摘要：为了可以同时对待测样品的基因序列进行检测，在本次有那就中采用多重pcr分析技术来全方位检测转基因大豆食品，为了将增扩结果当中的假阴性结果排除，大豆外援凝集素基因和肌动蛋白基因作为内部对照来针对所有pcr反应效率进行评价。实验结果可以证明，在转基因大豆含量为1.5‰时，仍然可以保持较高的转基因鉴定可靠性，所以这种检测方法敏感度较高。本文针对这种检测方法进行了介绍，其检测程序简单，敏感程度高，需要单一反应就可以对多个目标基因序列进行检测，所以可以用于转基因原料加工进行高精度和高灵敏度检测。
关键词:转基因食品；多重PCR；聚合酶链反应；扩增图谱
转基因作物的出现对我国农产品数量和质量的提高起到了关键的作用，所以近年来转基因作物得到了充分的发展，种植面积不断扩大。在食品市场当中，转基因食品份额越来越高，现在其已经成为人们的重要的食品来源，足以说明现代科学技术对于农业生产所起到的作用，但与此同时，也与很多人认为转基因作物会对人体健康和生态环境造成影响，所以这就要求不断完善相关法律法规，促进立法，出于国际贸易和食品监督法规的需要，转基因食品检测也得到了人们的广泛重视。
Pcr是聚合酶链反应的简称，其用于转基因食品检测是非常普遍的，但是过去的研究主要针对于扩增当合基因，然而随着转基因技术的发展，农作物当中也包含了越来越多的转基因成分，但未必所有成分都经过了政策批准，所以一旦食品当中含有较多的转基因成分， 就需要分别检测每种靶序列，最终才能确定转基因成分，在这个过程中需要进行多次pcr反应，大大提高了检测成本。
多重pcr是针对常规pcr技术进行改进的一个成果，其可以同时对多个基因序列进行检测，可靠性和适应性较强，并且能够大大降低检测成本，所以在本次研究当中，我们可以将简单dna提取方法结合于多重pcr扩增，针对转基因大豆进行检测。
一、材料与方法
（一）材料
（1）样品
转EPSPS基因大豆和未转基因大豆由本室保存。
（2）试剂
TagDNA聚合酶、DNA分子量标准、dNTP及琼脂糖等常规生化试剂购自上海生物工程公司,其它所用化学试剂均为市售分析纯。
（二）主要仪器
LittleGeniusPCR扩增仪，EQ1214暗箱式紫外透射仪，TGL-16C台式离心机等。
（三）大豆的模拟加工处理取一定量的大豆用粉碎机磨成粉状，并装入试管中。然后模拟食品加工条件，121℃下加热30min，备用。
（四）DNA的提取
大豆基因组DNA的提取采取CTAB法和玻璃粉改良法[9]。玻璃粉改良法的操作步骤如下所述：
(1)称取100mg粉末样品，加生理盐水0.5ml混匀，再加入6mol/LNaI溶液0.6ml，充分混匀。
(2)100℃水浴1h裂解细胞，其间每5min混匀一次，并反复冻融两次。
(3)10000×g离心5min，取上清加入20%玻璃粉悬液10μl，混匀后置室温10min，其间每2min混匀一次，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上。
(4)5000×g离心1min，使吸附DNA的玻璃粉沉淀，弃上清。
(5)加入70%乙醇1ml，充分摇匀沉淀，洗涤玻璃粉，同上离心。
(6)用100μlTE缓冲液悬起沉淀，60℃加热15min，其间每隔5min混匀一次，使DNA从玻璃粉上洗脱至溶液，同上离心。
(7)上清转移至新离心管中，得到样品DNA。
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（五）基因组DNA的电泳
按Sambrook的方法进行[10]。取基因组DNA5μl，加入上样缓冲液1μl，用0.8%琼脂糖电泳进行分析，以检查所提取基因组DNA的质量。
（六）寡聚核苷酸引物和多重PCR反应条件
寡聚核苷酸引物由上海生物工程公司合成。引物序列及其特征见表1。PCR扩增反应在LittleGeniusPCR扩增仪上进行，反应体积采用20μl，包括10ng大豆基因组DNA样品、0.2mmol/L引物、反应缓冲液(10mmol/LTris-ClpH8.3，50mmol/LKCl，2mmol/LMgCl2)，dNTP各200μmol/L，TaqDNA聚合酶1U。PCR扩增反应进程如下：94℃4min使DNA变性；再进行40个循环反应，每个循环包括94℃1min，55℃1min，72℃1min；循环结束后72℃延伸5min。PCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，并在紫外灯下拍照。
（七）多重PCR扩增带谱的指纹分析
将电泳结果输入计算机，分析电泳图像上的指纹图谱，进而得出引物对样品DNA的扩增情况(见表1)。
二、结果与分析
（一）CTAB法和玻璃粉改良法的比较
分别应用两种方法抽提大豆基因组DNA，可知CTAB法提取的DNA量较多，但有一定的降解；玻璃粉改良法提取的DNA量较少，但其完整性较好，而且后者操作方便快速，因此确定其为本研究中基因组DNA的提取方法。
（二）多重PCR扩增反应的结果分析
扩增产物中的大豆外源凝集素基因和肌动蛋白基因片段可以作为内部对照以评价PCR反应的效率，从而排除扩增反应出现假阴性的可能。由图可见，转基因大豆除扩增出本身所含的β-肌动蛋白和外源凝集素基因的目标序列外，还扩增出35S启动子、NOS终止子和EPSPS基因上所含的目标序列。而未转基因大豆由于基因组DNA上不含有35S启动子、NOS终止子和EPSPS基因相应的碱基序列，所以不能扩增出这些外源基因片段，而只能扩增出本身所含的β-肌动蛋白和外源凝集素基因片段。由图中还可以看出，在大豆样品中转基因大豆含量仅为0.15%的情况下，利用多重PCR仍能有效地对转基因成份进行准确测定，这表明多重PCR检测手段是非常敏感的。也正是由于PCR扩增反应的固有敏感性，分析结果容易出现假阳性结果，因此在样品前处理和DNA提取过程中，要严防样品交叉污染，这样才能从根本上保证检测结果的准确性。
表1 多重PCR引物序列
三、讨论
现在食品dna提取的方式较多，但大多存在一定的缺陷导致无法推广，例如设备价格高昂、操作难度较高等等，同时pcr扩增也存在一定的局限性。本文所介绍的玻璃粉改良方式具有相当简单的操作性，提取效果较好，省时省力，值得推广。从食品原料当中提取dna的方式也非常多，而实验条件也往往并不稳定，所以也会影响到pcr结果稳定性，结合实际条件我们可以将这些方法组合起来加以优化，建立一套完善的方法，这对于检测结果一致性的保证有着关键作用。
本次试验可以证明，多引物pcr方法可以有效促进转基因食品的鉴定工作，同时也证明了该方法具有可重复性，但是在反应体系内部包括宿主特色基因来对照，所以可以增加模板dna质量，提高pcr扩增效率。 在本次试验中多重pcr展现出了强大的可扩展性，还可以检测出大量未批准转基因成分，这可以节约大量时间和成本。
在本次研究当中，多重pcr系统一方面可以用于转基因大豆检测工作，对于其他转基因作物的定量分析也可以顺利完成。
参考文献：
[1]沈苏南. 一种多重PCR技术在转基因大豆检测中的应用研究[D]. 苏州大学, 2016.
[2]董立明, 李葱葱, 邢珍娟,等. 利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系[J]. 大豆科学, 2016, 35(6):1002-1007.
[3]董立明, 邢珍娟, 李葱葱,等. 应用多重PCR技术快速筛查食品中的转基因成分[J]. 食品与生物技术学报, 2017, 36(1):56-61.
[4]杨梦婕. GeXP-PCR技术多重检测食品转基因成分和HPV分型感染[D]. 暨南大学, 2011.
论文作者:林德义
论文发表刊物:《防护工程》2018年第22期
论文发表时间:2018/11/27
标签：转基因论文; 大豆论文; 玻璃粉论文; 基因论文; 引物论文; 基因组论文; 食品论文; 《防护工程》2018年第22期论文;