。重组猪乳铁蛋白(rPLF)可以明显抑制细菌的生长，但活性低于天然乳铁蛋白纯品，分析可能是因为没有经过纯化的缘故。经过蛋白酶水解后重组猪乳铁蛋白的活性上升，而相应的空白对照材料只有非常微弱的活性，这可以从一个侧面暗示出产物中已经表达有猪乳铁蛋白。 (2)乳铁蛋白肽(Lfcin)的抗菌活性远远高于乳铁蛋白，最高相差达5002004年浙江大学硕士学位论文倍。同以E.coli ATCC 25922为例，乳铁蛋白肤对它的MIC仅为4协g/ml。另外，乳铁蛋白更多的只是表现抑菌效果，而乳铁蛋白肤还表现出明显的杀菌活性，它对君。022灯ee 25922的最小杀菌浓度(MBe)为16林g/ml。时间动态曲线法也发现它的杀菌活性发挥的非常快，在两个小时内就将90%左右的细菌杀死。薄层琼脂糖孔穴扩散法还发现天然乳铁蛋白和抗生素的抑菌圈边缘比较模糊，而Lfcin的抑菌圈非常清晰，圈内外的界线非常明显，整个抑菌圈呈现透亮状态，说明肤所渗透到之处细菌被完全杀死，这暗示出乳铁蛋白肤可能具有不同与前两者的抗菌机理。 (3)体外试验还发现天然乳铁蛋白和乳铁蛋白肤除了对大肠杆菌等致病菌有明显的抗菌效果外，对乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的抑制活性则非常弱。天然乳铁蛋白肤在试验浓度范围内对两有益菌株均没有表现出抑制活性(MIC>64陀/’ml)，天然乳铁蛋白也仅在最高浓度时对乳酸杆菌有一定的抗菌效果(MIC二5000陀/ml)，对双歧杆菌的生长没有影响。而抗生素尽管能够减少有害菌的生长，但对有益菌生长的抑制作用比乳铁蛋白和乳铁蛋白肤高得多，如对双歧杆菌的MIC两种抗生素都是2陀/ml。这说明乳铁蛋白和乳铁蛋白肤在保护有益菌的繁殖方面效果比抗生素好得多。 (4)铁饱和乳铁蛋白(bolo一LF)的抗菌活性高于天然蛋白，几乎可以完全抑制细菌的生长;天然蛋白的活性高于缺铁乳铁蛋白(apo一LF)，缺铁乳铁蛋白的活性非常微弱，但仍然可以对细菌的生长起到一定的抑制作用，这暗示出乳铁蛋白抗菌作用明显受到铁离子饱和度的影响，饱和度越高抗菌活性越低，同时还可能存在别的机制。 (5)在原子力显微镜下观察到，与乳铁蛋白肤混合后一个小时许多细菌就被杀死，死亡的细菌呈现各种不规则的形态，细胞膜的部分区域发生凹陷，细胞体比较扁平，表明内容物已经溢出，因此判断乳铁蛋白肤可能破坏了细菌的细胞膜，但不能直接观察到膜上是否有缺口。与乳铁蛋白作用后的细菌，菌体由卵圆形或椭圆形转变成细长的杆状，暗示出细菌可能营养不良，推测可能是缺铁造成的。另外还发现，除了生长不好，有一部分细菌的形态也发生了变化，菌体发生弯曲，两端变细，可能是乳铁蛋白直接作用的结果。因此我们判断乳铁蛋白即可2004年浙江大学硕士学位论文以通过结合铁离子也可以直接与细菌作用发挥抗菌活性。 (6)腹泻率方面:rPLF组比对照组降低了66.2%，且差异明显(P<0.05)，添加抗生素组比对照组降低了60.6%，抗生素组和rPLF组之间差异不明显(尸>0 .05)。 (7)肠道菌群方面:与对照组相比，添加rPLF可以减少大肠杆菌生长34.6% (P<0.05)，减少沙门氏菌生长57.4%(尸<0.05)，并且与抗生素组差异都不明显。另外，添加rPLF也可以减少金黄色葡萄球菌的生长，但与对照组相差并不明显。添加rPLF可以增加乳酸菌的数量72.1%(尸<0.05)，增加双歧杆菌的数量143%，差异极显着(尸<0.001)。而添加抗生素对肠道中乳酸菌和双歧杆菌的生长没有明显影响，并且添加rPLF比添加抗生素效果要好(尸<0.05)。这说明添加:PLF可以明显改善断奶仔猪肠道菌群组成比例，减少致病菌的数量增加有益菌的数量，肠道环境的改善必将促进仔猪的健康，减少
韩菲菲[2]2011年在《猪乳铁蛋白肽的分子改良及改良肽的作用机制、生物学功能和重组表达研究》文中研究表明猪乳铁蛋白肽(Porcine lactoferricin -20, LFP-20)是来源于猪乳铁蛋白N端含20个氨基酸残基的阳离子抗菌肽。本研究以LFP-20为模板,通过分子设计对其进行改良,在此基础上研究了改良肽的抗菌活性和安全性,比较了改良抗菌肽LF-2、LF-4、LF-6与LFP-20在膜作用机制方面的差异；通过建立小鼠腿肌和腹腔大肠杆菌染菌模型,研究了改良抗菌肽LF-2、LF-6对小鼠感染大肠杆菌的保护作用,同时探讨了改良抗菌肽对健康小鼠和染菌小鼠免疫功能的影响；进一步利用大肠杆菌和毕赤巴斯德酵母表达系统成功表达了改良抗菌肽LF-6。主要研究结果如下：1.猪乳铁蛋白肽的分子改良及改良肽的筛选在分析LFP-20理化性质、氨基酸组成并对其进行结构预测的基础上,采用去除分子内二硫键、改变疏水性和芳香族氨基酸比例等策略对猪乳铁蛋白肽LFP-20进行分子改良,获得了8种改良肽。对改良肽抗菌活性研究结果表明：与模板肽LFP-20相比,改良肽LF-2、LF-4和LF-6对革兰氏阴性菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗菌活性提高了2-64倍,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性提高了2-8倍,其中,以改良肽LF-6的抗菌活性最好。与模板肽LFP-20相比,在0～32μg/mL范围内叁种改良肽对人和猪的红细胞溶血率没有显着增加(p>0.05)。与模板肽LFP-20相比,0～50μg/mL的改良肽LF-2、LF-4、LF-6对人和猪的外周血单核细胞增殖没有显着差异(p>0.05)；在0-32μg/mL范围内,除8μg/mL和16μg/mL的LF-4以外,改良肽LF-2、LF-4、LF-6对外周血单核细胞的细胞毒性也没有显着增加(p>0.05)。2.猪乳铁蛋白肽及改良肽的膜作用机制研究扫描电镜和透射电镜观察LFP-20及其改良肽LF-2、LF-4、LF-6对E.coli和S.aureus细胞形态影响结果表明,1×MIC的LFP-20及叁种改良肽作用细菌30 min后,对细菌细胞膜结构均有破坏作用,能够导致细胞膜产生不同程度的突起或破损,菌体细胞壁及细胞膜断裂、细胞内容物泄漏,细胞质电子密度明显降低,表明细菌细胞膜是这些抗菌肽作用的重要靶点。在相同浓度下,叁种改良肽LF-2、LF-4、LF-6对E.coli和S.aureus细胞膜产生的去极化作用明显强于模板肽LFP-20,更容易导致细胞膜电势的破坏。8μg/mL～32μg/mL的叁种改良肽对E.coli细胞外膜渗透性的增强作用均显着高于模板肽LFP-20(p<0.05)；与LFP-20、LF-2、LF-4相比,LF-6导致E. coli细胞内膜渗透性的增加作用最为迅速、明显。LFP-20、LF-4和LF-6对DPX与LPS结合的最大抑制率与相近,分别为68%、56%和51%,达到50%抑制率时所需的LF-4和LF-6浓度却明显低于LFP-20,分别为7.96μg/mL和6.91μg/mL,而LFP-20达到50%抑制率时所需的浓度为17.30μg/mL; LF-4、LF-6置换DPX-LPS分子中DPX,结合LPS的能力稍弱于LFP-20,但实现与LPS最大结合所需肽浓度却明显低于LFP-20。16μg/mL和32μg/mL的四种抗菌肽对脂质体膜具有相似的破坏潜能,但与模板肽LFP-20相比,64μg/mL的叁种改良肽对脂质体膜PC:PG(1：1)和PG呈现了更强的破坏作用,引发了40%以上钙黄绿素的释放。上述研究结果揭示,膜破坏机制是LFP-20及其叁种改良肽对E.coli和S.aureus的主要杀菌机制；与LFP-20相比,LF-2、LF-4、LF-6提高的抗菌活性可能它们增强的对细菌细胞膜去极化作用、对细菌细胞内外膜渗透性、更容易与LPS结合以及对脂质体膜的破坏潜能密切相关。3.猪乳铁蛋白肽及改良肽对小鼠感染大肠杆菌保护作用的研究在研究LFP-20及其改良肽LF-2、LF-6对ICR小鼠急性毒性的基础上,建立了ICR小鼠腿肌和腹腔大肠杆菌感染模型,比较了LFP-20与改良肽LF-2、LF-6抵抗小鼠感染大肠杆菌的能力。急性毒性研究结果表明,LFP-20、LF-2、LF-6对ICR小鼠的LD5o分别为34.25 mg/kg、6.54 mg/kg和口29.52 mg/kg。腿肌感染E.coli K88试验结果表明,2mg/kg和口8 mg/kg的叁种抗菌肽对小鼠腿肌染菌都具有预防效果,除2 mg/kg LFP-20外,另外五种剂量的抗菌肽均显着降低了小鼠腿肌E.coli活菌数(p<0.05)；其中,8 mg/kgLF-6对小鼠腿肌染菌的抑制效果最为显着(p<0.05),该组小鼠腿肌匀浆组织中的活菌数为3.85士0.24(lg CFU/g)。预防腹腔感染E.coli K88试验结果表明：与E.coli组相比,2 mg/kg和8 mg/kg的叁种抗菌肽对染菌小鼠腹腔液、肝脏和肠系膜淋巴结感染的大肠杆菌都具有显着的抑制效果(p<0.05),其中以8 mg/kg LF-6的抑菌效果最好,其腹腔液、肝脏和肠系膜淋巴结中大肠杆菌活菌数分别为1.18±0.10(lg CFU/mL)、3.85±0.24 (lg CFU/g)和3.00±0.15(lg CFU/g)。E.coli组盲肠内容物中大肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌活菌数分别为5.57士0.16(lg CFU/g)、6.32±0.09 (lg CFU/g)和5.54±0.17(lg CFU/g);各抗菌肽组的大肠杆菌(除2 mg/kg LFP-20外)均显着低于E.coli组(p<0.05),乳酸菌数和双歧杆菌数(除8 mg/kg LFP-20外)均显着高于E. coli组(p<0.05)。E.coli组粪便中大肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌活菌数分别为6.07±0.09 (lg CFU/g)、5.88±0.04(lg CFU/g)和5.88±0.04(lg CFU/g),各抗菌肽组粪便大肠杆菌活菌数均显着低于E.coli组(p<0.05); 2 mg/kg LF-2组的乳酸菌数显着高于E.coli组(p<0.05)；六个抗菌肽组的双歧杆菌数均显着高于E.coli组(p<0.05)。上述研究结果揭示,LFP-20及改良肽LF-2、LF-6可以通过体内抑菌作用增强小鼠抵抗E.coli K88感染能力,同时,能够改善由于感染引起的肠道双歧杆菌和乳酸菌数量降低,并且改良肽LF-2和LF-6的体内抑菌效果好于模板LFP-20。4.猪乳铁蛋白肽及改良肽对小鼠免疫功能影响的研究LFP-20及改良肽LF-2、LF-6对ICR小鼠免疫功能影响的研究结果表明：与正常对照组小鼠相比,2 mg/kg的LF-2和LF-6显着增加了小鼠的胸腺指数(p<0.05),而8 mg/kg的LF-2和LF-6显着降低了小鼠的胸腺指数(p<0.05)和脾脏指数(p<0.05); 8 mg/kg LF-6显着提高了外周血淋巴细胞百分率(p<0.05),2 mg/kg LF-6显着提高了小鼠外周血白细胞总数；2 mg/kg的LFP-20、LF-2、LF-6和8 mg/kg LF-2、LF-6显着降低了小鼠外周血CD3+CD4+淋巴细胞的比例,2 mg/kg LF-2、LF-6和8 mg/kg LF-2显着增加了小鼠外周血中的B细胞比例(p<0.05),但对NK细胞的数量没有显着影响；8 mg/kg LF-2和2 mg/kg LF-6组小鼠脾脏淋巴细胞的LPS刺激指数和ConA刺激指数显着升高(p<0.05)。LFP-20及改良肽LF-2、LF-6对E.coli K88感染小鼠免疫功能影响的研究结果表明：与正常对照组相比,E.coli组小鼠的胸腺指数显着降低,2 mg/kg的LF-2、LF-6和8 mg/kg的LFP-20、LF-2均有使感染小鼠胸腺指数升高的趋势(p>0.05)。与正常对照组相比,E.coli组小鼠的外周血淋巴细胞百分率有所增加(p>0.05)；与E.coli组相比,六个抗菌肽组的外周血淋巴细胞百分率均显着降低(p<0.05)。与正常对照组相比,E.coli组小鼠的外周血CD3+CD8+细胞的比例显着降低,CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的比值显着升高,NK细胞的比例显着降低；2 mg/kg的LFP-20、LF-6和8 mg/kg的LFP-20、LF-2使小鼠外周血CD3+CD8+细胞的比例显着高于E.coli组(p<0.05)；与E.coli组小鼠相比,8mg/kg LF-2显着提高了小鼠外周血中NK细胞的比例(p<0.05)。E. coli组小鼠脾脏淋巴细胞的LPS刺激指数和ConA刺激指数均显着高于正常对照组(p<0.05)；六个抗菌肽组的LPS刺激指数和ConA刺激指数均显着低于E.coli组；与正常对照组相比,2 mg/kg和8 mg/kg LFP-20组小鼠脾脏淋巴细胞的LPS刺激指数显着升高(p<0.05)；2 mg/kgLFP-20组ConA刺激指数显着升高(p<0.05)。与正常对照组相比,E.coli组小鼠脾细胞的抗体生成能力没有显着变化,但2 mg/kg的叁种抗菌肽和8 mg/kg的LF-2、LF-6使小鼠脾细胞的抗体生成能力显着提高(p<0.05)。与正常对照组相比,E. coli组细胞因子IL-1、IL-10、TNF-α和趋化因子MCP-1、MIP-1α基因表达水平显著升高(p<0.05)；LF-2降低了由E.coli感染导致的MCP-1、MIP-1α、IL-10基因表达水平升高(p<0.05),显着增加了IFN-γ基因表达水平(p<0.05)；与E. coli组相比,2 mg/kg LF-6显着降低由E. coli感染导致的MCP-1、MIP-1α、和IL-10基因表达水平；8 mg/kg LF-6显着降低了由E. coli感染导致的MCP-1、MIP-1α、IL-1、IL-10和TNF-α基因表达水平(p<0.05)。5.猪乳铁蛋白肽改良肽的重组表达研究改良抗菌肽LF-6在大肠杆菌中的重组表达。根据大肠杆菌密码子偏好性及改良肽LF-6的氨基酸序列设计引物,并通过套迭PCR成功扩增目的基因EK-LF-6及TEV-LF-6,将目的基因构建至表达载体pET32a,成功构建了大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)pLysS-pET32a-TEV-LF-6和BL21(DE3)pLysS- pET32a- EK-LF-6,经诱导表达和SDS-PAGE分析,融合蛋白Trx-EK- LF-6及Trx-TEV- LF-6均有明显表达；Bradford法蛋白定量、凝胶条带分析及计算获得可溶性融合蛋白Trx-TEV-LF-6及Trx-EK-LF-6的表达量分别为40.60 mg/L和42.13 mg/L；两种融合蛋白经蛋白酶切割后,目标抗菌肽LF-6的理论表达量分别为5.59 mg/L和6.13 mg/L。对两种融合蛋白进行分离纯化及TEV酶和EK酶切割相应融合蛋白,结果表明TEV酶的切割效率高于EK酶。对切割产物进行冷冻干燥浓缩并使用琼脂糖孔穴扩散法检测其活性,结果表明TEV酶切割融合蛋白的产物对E.coli K88及ATCC25922具有一定抑菌活性,且对E.coli K88的抗菌活性强于对大肠杆菌ATCC25922,该结果表明经过TEV酶切割后残留在LF-6 N端的Gly对LF-6活性的影响较小。改良抗菌肽LF-6在巴斯德毕赤酵母中的重组表达。根据酵母偏爱密码子及LF-6氨基酸序列设计引物,通过套迭PCR扩增获得目的基因后,将其构建至诱导型分泌表达载体pPICZaA,重组质粒PICZa-LF-6转化蛋白酶缺陷型酵母菌株SMD1168构建重组菌株SMD1168-pPICZaA-LF-6,经甲醇诱导重组菌株表达目标抗菌肽LF-6；取发酵上清进行Tricine-SDS-PAGE检测结果表明,重组菌株诱导6天后目的肽LF-6表达量达较高水平；对发酵液上清进行浓缩后,Bradford法测定LF-6的表达量为20 mg/L。琼脂糖孔穴扩散法对抑菌活性的检测结果表明重组表达的LF-6对E.coli K88具有一定的抑菌活性。综上所述,本论文通过对LFP-20的分子改良,获得了对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌抗菌活性明显提高且在一定浓度范围内对红细胞溶血率和外周血单核细胞毒性没有显着增强的改良肽LF-2和LF-6；与模板肽LFP-20相比,改良肽LF-2和LF-6对细菌具有更强的破膜作用机制,并可以通过体内抑菌作用增强小鼠抵抗E. coli K88感染能力,改善由于感染引起的肠道有益菌双歧杆菌和乳酸菌数量降低：改良肽LF-2和LF-6还能够通过改善小鼠胸腺指数、外周血中B细胞比例、刺激脾脏淋巴细胞转化等发挥免疫调节功能,控制由于E.coli感染导致的动物模型免疫指标异常变化：此外,还利用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统成功表达了改良肽LF-6,理论表达量分别为5.59 mg/L和20mg/L,表达产物对E. coli具有明显抑菌活性。
李秋玲[3]2014年在《重组人乳铁蛋白奶粉对仔猪免疫应答和骨形成的影响》文中认为乳铁蛋白(lactoferrin,LF)的分子量是80kDa,它是一种铁结合性的糖蛋白,是转铁家族成员之一,具有调节免疫、铁离子平衡、调节肠道菌群、骨形成以及抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学功能。LF作为功能性食品、保健品和药品具有广阔的应用和开发前景。LF主要由中性粒细胞和外分泌腺的上皮细胞分泌,其含量在人类母乳中为1-5mg/mL,而在婴儿奶粉中只有0.02-0.2mg/mL.本实验室利用含有人LF基因的BAC成功获得了能够生产重组人乳铁蛋白(rhLF)的转基因克隆奶牛,乳中rhLF的表达量高达3.4g/L。而该hLF对婴儿免疫和骨发育的影响尚不清楚。本研究以新生仔猪作为婴儿的体内实验模型,研究含有该rhLF的奶粉对新生儿免疫应答和骨形成的影响及作用机制。将18头出生7天的长白公猪分为3组进行rhLF转基因奶粉30天饲喂实验,OM组饲喂普通奶粉作为对照,MM组饲喂普通奶粉和rhLF奶粉1：1混合的奶粉,LFM组饲喂rhLF奶粉。饲喂过程中每天观察记录自然条件下仔猪发生腹泻的情况。饲喂实验结束后对仔猪进行宰杀,采集各种样品进行后续分析,包括仔猪是否出现过敏反应、免疫应答和骨骼发育情况。腹泻率统计结果显示,LFM组仔猪腹泻率显着低于OM对照组(P<0.05)。利用ELISA法测定血浆、空肠、回肠和结肠IgE含量,结果未发现IgE升高。肠道组胺分析结果显示,3组仔猪空肠、回肠和结肠中组胺释放无显着差异(P>0.05),另外,对IgE受(?)FCER1B和FCER1G mRNA进行荧光定量分析,均未发现仔猪出现过敏反应。对血浆、脾脏和肠道中IgG、IgA和IgM进行分析,发现LFM组仔猪血浆(P<0.05)和结肠中IgG(P<0.01)以及血浆中IgA(P<0.01)的含量显着高于OM对照组。对血浆和脾脏中细胞因子测定结果显示,Th1/Th2细胞免疫平衡未发生偏移。在血浆中Thl型细胞因子IL-12和Th2型细胞因子IL-10显着升高(P<0.01)。在脾脏中Thl型细胞因子IL-2(P<0.01)和Th2型细胞因子IL-5显着升高(P<0.05),说明Thl和Th2细胞应答增强。对肠道免疫应答分析结果显示,在回肠中LFM组仔猪绒毛高度以及绒毛高度/隐窝深度比值显着升高(P<0.01),而隐窝深度显着降低(P<0.01)。对肠道免疫相关基因进行mRNA荧光定量分析,发现LFM组仔猪回肠中TLR2mRNA水平升高(P<0.05),结肠中NF-κBp65mRNA水平升高(P<0.05)。在骨形成方面,LFM组仔猪血清钙含量、骨密度(BMD)、骨矿物盐含量(BMC)和骨强度比OM对照组分别提高了20.33%、14.81%、28.57%和38.39%。另外,体外细胞实验结果表明,rhLF在200和400μg/mL的浓度下能促进成骨细胞的增殖和分化,并且rhLF在200μg/mL时能使ERK1/2的磷酸化增加。以上体内和体外实验结果表明,rhLF对仔猪免疫应答和骨骼发育起到了促进作用。
王小丹[4]2011年在《转基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白食用安全性和功能研究》文中研究表明目的研究转人乳铁蛋白基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的食用安全性,以及其改善生长发育功能、体外抑菌作用和改善机体铁营养状况的功能。方法一等同性分析从结构、免疫反应性和生理活性叁方面对rhLf和天然hLf进行等同性分析。结构分析包括分子量测定、N端氨基酸序列分析、糖基化位点确定和二级结构测定；免疫反应性通过Western-Blot进行检测,利用anti-hLf分别与rhLf和天然hLf进行免疫反应,比较二者是否具有相同的免疫反应性；生理活性方面针对rhLf的铁结合和释放能力进行测定。二食用安全性研究1.毒性研究进行生物信息学分析,比较rhLf与已知毒蛋白和抗营养素是否具有同源性；以5g/kg bw/d剂量进行大鼠7天经口毒性实验,以35g/kg bw/d剂量进行小鼠28天喂养实验,评价rhLf短期摄入对实验动物能否产生有害健康影响。2.致敏性研究进行生物信息学分析,比较rhLf与已知致敏蛋白是否具有同源性；进行rhLf与天然hLf在模拟胃/肠液和小型猪生理胃/肠液中的消化实验,分析rhLf是否具有消化抗性,并比较rhLf与天然hLf的消化稳定性是否一致。叁功能研究1.改善生长发育功能设低、中、高叁个rhLf剂量组(0.375、0.75和2.25g/kg bw/d)和一个水对照组,灌胃给予受试物,周期为8周。检测指标包括动物体重、身长、摄食量和食物利用率。2.体外抑菌功能利用体外培养方法,分别在大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的培养体系中加入不同浓度rhLf,测定上述细菌在不同时间点的生长情况。3.改善铁营养状况功能建立贫血模型：雌性断乳Wistar大鼠喂饲低铁饲料30d后,选择Hb低于100/L的动物进入恢复实验。贫血恢复实验：按Hb和体重将大鼠随机分为A-F6组,依次为模型对照组,0.375、0.75和2.25g/kg bw rhLf组,0.011g/kg bw乳酸亚铁组,以及0.011g/kg bw乳酸亚铁联合0.375g/kg bw rhLf组,每组12只,灌胃给予受试物,恢复周期为8周。检测指标包括动物一般情况、体重变化、铁相关血液学指标、FEP、SI、TIBC、TS、SF、SC和SZ。结果一等同性分析rhLf与天然hLf分子量相近,N端氨基酸序列相同,糖基化位点一致,二级结构相似,具有相同的免疫反应性,且均具有铁结合与释放能力。二食用安全性研究1.毒性研究1.1生物信息学分析在UniProt数据库中利用BLAST程序共查找出530种与rhLf具有序列同源性的蛋白,全部为转铁蛋白家族(transferrin family)成员。1.2大鼠7天经口毒性实验经口给予5g/kg bw/d rhLf连续7天,动物体重显着降低。以3.3g/kg bw/d蛋白粉重复进行大鼠7天经口毒性实验出现相同结果,提示大量灌胃给予蛋白质的经口毒性实验方法不能正确评价受试物的毒性。停止处理因素2周后,rhLf组和蛋白粉组体重、摄食量和食物利用率与对照组均无差异。rhLf组脏器重量、血液学、血生化以及组织病理学检查结果均未显示不良影响。1.3小鼠28天喂养实验以35g/kg bw/d剂量喂养小鼠28天,rhLf组雄性动物第4周体重显着高于酪蛋白组,PLT、RDW、TP和ALB增高,睾丸相对重量降低。雌性动物ALT、TRIG和肾脏相对重量增高,TP和CRE降低。其他指标在两组间均无差异,组织病理学检查未显示不良影响。2.致敏性研究rhLf与牛乳转铁蛋白、鸡卵转铁蛋白和豚草属花粉变应原Amb p 5叁种已知致敏原具有序列或结构同源性。rhLf与hLf在模拟胃／肠液和生理胃／肠液中的消化稳定性一致,在胃液中易被消化,而在肠液中60min内不能被消化。叁功能研究1.改善生长发育功能2.25g/kg bw/d rhLf组体重、身长和食物利用率均显着优于对照组,0.375和0.75g/kg bw/d rhLf组较对照组有轻度改善。2.体外抑菌功能rhLf在体外对大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长均具有抑制作用,且在一定范围内rhLf浓度越大,抑制作用越强。不同菌株对rhLf敏感性不同,在相同条件下,单增李斯特菌对rhLf最为敏感。3.改善铁营养状况功能乳酸亚铁组和乳酸亚铁联合低剂量rhLf组动物一般情况较模型对照组明显改善,体重、RBC、Hb、SI、TS和SF显着增加,FEP、TIBC和SZ显着降低；2.25g/kg rhLf组上述指标较模型对照组同样显着改善,但程度低于乳酸亚铁组和乳酸亚铁联合rhLf组；0.75g/kg rhLf组RBC显着增加,FEP和SZ降低；0.375g/kg rhLf组仅SZ显着低于对照组,其他指标无差异。乳酸亚铁组和乳酸亚铁联合rhLf组之间比较时,后者SI、TS和SF显着高于前者,TIBC低于前者。结论一rhLf与天然hLf在结构、免疫反应性和生理活性叁方面均具有等同性。二生物信息学研究证实,rhLf与已知毒蛋白或抗营养素不具有同源性；与牛乳转铁蛋白、鸡卵转铁蛋白和豚草属花粉变应原Amb p 5叁种已知致敏原具有同源性,但发生交叉致敏的可能性较小叁首次采用蛋白替代法以高达35g/kg bw/d的剂量进行了rhLf28天喂养实验,结果显示对小鼠无毒性作用,证明rhLf具有良好的食用安全性。四rhLf与hLf在模拟胃/肠液和小型猪生理胃/肠液中的消化稳定性一致,均不具有消化抗性。五首次证实转基因牛乳腺生物反应器表达的rhLf具有改善大鼠生长发育、体外抑制多种细菌生长和改善缺铁性贫血大鼠铁营养状况的功能。
文胜[5]2009年在《乳铁蛋白的仿生亲和纯化研究》文中指出人乳铁蛋白是一种分子质量为70～80 kD的糖蛋白,属转铁蛋白家族成员,具有广谱抗菌,抗病毒,抗肿瘤,调节机体免疫反应等多种生物活性,在功能营养食品和医疗保健等方面具有广阔的应用前景。过去,因人乳铁蛋白来源有限,严重限制了其商业开发。随着动物转基因技术的发展,中国农业大学李宁教授研究团队构建了牛乳腺生物反应器,在牛乳腺中高量表达重组人乳铁蛋白,牛乳中人乳铁蛋白浓度达2.529±0.212 mg/mL～3.429±0.417 mg/mL,有可能实现重组人乳铁蛋白在牛乳腺中的规模生产。本课题研究目的是针对乳铁蛋白研究开发仿生亲和配体,仿生亲和分离材料以及建立从转基因牛乳中大规模纯化重组人乳铁蛋白的工艺。本研究首先设计合成了一个仿生亲和分离材料库,含322中不同结构的配体;利用筛选方法得到了特异性结合重组人乳铁蛋白的β-丙氨酸亲和配体,其结构为β-丙氨酸经叁氯叁嗪间隔臂共价偶联于氨基活化的Sepharose-6B上。通过对固定化β-丙氨酸纯化重组人乳铁蛋白的pH和离子强度条件进行优化,确定介质对重组人乳铁蛋白的最佳结合条件为:50 mM Tris-HCl/0.1 M NaCl, pH 7.0;最佳洗脱条件为:0.1 M Gly-HCl, pH 2.4。纯化得到的重组人乳铁蛋白纯度>95%,回收率达81.6%,固定化β-丙氨酸对重组人乳铁蛋白的最大吸附量达65.6mg/g干介质,并且能够耐受NaOH溶液的清洗与再生。经MALDI-TOF鉴定,所纯化的蛋白即为重组人乳铁蛋白。N端测序结果表明,重组人乳铁蛋白N端氨基酸序列为GRRRRSVQW,与天然人乳铁蛋白相同。对重组人乳铁蛋白最重要的两个生物学活性进行了鉴定。在体外经铁溶液处理后,重组与天然人乳铁蛋白均能结合铁离子,而且这种铁结合能力与环境中的pH直接相关。当pH降至4.5时,铁离子开始从蛋白中释放出来。在pH 2.0时,蛋白几乎全部释放掉自身结合的铁离子。这表明重组人乳铁蛋白具有与天然人乳铁蛋白类似的铁结合与释放能力。重组人乳铁蛋白具有抑菌活性,当大肠杆菌菌浓度为1×105CFU/mL时,加入终浓度为5 mg/mL的重组人乳铁蛋白能明显抑制细菌的生长。除重组人乳铁蛋白外,固定化β-丙氨酸可从人乳,天然牛乳和羊乳中纯化乳铁蛋白,表明该介质可用于不同种属乳铁蛋白的亲和纯化。以上结果表明,利用固定化β-丙氨酸亲和介质可以大规模纯化具有天然生物学活性的重组人乳铁蛋白,并且可以应用于从人乳,天然牛乳和羊乳等乳汁中纯化不同种属的乳铁蛋白。
白雪晶[6]2010年在《牛乳铁蛋白衍生抗菌片段分子设计与构效关系》文中指出乳铁蛋白是一种天然非血红素铁结合糖蛋白,在哺乳动物非特异性免疫和获得性免疫反应中发挥重要作用。本研究针对连接区域(334-344)结构与功能特点,开展牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA、BLfB、BLfN和BLf的分子设计;比较分析了重组蛋白rBLfA、rBLfB、rBLfN和rBLf的Fe3+结合能力和抗菌功能,结果显示牛乳铁蛋白N-叶与C-叶之间α-螺旋连接区域能促进N-叶Fe3+结合结构及功能稳定性,并且为抗菌活性部位;对rBLfA毕赤酵母细胞高密度发酵和代谢工程研究进行了初步探索。主要结果如下:1.利用分子设计方法确定了目标分子BLfA (N-叶和连接区域)及对照组分子BLfB (不完整N-叶)、BLfN (N-叶)和BLf(N-叶、连接区域和C-叶)的一级序列。通过对牛乳铁蛋白分子基本性质的分析和预测,特别是N-叶与C-叶连接区域的结构与功能的分析确立了牛乳铁蛋白衍生抗菌片段的分子设计原则,确定了目标分子BLfA (1-344)及对照组分子BLfB (1-284)、BLfN (1-333)和BLf(1-689)的氨基酸残基序列;利用分子生物学软件对上述分子进行叁维结构模拟和物理化学参数计算及对比,结果显示BLfA基本保持了其在天然牛乳铁蛋白中的原有结构,且BLfA分子表面阳离子特性强于BLfB、BLfN和BLf,具有较强的潜在抗菌活性。2.重组表达了牛乳铁蛋白衍生抗菌分子BLfA、BLfB、BLfN和BLf。SDS-PAGE和Western Blotting鉴定显示,BLfA、BLfB和BLf在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,摇瓶水平表达量分别为56 mg/L、41 mg/L和96 mg/L。BLfA、BLfB、BLfN和BLf均在毕赤酵母摇瓶水平得到分泌表达,分别在甲醇诱导30、48、72和72 h后达摇瓶水平最大表达量,依次为485 mg/L、56 mg/L、106 mg/L和88 mg/L。rBLfA、rBLfB、rBLfN和rBLf经Ni-NTA His-Bind树脂纯化后纯度分别为93.8%,92.0%,94.5%和91.2%。3.进行了重组蛋白Fe3+结合及依赖pH的Fe3+释放性质研究,结果表明乳铁蛋白连接区域对N-叶铁离子结合结构的稳定性具有促进作用。Fe3+结合能力nBLf (OD465 nm 0.482)﹥rBLf (0.431)﹥rBLfA (0.330)﹥rBLfN (0.322)﹥rBLfB (0.002),这表明N-叶与C-叶连接区域(334-344)的结构能稳定N-叶的Fe3+结合结构;rBLf与nBLf依赖pH的Fe3+释放性质基本一致,均可在pH 5.5-3.0范围内释放Fe3+,而rBLfA释放Fe3+的pH范围(pH 7.0-3.5)比rBLfN (pH 7.0-4.0)略宽,表明非刚性与刚性的乳铁蛋白连接区结构均可能起到稳定N-叶铁离子结合结构的作用。4.开展了重组蛋白抗金黄色葡萄球菌实验,结果表明牛乳铁蛋白N-叶与C-叶之间的连接区域对其抗菌功能具有促进作用。实验结果显示rBLfA、rBLfN和rBLf均具有抑制S. aureus生长的功能,MIC分别为6.5μmol/L、12. 5μmol/L和25μmol/L,rBLfA抑菌能力最强。rBLfA抑制S. aureus生长活性的增强可能由于其在分子结构上比rBLN多了连接区域α-螺旋,该区域富集的表面净正电荷可能与S. aureus细胞表面带负电荷的分子通过静电相互作用结合,引起细胞裂解,从而起到抑菌和杀菌的作用。5.rBLfA和rBLfN细胞高密度发酵水平的产量分别为499 mg/L和402 mg/L,利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达,使rBLfA发酵罐水平的表达量提高了23%,达613 mg/L。
汪以真[7]2004年在《猪乳铁蛋白基因克隆、表达及其产物对断奶仔猪生长、免疫和抗菌肽基因表达影响的研究》文中提出本研究运用RT-PCR技术，从泌乳母猪乳腺组织中克隆了猪乳铁蛋白(PLF)基因，采用杆状病毒-昆虫表达系统在家蚕蛹中表达了重组猪乳铁蛋白(rPLF)，研究了表达产物rPLF的体外抗菌效果、rPLF对断奶仔猪生长性能、免疫功能、肠道菌群和小肠形态以及抗菌肽基因表达的影响。主要研究结果如下： 1．采用RT-PCR技术，先从泌乳15天的大约克母猪乳腺组织中分两片段克隆出PLF的基因，然后再通过两片段拼接的方法克隆出全长PLF基因，电泳分析显示，其条带分子量大小与理论分子量(2115bp)相符，测序结果表明，其核苷酸序列与Genebank报道的目的基因(登录号：L77887)的同源性达99％，证实已正确克隆PLF目的基因。 2．构建了PLF基因的重组病毒转移载体pBlueBacHisC-PLF，通过同源重组的方法构建了PLF基因重组杆状病毒，在Sf9细胞中繁殖，并感染家蚕蛹；SDS-PAGE检测结果表明，蚕蛹细胞裂解产物中有一分子量为80kD左右的特异性条带，进一步进行western blot检测，在特异性条带对应位置也有相应条带，且特异性条带的分子量也在80kD左右，结果显示，PLF基因在家蚕蛹内得到了表达。 3．通过Time-kill方法，研究了含rPLF蚕蛹和经胃蛋白酶水解的含rPLF蚕蛹的体外1、2、4、8、16和24小时的抗菌效果。研究表明，空白对照蚕蛹在4小时没有表现出抗菌活性，直到16小时才表现出一定的抗菌活性；而含rPLF蚕蛹从2小时就表现出了抗菌肽活性，4小时、8小时、16小时和24小时的抗菌活性明显高于空白对照蚕蛹(P<0.01)。空白对照蚕蛹经胃蛋白酶水解后，与未被水解的空白对照蚕蛹相比，两者抗菌活性没有发生明显差异：但含rPLF蚕蛹经胃蛋白酶水解后。其抗菌活性比未被酶解的含rPLF蚕蛹有显着提高(P<0.01)。 4．通过90头28日龄断奶的平均体重在6.13kg左右杜长嘉仔猪(公母各半)30天的饲养试验，结果表明，饲粮中添加rPLF比对照组(不添加rPLF)腹泻率降低了24.85％(P<0.01)，日增重提高了34.04(P<0.01)，料重比降低了12.83％(P<0.05)；通过90头28日龄断奶的平均体重在7.05kg左右的杜长大仔猪(公母各半)断奶后1-15天(断奶前期)和16-30天(断奶后期)的分阶段饲养试验，结果表明，在断奶前期，饲粮中添加rPLF比对照组腹泻率降低了66.25％(P<0.01)，日增重提高了41.84％(P<0.01)，料重比降低了14.78％(P<0.05)；在断奶后1-30天，饲粮中添加rPLF比对照组腹泻率降低丁75.20％(P<0.01)，日增重提高了15.19％(P>0.05)，料重比降低了12.74％(P>0.05)；从本研究结果揭示，rPLF有较好的抗断奶仔猪腹泻效果，在提高浙江大学博士学位论文:中英文摘要 日增重和降低料重比的效果上，在断奶前期的效果优于断奶后期。5.杜长嘉断奶仔猪饲养30天后，各处理组取3头体重相近小母猪进行屠宰，取血 样分离血清，进行T一淋巴细胞转化实验、免疫球蛋白测定、及IL一1和IL一2以及 血清铁和总铁结合力的分析;取脾脏，进行细胞培养，研究脾脏淋巴细胞在PHA 和ConA诱导下的增殖率。结果表明，与对照组相比，rPLF提高了仔猪血清中 T一淋巴细胞转化率47.19%(P<0 .01);分别提高了由PHA和ConA诱导的脾淋 巴细胞增殖率116.90%(P<0 .01)和89.08%(P<0 .01);提高了血清中IgG水平 10.99%(尸<0.05)，IgA水平20.00%(尸<0.05)，IgM水平22.64%(尸<0.05);提 高了血清中IL一2的水平46.64%(尸<0.01)。分别在杜长大断奶仔猪饲养第15天 和第30天，各处理组取3头体重相近小母猪进行屠宰，取血样和脾脏，进行相 关指标测定与分析，研究结果表明，rPLF均显着提高了杜长大仔猪血清中T一淋 巴细胞转化率(P<0，01)、脾淋巴细胞增掖率(P<0 .01)、IgG和IgA水平(尸<0.05) 以及IL一2的水平(P<0.05)。:PLF都显着提高了仔猪血清中铁的水平(P<0.05)。6.杜长大断奶仔猪饲养第15天后，各处理组取3头体重相近的小母猪进行屠宰， 取结肠内容物，进行肠道菌群分析，取十二指肠和空肠，制电镜切片，观察小肠 绒毛隐窝的变化。肠道菌群结果表明，在对致病菌影响上，饲粮添加rPLF减少 大肠杆菌的生长34.6%(只0.05)，减少沙门氏菌的生长57.4%(只0.05);在对有 益菌的影响上，添加rPLF可以增加乳酸菌的数量72.1%(只0.05)，增加双歧 杆菌的数量143%(只0.01)。电镜切片结果分析表明，与对照组相比，rPLF组明 显改善了仔猪十二指肠和空肠的绒毛高度和密度。7.杜长大断奶仔猪在饲养第15和第30天后，各处理组分别取3头体重相近的小母 猪进行屠宰，取骨髓，克隆抗菌肤pR一39和Protegrin一l基因，采用RT一PeR法 研究饲粮添加:PLF对断奶仔猪骨髓抗菌肤基因表达的影响。研究结果表明，与 对照组比，在28日龄断奶的杜长大仔猪断奶后卜巧天饲喂rPLF均显着提高仔 猪骨髓抗菌肤pR一39和Protegrin一1的基因表达，分别提高了143%(只0.01) 和217%(只0.01)。对断奶16一 30天仔猪的抗菌肤PR一39和Protegrin一1的基因 表达也有增强的趋势，但没有产生显着水平(乃0.05)。结果揭示rPLF促进断奶 仔猪非特异性免疫因子抗菌肚发育上存在阶段性差异，在断奶前期优于断奶后 期。
杨红亚[8]2013年在《益生性乳酸菌的分离鉴定及表达猪乳铁蛋白基因重组乳酸菌的构建》文中认为乳铁蛋白肽（Lactoferricin，Lfcin）是乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）经胃蛋白酶水解，从N-端解离下来的一段氨基酸残基，具有乳铁蛋白除转铁功能之外几乎全部的生物学活性，如广谱抗菌、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等。但是Lfcin在动物体内含量极微，提取费用昂贵，无法实现大规模生产，因此开展Lfcin基因工程研究具有重要意义。目前对乳铁蛋白肽的研究多集中在原核表达上，但是由于LF及Lfcin对细菌的抗性作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物学活性的LF或Lfcin，而乳铁蛋白对于铁需求低的乳酸菌没有抑制作用，本研究自主设计并构建大肠杆菌-乳酸菌双复制子穿梭型猪乳铁蛋白N-端亚基分泌表达载体，以具有自主知识产权的乳酸菌为呈递系统，使目的蛋白得到成功表达。从新疆、黑龙江等地采集各种冻土、野生禽类粪便等样品材料，接种MRS培养基分离具有典型特征的乳酸菌，富集培养后提取乳酸菌的基因组DNA，利用细菌域通用引物扩增16SrDNA序列，连接pMD-18T载体全部进行测序，利用Geneious软件进行细菌的进化树分析，同时，采用法国梅里埃公司API50CHL鉴定试剂盒进行碳水化合物发酵鉴定，筛选出的菌种，进行接种SPF雏鸡的增重试验，每只鸡隔天口服一次，口服菌量大约为6~8*108CFU，每周称重，共6周。根据增重情况筛选出对雏鸡有良好增重作用的乳酸菌2株（4151A1和411-15）；根据益生菌的筛选标准，对2株乳酸菌进行耐酸、耐胆盐、体外抗菌效果评价，最终筛选出4151A1命名为LactobacillussalvariusY1（L.salvariusY1）同时和实验室保存标准菌株L.casei393一起作为本研究的宿主菌。利用本实验室已有条件，自主构建乳糖诱导型表达猪乳铁蛋白N-端亚基的大肠杆菌-乳酸菌双复制子穿梭型分泌表达载体。首先进行双复制子穿梭载体的构建，PCR扩增质粒pMB1的复制子，并与pHE1载体进行克隆连接，得到pHE1-MB1双复制子穿梭载体；然后以乳酸菌质粒pPG612.1为模板扩增其表达盒，与构建的双复制子载体克隆连接得到分泌表达载体pHE1-MB1-612；以pUC59-OPTF为模板扩增出密码子优化的猪乳铁蛋白N-端亚基（OPTF-N），克隆至pHE1-MB1-612上，得到第一个表达猪乳铁蛋白N-端亚基的穿梭型双复制子分泌表达载体pHE1-MB1-612-OPTF-N；再以pHE1-MB1-612-OPTF-N为模板，扩增OPTF-N表达盒（3700bp），克隆至氯霉素抗性双复制子穿梭型载体pGBHC-MB1上，得到第二个表达OPTF-N载体pHC-MB1-612-OPTF-N。将构建完成的2个载体电击转化至自主分离的4151A1和标准菌株L.casei393，得到四株重组乳酸菌，分别命名为r-LactobacillussalvariusY1HC-OPTF-N、r-Lactobacilluscasei393HC-OPTF-N、r-LactobacillussalvariusY1HE1-OPTF-N、r-Lactobacilluscasei393HE1-OPTF-N。将4株重组菌和2株天然菌株接种至乳糖MRS进行乳糖诱导表达，表达产物用免疫斑点实验进行检测，重组乳酸菌发生特异性显色反应，表明目的蛋白在4151A1和L.casei393中成功表达。
王燕[9]2007年在《PMAP、Prophenin等猪抗菌肽基因表达的差异及乳铁蛋白对其表达的影响》文中提出PMAP、Prophenin等猪抗菌肽基因表达的差异及乳铁蛋白对其表达的影响本研究分别以出生、20 kg、40 kg、60 kg和90 kg体重的杜长大猪和28日龄断奶仔猪为试验对象,以半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR法为检测手段,研究不同生长阶段猪骨髓抗菌肽PMAP、Prophenin、PR-39和Protegrin-1基因表达的差异,并通过体内和体外试验研究乳铁蛋白对其基因表达的影响。主要研究结果如下：1、根据已报道的猪PMAP、Prophenin、PR-39和Protegrin-1基因序列,设计其引物,以1nRNA为模板,经反转录和PCR,克隆得到了相应的基因片断。测序结果表明,克隆得到的PMAP、Prophenin、PR-39和Protegrin-1基因的序列与Genbank登录的相应基因片断(登录号分别为L39641、X89202、L23825和X79868)同源性分别为98%、98%、100%和99%。以抗菌肽基因的成功克隆为基础,本试验构建了优化的半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR法,用于抗菌肽基因nRNA表达量的测定。2、选取相同胎次、出生体重相近的出生、20 kg、40 kg、60 kg和90 kg体重杜长大猪各3头,屠宰后取骨髓,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR法,检测抗菌肽基因在不同生长阶段时表达的差异。半定量和实时荧光定量PCR试验结果表明,PMAP、Prophenin、PR-39和Protegrin-1的表达量随着体重的增加而发生变化,且四种抗菌肽表达量的变化趋势基本一致。在出生到20 kg其表达量呈现逐渐增加趋势；在20 kg到40 kg其表达量呈现下降趋势；在40 kg到60 kg其表达量发生显着增加(P<0.05)；其后60 kg到90 kg,抗菌肽的表达又有所下降。3、选取90头平均体重9.7 kg左右的杜长大仔猪按饲养试验要求随机分成3组,每组3个重复,分别饲喂基础日粮、添加0.125%和0.25%乳铁蛋白日粮,饲养试验结束后,每个处理组取3头体重相近的猪屠宰,取骨髓,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR法,检测乳铁蛋白对抗菌肽基因表达的影响。半定量RT-PCR分析结果表明,与对照组相比,日粮中添加0.125%和0.25%乳铁蛋白使PMAP基因的表达量分别提高了111.1%(P<0.01)和70.3%(P<0.05)；Prophenin基因的表达量分别提高了62.9%(P>0.05)和67.5%(P>0.05)；PR-39基因的表达量分别提高了63.09%(P<0.05)和22.91%(P>0.05)；Protegrin-1基因的表达量分别提高了212.6%(P<0.05)和106.3%(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果分析表明,与对照组相比,日粮中添加0.125%和0.25%乳铁蛋白使PMAP基因的表达量分别提高了2.22倍和1.97倍；Prophenin基因的表达量分别提高了1.99倍和1.89倍。揭示了在仔猪日粮中添加乳铁蛋白可以提高抗菌肽基因的表达量。4、骨髓细胞分离培养后与不同浓度乳铁蛋白(10、100和1000μg/ml)一起分别培养3,6,12,24 h,从各个时段分别处理组的骨髓细胞中提取总RNA,采用半定量RT-PCR法,检验乳铁蛋白对抗菌肽基因表达的影响。试验结果表明：不同浓度的乳铁蛋白处理在3h和6h时,抗菌肽基因表达增加,在12h和24 h时,其表达量有所下降。不同浓度的乳铁蛋白对其影响亦不相同,其中在6h时,10和100μg/ml乳铁蛋白组PMAP和Prophenin的基因表达量显着增加(P<0.05)。在24 h时,10μg/mlLF可以显着地降低PMAP的基因表达(P<0.05)；100和1000μg/ml乳铁蛋白组Prophenin的基因表达量显着降低(P<0.05)。在3h时,100和1000μg/ml乳铁蛋白组PR-39的基因表达显着增加(P<0.05)；在24 h时,10和100μg/ml乳铁蛋白组PR-39的基因表达量显着降低(P<0.05)。上述结果揭示：抗菌肽基因的表达随着猪体重的增加呈现一定的生物学发育规律；通过体内饲养试验,表明乳铁蛋白可以提高抗菌肽基因的表达；体外细胞培养试验,也表明添加不同浓度的乳铁蛋白可以提高抗菌肽基因的表达,且不同的培养时间对其影响亦有不同。
王雷[10]2009年在《重组人乳铁蛋白对口腔鳞癌Tca8113细胞的抑制作用及其机制研究》文中提出口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是人类十大恶性肿瘤之一,占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上,长期以来口腔鳞状细胞癌的治疗一直是肿瘤治疗领域研究的重要课题,迫切需要肿瘤治疗的新方式。在抑制肿瘤的发生、发展方面,应用天然存在的化合物乳铁蛋白(lactoferrin,LF)进行癌症的化学预防和治疗逐渐成为重要的方法。目前,国内关于乳铁蛋白抗肿瘤作用的研究还未见报道,本研究在吉林省科技发展计划项目(编号:200705346)的资助下,通过一系列体外实验,研究了重组人乳铁蛋白(Recombinate human lactoferrin,rhLF)对体外培养的口腔鳞癌Tca8113细胞的抑制作用,并且为了更好的研究rhLF介导的抗口腔鳞癌细胞的活性,观察了rhLF对细胞周期、周期调控因子、促炎症反应细胞因子、血管生成因子的影响。结果发现rhLF在体外可以直接抑制肿瘤细胞的生长;rhLF在体外抗肿瘤活性的机制为诱导肿瘤细胞周期抑制,减少肿瘤细胞释放的促炎症反应细胞因子和血管生成因子。表明直接抑制细胞生长是乳铁蛋白抑制癌细胞生长的机制之一,乳铁蛋白可以通过多种途径发挥抗肿瘤作用,达到预防和治疗肿瘤的目的。本研究的创新点在于比较系统地研究了重组人乳铁蛋白在口腔癌治疗方面的作用,初步探讨了rhLF在体外对癌细胞的抑制作用,并利用FCM、Westernblot、ELISA、免疫组化等方法研究了rhLF对口腔鳞癌Tca8113细胞细胞周期、细胞因子等表达的影响,全面系统地评价了rhLF在体外抑制口腔鳞癌细胞的作用及机制;提出了rhLF可以通过直接抑制生血管因子的生成来减少肿瘤相关血管的发生进而抑制肿瘤细胞的生长;为今后进一步的动物实验和临床实验提供了依据,为口腔鳞癌的化学药物治疗提供新的思路和理论基础,也为其他恶性肿瘤的治疗提供参考。
参考文献：
[1]. 天然乳铁蛋白和重组乳铁蛋白的体内、体外抗菌效果及机理研究[D]. 王中强. 浙江大学. 2004
[2]. 猪乳铁蛋白肽的分子改良及改良肽的作用机制、生物学功能和重组表达研究[D]. 韩菲菲. 浙江大学. 2011
[3]. 重组人乳铁蛋白奶粉对仔猪免疫应答和骨形成的影响[D]. 李秋玲. 中国农业大学. 2014
[4]. 转基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白食用安全性和功能研究[D]. 王小丹. 中国疾病预防控制中心. 2011
[5]. 乳铁蛋白的仿生亲和纯化研究[D]. 文胜. 上海交通大学. 2009
[6]. 牛乳铁蛋白衍生抗菌片段分子设计与构效关系[D]. 白雪晶. 中国农业科学院. 2010
[7]. 猪乳铁蛋白基因克隆、表达及其产物对断奶仔猪生长、免疫和抗菌肽基因表达影响的研究[D]. 汪以真. 浙江大学. 2004
[8]. 益生性乳酸菌的分离鉴定及表达猪乳铁蛋白基因重组乳酸菌的构建[D]. 杨红亚. 石河子大学. 2013
[9]. PMAP、Prophenin等猪抗菌肽基因表达的差异及乳铁蛋白对其表达的影响[D]. 王燕. 浙江大学. 2007
[10]. 重组人乳铁蛋白对口腔鳞癌Tca8113细胞的抑制作用及其机制研究[D]. 王雷. 吉林大学. 2009