崔玉坤[1]1997年在《1. 人hsp90β组成性和丝裂原诱导表达机制的研究 2. 抑癌基因产物p53对人hsp90β转录调控机制的研究》文中研究表明热休克蛋白90(HSP90)细胞生长、发育、分化及应急条件下对细胞的保护等生理过程中起着重要的作用。研究它的表达调控机制不仅有助于对其生理功能的进一步了解，也可为真核基因诱导表达调控机制的研究建立一个良好的模型。我们以前的研究表明人热休克蛋白90β基因受热和丝裂原的双重诱导，其表达调控主要表现在转录水平，并且对两种诱导因素表现出不同的表达动力学形式。为了深入研究hsp90β的转录调控机制，利用DNA重组技术，将含有人hsp90β上游、第一外显子和第一内含子(-1039-1531)的片段进行不同的删切和突变，构建了17个荧光素酶(Luc)报告质粒。利用DEAE-Dextran法转染Jurkat细胞后测定细胞裂解液中的荧光素酶活力，发现以下几种因素在介导该基因高水平的组成性表达中起主要作用 1，由5'上游近端核心启动子序列(-91／+7)所驱动的起始于+1位的较高水平的转录，主要由CAAT盒，GC丰富区和TATA盒来介导； 2，上游的两个不典型的HSE可能在该基因起始于+1位的组成性转录中发挥着不同的作用，-648／634位的较为典型的HSE可能在该基因组成性转录中起到促进作用，而位于-1035／-1011位的不典型的HSE可能在该基因起始于+1位的组成性转录中起到抑制作用； 3，在-340／-173之间存在一个组成性表达的负调控区； 4，第一外显子为起始于+1的转录产物提供了一个AT含量较高的5'非翻译区，因此它对起始于+1位的组成性表达的促进作用可能是是在转译水平； 5，存在于-126位的ATF／CREB位点可能通过与第一内含子中的顺式元件的协同作用，激活起始于第一内含子3'端的转录，这是该基因具有高水平组成性表达的主要原因。然而这一位点对起始于+1位的表达没有显著影响； 6，第一内含子的3'AT富含区也可独立的起始转录。 PHA激活可以诱导T淋巴细胞中hsp 90β的表达，本实验结果表明这种影响可能涉及该基因调控序列中的
高明[2]2016年在《HSP90、SIRT3基因多态性与肝癌发病风险及其在肝癌中表达与侵袭间的相关性研究》文中研究表明目的本课题通过研究HSP90和SIRT3在肝癌细胞中的表达与侵袭以及两者的多态性位点与肝癌发病风险之间的相关性,旨在探讨HSP90与SIRT3二者对肝癌发生发展的影响,并通过此项群体研究发现和鉴定新的肝细胞癌易感基因,试图为肝癌易感人群的疾病预防提供新的标志物,同时也为开发和研制新的肝细胞癌临床用药提供新的靶标,以期对提高肝细胞癌的临床防治效果提供帮助。方法(1)选取在2013年1月-2015年10月期间住院的198例肝癌患者,年龄在35-76岁范围;同时采集198例体检中心健康自愿者作为对照,年龄在33-69岁间。所有受试者均基于自愿并签署知情同意书。对HSP90与SIRT3基因多态性与肝癌患病风险进行相关性分析,此外还对具有饮酒史患者与肝癌易感性进行相关性分析。(2)将p GCSIL-GFP-HSP90重组慢病毒载体转染人肝癌AMMC-7721细胞,荧光定量PCR检测转染后细胞中HSP90 m RNA的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞术检测转染后对各组细胞凋亡的影响;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力;平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力;细胞划痕实验检测细胞的迁移能力;Caspase-3活性检测细胞的凋亡情况。(3)采用RNA干扰的方法沉默人肝癌细胞AMMC-7721中HSP90基因的表达获得HSP90基因沉默细胞株si HSP90-AMMC-7721,分别将野生型WT-HSP90和突变型Mut-HSP90转染si HSP90-AMMC-7721细胞;荧光定量PCR检测各组细胞SIRT3 m RNA表达;western blot法检测各组细胞SIRT3蛋白的表达。结果(1)HSP90 rs8005905与rs3742429基因多态性与肝癌的发生风险之间存在显著相关性;HSP90 rs3742429与具有饮酒史的人群的肝癌发生风险呈显著相关性。(2)上调AMMC-7721细胞中HSP90的表达后使细胞的增殖能力明显增高;流式细胞仪检测结果表明,上调细胞中HSP90的表达后对AMMC-7721细胞凋亡情况并未见显著影响;通过Transwell小室法检测结果表明上调HSP90的表达后视野平均侵袭细胞数量显著增多;平板克隆形成实验结果表明增高AMMC-7721细胞中HSP90的表达时,细胞克隆的形成能力明显上升;细胞划痕实验检测表明上调HSP90后AMMC-7721细胞的迁移性明显增强;caspase-3活性检测结果表明,上调HSP90表达后AMMC-7721细胞中caspase-3活性并未受到显著影响。(3)用荧光定量PCR以及western blot法分别对转染后各组细胞中SIRT3蛋白的表达情况进行检测,结果表明野生型HSP90转染后si HSP90-AMMC-772细胞中SIRT3m RNA和相应蛋白的表达明显降低;突变型HSP90转染后si HSP90-AMMC-7721细胞中SIRT3 m RNA和相应蛋白的表达无明显变化。结论HSP90基因多态性以及患者是否有饮酒史与肝癌的发生之间存在密切联系,且HSP90对肝癌细胞增殖、侵袭以及转移过程的促进作用可能是通过抑制SIRT3的表达实现的。
张勇[3]2004年在《Jurkat细胞hsp90基因染色质水平表达调控研究》文中研究说明热休克蛋白家族成员中的分子量为90kD的热休克蛋白(Hsp90)是真核细胞中最丰富的蛋白质之一。Hsp90能使在热休克等应激反应中积累的错误折叠蛋白重新折叠，并可促进已变性的蛋白质降解。Hsp90还参与激素受体、某些转录因子、信号途径和翻译起始阶段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞内转运和活性调节。因此Hsp90在真核细胞中有着广泛而重要的功能，其基因表达调控研究具有重要的生理意义。 真核细胞基因组以染色质状态存在于细胞核内，基因的表达调控首先要在染色质水平发生变化。染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation)分析是近年发展起来检测蛋白因子在体内与染色质的结合，进而为蛋白因子参与染色质水平基因转录调控提供证据的方法。本研究运用该方法分析了p53、CREB、c-Jun、p300和mSin3A等在热休克、紫外线、PHA诱导等环境条件下对Jurkat细胞中hsp90β基因启动子区染色质的结合情况。在此基础上，进一步研究了染色质重塑复合体SWI／SNF对hsp90基因启动子活性的影响。将SWI／SNF复合体核心亚基(BRM或BRG1)的表达质粒或显性负突变体质粒与hsp90基因启动子驱动的CAT报告质粒瞬时转染到Jurkat细胞中，通过竞争性RT-PCR的方法证实SWI／SNF复合体参与了hsp90基因组成性及热休克诱导表达。 一、转录调控因子对hsp90β基因启动子区染色质的结合特性 1、p53对hsp90β基因启动子区的结合 通过DNA序列分析发现hsp90β基因启动子区含有p53结合位点。染色质免疫沉淀分析证实37℃、热休克及紫外线(UV)诱导条件下p53均结合于hsp90β基因启动子区p53结合位点。本组先前研究显示热休克时hsp90β基因被激活表达，而UV照射抑制该基因表达，本结果提示p53可能在不同的条件下帮助不同的激活或抑制复合体结合于hsp90β基因启动子区，调控该基因的表达。 2、CREB和c-Jun对hsp90β基因启动子区的结合 染色质免疫沉淀分析证明CREB在37℃和PHA诱导条件下均结合于hsp90β基因启动子区CRE和AP-1位点，而磷酸化c-Jun仅在PHA诱导后才结合于这两个位点。提示CREB在hsp90β基因的组成性和PHA诱导表达中都发挥一定作用，但c-Jun
李秀娟[4]2017年在《食管鳞癌侵袭转移相关分子靶标的筛选和功能研究》文中研究说明目的:1)建立不同侵袭转移潜能人食管鳞癌细胞亚系,用基因芯片筛选差异基因,建立食管鳞癌侵袭转移相关基因表达谱;2)验证部分差异基因在不同侵袭转移潜能食管鳞癌细胞和组织的表达,探讨HSP90α、Annexin A1和14-3-3β在新疆哈萨克族食管鳞癌的表达和病理意义;3)研究HSP90AA1沉默对食管鳞癌细胞生物学行为的影响和机制。方法:1)采用Transwell侵袭小室对Eca109母系(Eca109-T0)进行筛选,建立高侵袭转移潜能食管鳞癌细胞亚系Eca109-T4;体、内外比较Eca109-T0、Eca109-T4、CE81T-0和CE81T-4各系ESCC迁移和增殖能力;以Eca109-T0和Eca109-T4为对象,提取总RNA,分别用Cy5和Cy3荧光标记成cDNA探针,与基因芯片Affymetrix Gene Chip?Human Genome U133 Plus 2.0 Arry杂交,筛选出不同侵袭转移潜能食管鳞癌差异表达基因;对差异基因进行GO和KEGG聚类分析;2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化验证部分差异基因表达;在细胞水平验证基因(HSP90AA1、ANXA1、YWHAB、CXCR7、SDC2和TNFRSF10DmRNA)和蛋白(HSP90α、AnnexinA1、14-3-3β和CXCR7)表达差异:采用免疫组化验证蛋白(HSP90α、AnnexinA1和14-3-3β)在86对新疆哈萨克族食管鳞癌和癌旁组织中的表达,分析各蛋白表达水平与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、性别、年龄、大体类型、肿瘤位置和大小等临床病理参数的相关性;3)采用RNAi干扰技术下调CE81T-4细胞中HSP90AA1的表达,绿色荧光、qRT-PCR及Western blot检测转染效果,MTT法检测CE81T-4细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测MET、MMP2、ERK和P-ERK蛋白的表达变化;qRT-PCR检测MET和MMP2mRNA表达差异;复制裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤增殖速度和瘤体重量。结果:1)Transwell小室筛选出Eca109-T4高侵袭转移潜能人食管鳞癌细胞亚系,体内外生物学特性比较结果:Eca109-T4、CE81T-4的增殖、迁移及体外成瘤能力均高于Eca109-T0和CE81T-0;Eca109-T4的迁移、浸润能力高于CE81T-4组;对Eca109-T0和Eca109-T4基因芯片检测,共筛选出326个差异基因,其中Eca109-T4组上调123个,与Eca109-T0比较下调表达203个;GO聚类分析显示差异基因主要定位在细胞质、细胞核和细胞液;分子功能涉及蛋白结合,金属离子结合和DNA结合等;参与细胞信号转导、转录、细胞凋亡、细胞增殖、细胞黏附等生物学过程;KEGG聚类分析显示差异基因主要参与肌动蛋白细胞骨架调节、mapk通路和癌症通路等信号转导途径;2)验证结果与基因芯片筛选结果基本一致,qrt-pcr检测:hsp90aa1、ywhab、cxcr7和sdc2mrna在eca109-t4、ce81t-4的表达高于在eca109-t0、ce81t-0的表达(p<0.05);tnfrsf10dmrna在ce81t-4组低于在eca109-t4的表达(p<0.05);annexina1在eca109-t0、ce81t-0的表达高于在eca109-t4、ce81t-4表达(p<0.05);westernblot结果:hsp90α、14-3-3β、cxcr7蛋白在eca109-t0和ce81t-0低于在eca109-t4和ce81t-4的表达(p<0.05),annexina1蛋白在eca109-t0、ce81t-0的表达高于在eca109-t4和ce81t-4的表达(p<0.05);hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在ce81t-4表达高于在eca109-t4的表达(p<0.05);免疫组化结果:hsp90α、14-3-3β在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中阳性表达率高于在癌旁组织的表达(87.2%﹠18.6%,80.23%﹠41.86%,p=0.000,0.0002),annexina1在食管鳞癌组织的表达低于在癌旁组织表达(32.6%﹠59.3%,p=0.0002);hsp90α与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移相关(p=0.024、0.021、0.011),与患者性别、年龄、类型、位置和肿瘤大小无关(p>0.05);annexina1与分化程度和淋巴结转移相关(p=0.037、0.014),与浸润深度、年龄、性别、类型、肿瘤大小和位置等其他病理参数无关(p>0.05);14-3-3β表达与浸润深度和分化程度有关(p=0.008、0.035),与年龄、性别、淋巴结转移、类型、位置和肿瘤大小无关(p>0.05);3)hsp90aa1-rnai干扰ce81t-4细胞后可见到绿色荧光,hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在实验组(hsp90aa1-rnai)的表达低于阴性组对照组(nc-rnai)和正常培养组(nc)(p<0.05),证实有效下调hsp90aa1表达;mtt检测0h和24h两个时间点各组无差异(p>0.05),在48h、72h和96hhsp90aa1-rnai组细胞增殖被抑制(p>0.05);hsp90aa1-rnai组细胞周期阻滞于g0/g1期,hsp90aa1下调诱导细胞凋亡,凋亡率在hsp90aa1-rnai、nc-rnai和nc组分别为(27.30±4.33)%、(5.63±1.12)%、(10.20±2.04)%(p<0.05);划痕后24h、48h和72h各时间点hsp90aa1-rnai组细胞的迁移距离减小(p<0.05);transwell侵袭实验结果:hsp90aa1-rnai组侵袭细胞数目降低(p<0.05);westernblot检测hsp90aa1-rnai组的met、mmp2和p-erk蛋白表达降低(p<0.05),erk在各组表达无差异(p>0.05);qrt-pcr检测met、mmp2mrna在hsp90aa1-rnai组表达降低(p<0.05);hsp90aa1-rnai组皮下移植瘤增殖速度慢,重量低(p<0.05)。结论:1)建立的不同侵袭转移潜能食管鳞癌细胞株模型,为后续研究提供了模型;侵袭转移差异基因表达谱的建立和生物信息学分析为深入转移相关研究提供了丰富的信息;2)hsp90aa1、anxa1、ywhab、cxcr7和sdc2与食管鳞癌侵袭转移有关;hsp90α、14-3-3β在食管鳞癌高表达,它们与浸润深度呈正相关,与分化程度呈负相关;hsp90α和淋巴结转移呈正相关;annexina1在食管鳞癌中低表达,在分化程度高的,无淋巴结转移的食管鳞癌中Annexin A1表达上调;HSP90α、Annexin A1及14-3-3β的表达可一定程度反映食管鳞癌的分化程度、侵袭深度和有无淋巴结转移,有望成为食管鳞癌早期诊断,预测转移,侵袭和分化程度的分子标志物;2)RNAi技术可有效抑制CE81T-4细胞中靶基因HSP90AA1表达,HSP90AA1下调表达使CE81T-4细胞周期阻滞于G0/G1期,促进凋亡,抑制增殖、侵袭和迁移能力,可能通过下调P-ERK、MET和MMP2机制介导的。
吕红博[5]2014年在《食管癌细胞株Eca109、kyse150中E2F1调控IKKα/IKKβ/NFκB表达的机制研究》文中研究指明目的：SURVIVIN基因是目前发现的最强的凋亡抑制因子，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，其在肿瘤组织中持续高表达的分子机制未见报道；转录因子E2F1亦在促进细胞增值方面起到了非常重要的作用；IKK/IKKβ/NFκB信号通路是调控SURVIVIN表达的重要信息通路。在食管鳞状细胞癌的细胞株中，转录因子E2F1是否参与了IKK/IKKβ/NFκB信号通路的表达调控，是否通过该信号通路进一步参与了对SURVIVIN的表达调控，目前尚没有研究资料。方法：本研究拟在食管鳞状细胞癌细胞株中，利用E2F1的抑制剂抑制其转录水平的表达，并建立E2F1的过表达及shRNA质粒载体，质粒电转染食管鳞状细胞癌的细胞株，采用qPCR及Western-blot了解E2F1与IKKα/IKKβ/NFκB/SURVIVIN信号通路在转录水平及蛋白水平的表达调控关系。流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡，了解E2F1对食管鳞癌细胞株生物学功能的影响。应用ChIP实验分离E2F1蛋白在IKK、IKKβ、NFκB基因启动子区上有无结合位点。双萤光素酶报告基因的方法进一步验证E2F1蛋白在IKK、IKKβ、NFκB基因启动子区上有无结合位点。结果：在食管癌细胞株ECA109、KYSE150中，使用E2F1抑制剂BZB，干预24小时及48小时， E2F1在转录水平及蛋白水平的抑制同时，伴有IKKβ/NFκB/SURVIVIN在转录水平及蛋白水平的表达抑制；在ECA109细胞株中，IKKα转录水平表达上调，蛋白表达下调；在KYSE150中，IKKα在转录及蛋白水平均表达下调。建立E2F1的过表达及shRNA质粒载体，E2F1过表达质粒载体转染后，在两种细胞株中，E2F1转录水平及蛋白水平表达的增高，伴有IKKβ、NFκB、SURVIVIN在转录及蛋白水平表达的增高；ECA109中，IKKα转录水平及蛋白水平表达下调；KYSE150细胞株中，IKKα在转录水平表达无明显变化，蛋白水平表达下调。shRNA质粒载体电转染后，在两种细胞株中，E2F1在转录及蛋白水平的表达降低，伴有IKKβ、NFκB、SURVIVIN在转录及蛋白水平的表达下调；在ECA109细胞株中，IKKα在转录及蛋白水平表达上调；在KYSE150细胞株中，IKKα在转录及蛋白水平表达下调。细胞周期及细胞凋亡检测提示，E2F1在ECA109、KYSE150细胞株中有促进G1/S期转换，促进细胞增值的作用，S期细胞比例明显增高。当E2F1基因被E2F1shRNA基因沉默后，促进细胞增值的功能受到明显抑制，S期细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。E2F1在ECA109、KYSE150细胞株中有抑制细胞凋亡的作用，当E2F1基因被E2F1shRNA基因沉默后，凋亡早期细胞明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。染色质免疫共沉淀实验证实在ECA109细胞株中发现E2F1蛋白在IKKβ基因启动子区可能有结合位点，暂未发现E2F1蛋白与IKKα、NFκB基因启动子区有结合位点；在KYSE150细胞株中暂未发现E2F1蛋白与IKKα、IKKβ、NFκB基因启动子区可能的结合位点。在ECA109细胞株中，双萤光素酶报告基因实验再次证实共转染pGV142-E2F1，pGL3-IKKβ，pRL-TK组萤光素酶的活性明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05），再次验证了E2F1蛋白与IKKβ基因启动子区的可能有结合位点。结论：在ECA109及KYSE150食管鳞状细胞癌细胞株中，结果显示E2F1与SURVIVIN存在表达调控关系，E2F1参与SURVIVIN表达调控的机制可能是通过了IKKβ/NFκB经典信号通路。在ECA109细胞株中，E2F1蛋白可能通过结合IKKβ的启动子区-751bp以内，参与调控NFκB、SURVIVIN的表达。本研究结果在食管鳞状细胞癌中首次发现，为研究凋亡抑制基因SURVIVIN在癌组织中持续高表达的分子机制建立了新的思路；这一新的分子调控机制的发现，将为临床药物干预提供新的靶点。
谢震[6]2013年在《格尔德霉素衍生物17-DMAG联合顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3及SKOV3/DDP耐药性影响的研究》文中提出目的：卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤，为妇科恶性肿瘤的首要死亡原因。由于卵巢癌早期症状隐匿，75%的病人在确诊时已为晚期。目前临床上卵巢癌的治疗方法，是卵巢肿瘤细胞减灭术及术后铂类为基础的联合化疗。卵巢癌的5年生存率仍徘徊在30%左右。对化疗药物耐药是卵巢癌患者预后差，死亡率高的重要原因之一，其中以铂类耐药最为常见。铂类耐药对于卵巢癌患者的治疗非常棘手。因此，现在急需探究改善卵巢癌细胞对铂类药物耐药的机制，籍以研发新的抗癌药物。Hsp90是人体内一种必不可少的分子伴侣蛋白，可通过对其下游近150余种信号蛋白的调节，调控着细胞周期，肿瘤的发生及细胞的凋亡[10]。所以抑制hsp90的功能，导致其不能与客户蛋白正常结合，并诱导其底物的降解，阻断细胞信号传导，可以达到抑制肿瘤细胞生长的作用。17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-DMAG）是一种特异性的Hsp90抑制剂。有研究表明，17-DMAG通过抑制Hsp90的功能，使survivin，livin的表达下调，同时通过诱导STAT信号的传导及突变p53诱导胃癌细胞凋亡[6]。Jhaveri K的研究表明17-DMAG对卵巢癌，宫颈癌，乳腺癌细胞均有明显的增殖抑制作用[28]。相关研究表明17-DMAG不能下调hsp90的水平，但是可引起AKT，Met及HER-2在卵巢癌细胞中的下降[29][30]。17-DMAG对顺铂耐药的卵巢癌细胞的抑制作用及相关机制尚无研究。本研究旨在探讨17-DMAG与顺铂联合应用对人卵巢癌细胞株SKOV3及对顺铂耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/DDP耐药性的影响及其相关机制，为卵巢癌耐药机制提供基础理论依据。方法：1MTT法检测17-DMAG（1，2，4，8，16，32μmol/L），顺铂(1，2，4，8,16μg/mL)和17-DMAG与顺铂联合作用对SKOV3及对SKOV3/DDP的增殖抑制作用，并计算17-DMAG联合顺铂应用逆转顺铂耐药的耐药倍数RF。2FCM法测定顺铂，17-DMAG及17-DMAG联合顺铂处理SKOV3及SKOV3/DDP后的凋亡率，并通过金氏公式计算两药联合作用时的相互作用指数q值。3RT-PCR法检测顺铂，17-DMAG及17-DMAG联合顺铂处理SKOV3和SKOV3/DDP细胞前，后基因hsp90α，p53，bcl-2和survivin基因的表达情况。4Western-blot法检测顺铂，17-DMAG及17-DMAG联合顺铂处理SKOV3和SKOV3/DDP细胞前、后细胞内hsp90α，p53，bcl-2和survivin蛋白的表达情况。结果：117-DMAG（1，2，4，8，16，32μmol/L）对SKOV3及SKOV3/DDP细胞有显著的增殖抑制作用，但是，17-DMAG对这两种细胞的增殖抑制作用无明显差别（P>0.05）；并且随着17-DMAG用药浓度的增加，作用时间的延长，其对SKOV3及SKOV3/DDP的增殖抑制作用增强，呈时间剂量依赖性。不同浓度顺铂(1，2，4，8，16μg/mL)分别处理SKOV3及SKOV3/DDP细胞24h，48h，72h后，对这两种卵巢癌细胞的增殖抑制作用呈一定的剂量-时间依赖关系，顺铂对SKOV3细胞的抑制作用较SKOV3/DDP细胞明显。17-DMAG联合顺铂对SKOV3及SKOV3/DDP细胞有明显的增殖抑制作用，呈剂量-时间依赖性。而且，17-DMAG联合顺铂逆转顺铂的耐药倍数为2.19，表明17-DMAG可逆转顺铂的耐药性。2通过FCM法测得以下药物处理浓度时的凋亡率，SKOV3细胞：空白对照组，6μmol/L17-DMAG单药组，1.5μg/mL顺铂单药组，17-DMAG与顺铂联用组：6μmol/L17-DMAG+1.5μg/mL顺铂。SKOV3/DDP细胞：对照组，17-DMAG单药组6μmol/L，细胞顺铂单药组3μg/mL，17-DMAG与顺铂联用组：17-DMAG6μmol/L+顺铂3μg/mL。采用金氏公式计算得在skov3细胞两药联合作用时的相互作用指数q=0.941，在SKOV3/DDP细胞两药联合作用时的相互作用指数q=0.999，均高于0.85.说明17-DMAG和顺铂两药联合应用对SKOV3细胞及SKOV3/DDP细胞有协同的增殖抑制效应。3经过17-DMAG和顺铂两药单独或联合处理48h后，采用RT-PCR法检测SKOV3和SKOV3/DDP细胞中hsp90α，p53，bcl-2和survivinmRNA的表达变化，结果显示：hsp90α在经过17-DMAG及顺铂作用后，其含量与对照组比较无明显差异（P>0.05）。顺铂作用于SKOV3及SKOV3/DDP细胞48h后，各组的p53，bcl-2和survivin表达均明显上升，与空白对照组相比差异有显著性（P<0.05），17-DMAG单药及17-DMAG与顺铂联合应用可下调p53，bcl-2和survivin基因的表达，与空白对照组相比差异有显著性（P<0.05），且17-DMAG联合顺铂组p53，bcl-2和survivin的下调与单药17-DMAG组相比无显著性差异（P<0.05）。及SKOV3/DDP细胞空白对照组p53，bcl-2和survivin mRNA水平高于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。4Western-blot法检测hsp90α，p53，bcl-2和survivin蛋白在SKOV3和SKOV3/DDP细胞中的变化，结果显示：SKOV3和SKOV3/DDP细胞经过17-DMAG及顺铂作用后，hsp90α，bcl-2和survivin蛋白的表达含量与对照组相比无明显差异（P>0.05）；SKOV3及SKOV3/DDP细胞经顺铂作用48h后，两组的p53蛋白表达增加，与对照组比有显著性差异（P<0.05），17-DMAG单药组及17-DMAG联合顺铂组均下调p53蛋白的表达，与空白对照组相比有显著差异（P<0.05），但是17-DMAG单药组下调p53蛋白的表达与17-DMAG同顺铂联用组相比无显著性差异（P>0.05）。SKOV3及SKOV3/DDP细胞空白对照组间p53，bcl-2和survivin蛋白水平相比较，具有统计学意义（P<0.05）。结论：117-DMAG联合顺铂对卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP细胞均有明显的增殖抑制作用，且呈时间剂量依赖性。17-DMAG与顺铂联合应用对两种卵巢癌细胞的增殖抑制作用均明显强于17-DMAG及顺铂的单独使用。217-DMAG联合顺铂可下调SKOV3和SKOV3/DDP细胞中耐药基因p53，bcl-2和survivin mRNA在的表达。17-DMAG联合顺铂可下调耐药基因p53蛋白在SKOV3和SKOV3/DDP细胞中的表达，因此，我们认为17-DMAG可能通过下调卵巢癌SKOV3/DDP细胞中的p53基因和蛋白的表达而改变卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。17-DMAG在一定程度上可显著逆转DDP的耐药性。
索涛莉[7]2010年在《靶向Hsp90β siRNA对Jurkat细胞生长抑制及化疗敏感性影响的研究》文中研究指明目的:探讨RNA干扰技术沉默Hsp90β(Heat shock protein 90 beta)基因表达对Jurkat细胞生长的抑制作用及化疗敏感性的影响。方法:1.采用Real-Time PCR检测Jurkat、Raji、K562、HL-60细胞株Hsp90βmRNA表达的情况,筛选出高表达Hsp90β的细胞株。2.针对Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建3对Hsp90β干扰序列和一对随机对照序列,分别克隆获得质粒pSOS-Hsp90βi1, pSOS-Hsp90βi2, pSOS-Hsp90βi3及pSOS-Hsp90βicontrol;应用Lipofectamine? LTX将质粒分别转染入高表达Hsp90β的细胞中, Real-Time PCR检测Hsp90βmRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90βsiRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平。3.MTT法和流式细胞仪检测Hsp90βsiRNA对Jurkat细胞生长抑制作用。4.检测Hsp90βsiRNA对Jurkat细胞化疗敏感性的影响,选不同浓度的长春新碱、阿霉素和依托泊苷,通过MTT法抗癌药物敏感试验检测干扰前后对Jurakt细胞化疗敏感性的变化。结果:1.Real-Time PCR结果显示Hsp90β在Jurkat细胞中的表达明显高于其它三株白血病细胞株(Raji,K562,HL-60),表达差异有统计学意义(P<0.05)。2.应用RNA干扰技术成功构建Hsp90β基因三条特异性真核载体pSOS-Hsp90βi1、2、3并分别转染Jurkat细胞,发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,Jurkat细胞Hsp90βmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。3.Hsp90β基因表达沉默后,Jurkat细胞增殖明显受抑,细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βicontrol组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05)。4.转染了pSOS-Hsp90βi2的Jurkat细胞对VCR、ADM和VP16药物的IC50显著低于其余两组(P<0.05)。结论:不同的白血病细胞株Hsp90β的表达存在差异,在Jurkat、Raji、K562、HL-60中Jurkat细胞表达Hsp90β最高;成功构建了3种真核表达载体pSOS-Hsp90βsiRNA,并筛选出沉默效果最好的pSOS-Hsp90βi2;靶向pSOS-Hsp90βi2可下调Hsp90β表达,对人白血病Jurkat细胞有明显的生长抑制作用,显著增加了Jurkat细胞对长春新碱、阿霉素和依托泊苷的敏感性,为白血病基因治疗的靶向性奠定理论依据。
李刚[8]2016年在《应用多组学策略筛选肝癌候选标志物及NEK2和HSP90α的验证》文中研究表明背景:生物标志物(biomarkers)的研究是预防医学核心研究内容之一,它是一种具有能够客观测量并评价一般生物过程、病理过程或对医疗干预相关药物反应的指示物,也是生物体受到损害后的重要预警指标,涉及到细胞分子结构和功能的改变,生理活动的异常变化,生化代谢过程的改变,个体、群体或整个生态系统的异常表现等。生物标志物的研究为有效地预防和控制健康危害提供了理论依据。近年来随着分子生物学及相关前沿生命学科的深入发展,生物标志物的研究已成为国内外预防医学界共同关注的热点,被称为是环境医学发展到分子水平的一个重要里程碑,其研究在分子流行病学、环境卫生学、劳动卫生学、分子毒理学等诸多领域的价值是十分重要的。在环境流行病学的研究中,肿瘤分子标志物的研究对于预测肿瘤风险、评估临床治疗效果、判断预后及指导三级预防等方面起了重要作用,因此被得到广泛应用。原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据最新统计显示,近年来肝癌的发病率和死亡率呈上升趋势,在世界范围内其发病率和死亡率分别位居男性恶性肿瘤的第5位和第2位、女性恶性肿瘤的第7位和第6位。其中,我国肝癌的新发病例和死亡病例数约占全球的一半左右,其死亡率仅次于胃癌。根据我国2010年肿瘤登记数据统计显示,广西肝癌的发病率和死亡率分别为43.76/10万和35.82/10万,均分别高于全国的肝癌发病率(28.71/10万)和死亡率(26.04/10万),位于全部恶性肿瘤死亡的第一位。随着人口老龄化的加剧,肝癌的发病/死亡绝对数将会进一步上升,有研究表明,预计到2030年肝癌的发病/死亡人数将增加60%。原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)具有恶性程度高,治疗困难,发展速度快,生存时间短的特点,5年生存率不足10%。原发性肝细胞癌的临床病象极不典型,其症状一般多不明显,特别是在病程前期。目前,由于缺乏有效的早期诊断标志物,使得其只有30%~40%的肝癌患者可以获得及时诊断和有效治疗。因此迫切需要寻找一种特异度和敏感度均较高的肝癌标志物,以提高肝癌的早期诊断水平,保证患者的预后。肿瘤的发生与发展涉及到基因组、转录组、蛋白组和代谢组等多个不同层次的病理过程。单组学数据分析是传统肿瘤标志物的研究策略,往往只能体现出疾病样本其中一个层面的变化,在筛选肿瘤标志物方面具有局限性。通过对多层次多组学数据的交集分析,将有助于人们更加系统全面的认识肿瘤的生物学行为,进一步为寻找有价值的肿瘤标志物和探讨肿瘤相关机制提供新的线索。利用多种组学技术目前已成为肿瘤研究领域新兴的热点方向。本研究将多种组学研究策略运用于肝癌标志物的筛选和鉴定:(1)采用细胞转录组学结合组织转录组学分析策略,寻找肝癌细胞和组织中共有的差异表达基因;(2)采用血清蛋白组学结合细胞转录组学分析策略,筛选肝癌血清和细胞中共有的差异表达因子。然后通过生物信息学分析其生物学特性及功能,进一步利用q RT-PCR、免疫组化、Western blotting等技术验证差异因子在肝癌细胞、组织及血清中的表达水平,并结合临床病理资料分析及生存率分析,为肝癌的防治研究提供有价值的肿瘤分子标志物。第一部分转录组学测序筛选肝癌潜在标志物NEK2目的:利用转录组学测序技术筛选肝癌细胞与肝癌组织中共有的差异表达基因,并验证其在肝癌细胞和组织的表达水平,结合临床病理资料分析和通路相关因子的关联分析,探讨其作为标志物在肝癌发生发展中的可能作用机制。方法:1.采用Ion Proton转录组测序平台对肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L-02进行转录组双端测序,获得差异表达基因。2.将细胞转录组学与组织转录组学数据进行交集分析,得到共有的差异表达基因,并将差异表达最为明显的基因列为候选标志物。3.利用q RT-PCR验证候选标志物NEK2基因在肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L-02,以及5例肝癌和癌旁组织中的表达水平;免疫组化验证候选标志物NEK2蛋白在63例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。4.分析候选标志物NEK2的表达与63例肝癌样本临床病理特征之间的关系。5.对候选标志物可能涉及通路中的关键蛋白p-AKT和MMP-2进行关联性分析。结果:1.转录组测序结果显示,在肝癌细胞SMMC-7721与正常肝细胞L-02中共得到差异表达基因611个,其中肝癌细胞中上调368个,下调243个。2.将细胞转录组学和组织转录组学的差异表达基因进行交集分析,可以得到12个共有的差异表达基因,在肝癌中表达上调基因10个,表达下调基因2个,其中NEK2在细胞转录组学和组织转录组学中差异最为明显,因此将NEK2基因作为验证的候选标志物。3.验证结果表明,NEK2 m RNA在肝癌细胞SMMC-7721中的相对表达量为0.024±0.0026,是正常肝细胞L-02表达量0.014±0.0003的1.71倍(P=0.002);NEK2 m RNA在肝癌组织中的相对表达量为5.60±3.69,是癌旁组织表达量0.34±0.38的16.47倍(P=0.013);NEK2蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P=0.000)。4.肝癌临床病理特征分析发现,NEK2、p-AKT和MMP-2在肿瘤大小≤10 cm组的表达水平均分别是肿瘤大小>10 cm组的1.58倍(P=0.024)、2.24倍(P=0.041)和2.29倍(P=0.013),NEK2和MMP-2在包膜不完整组的表达水平分别是包膜完整组的1.91倍(P=0.000)和2.04倍(P=0.009),NEK2、p-AKT和MMP-2在多结节组中的表达水平分别是单结节组的1.62倍(P=0.012)、2.40倍(P=0.046)和2.04倍(P=0.024),NEK2和p-AKT在复发组中的表达水平分别是非复发组的2.09倍(P=0.004)和3.24倍(P=0.045)。5.关联性分析结果显示,肝癌组织中NEK2的表达与p-AKT和MMP-2均成显著正相关,相关系数分别为r=0.832(P<0.01)和r=0.763(P<0.01)。结论:NEK2很可能是具有重要功能的肝癌标志物,并且其表达与肝癌的侵袭转移有关,可能通过激活PI3K/AKT信号通路增加肿瘤细胞的侵袭转移能力。第二部分转录组结合蛋白组学筛选肝癌潜在标志物HSP90α目的:利用蛋白组学结合转录组学的策略筛选肝癌细胞与肝癌血清中共有的差异表达因子,验证其在肝癌细胞、血清和组织的表达水平,及其与临床病理特征之间的关系。方法:1.采用iTRAQ-LC-MALDI-TOF/TOF蛋白组学技术对10例人肝癌血清和10例正常对照组血清进行质谱分析,获得肝癌相关差异表达蛋白。2.将血清蛋白组学与细胞转录组学数据进行交集分析,得到共有的差异表达因子,并将差异表达最为明显的因子列为候选标志物。3.利用q RT-PCR验证候选标志物HSP90α在肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L-02中的表达水平;Western blotting、ELISA验证HSP90α在7例肝癌血清和7例正常对照血清中表达水平;免疫组化验证HSP90α蛋白在76例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。4.分析候选标志物HSP90α的表达与76例肝癌样本临床病理特征之间的关系。结果:1.蛋白组学结果显示,在人肝癌血清和正常对照组血清中共鉴定出31个差异表达蛋白,其中在肝癌血清中上调17个,下调14个。2.将血清蛋白组学与细胞转录组学的差异表达因子进行交集分析,可以得到3个共有的差异表达因子,在肝癌中表达上调2个,表达下调1个,其中HSP90α在血清蛋白组学与细胞转录组学中差异最为明显,因此将HSP90α基因作为验证的候选标志物。3.验证结果显示,HSP90αmRNA在肝癌细胞SMMC-7721中的表达水平是正常肝细胞L-02表达水平的4.18倍(P<0.05);Western blotting结果显示HSP90α蛋白在肝癌血清中的表达水平是正常对照组的7.26倍(P<0.05);ELISA结果显示HSP90α在肝癌血清中的表达量为273.6±20.3μg/ml,也明显高于在正常对照组血清的表达量186.2±18.3μg/ml(P<0.05);HSP90α蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。4.肝癌临床病理特征分析发现,HSP90α在肝癌转移组和非转移组中被判定为强阳性的比例分别为66.7%和25%,在肝癌转移组中的表达水平显著高于非转移组(P=0.010)。结论:HSP90α可能是重要的肝癌标志物,并且与肝癌的侵袭转移有密切的关系。第三部分NEK2和HSP90α诊断肝癌的价值及生存率分析目的:利用TCGA数据库中的肝癌患者数据,进一步评估NEK2和HSP90α在诊断肝癌的价值及生存率分析,探讨其临床应用的可行性。方法:1.下载TCGA数据库中肝癌的RNASeq V2数据,分别计算NEK2基因和HSP90α基因在359例肝癌及癌旁组织中的表达差异性。2.ROC曲线分析,获得NEK2和HSP90α对肝癌诊断的最佳临界点、AUC及诊断灵敏度与特异度。3.根据ROC曲线提供的诊断最佳临界点,将肝癌患者分为NEK2和HSP90α高表达组和低表达组,并利用Kaplan-Meier生存曲线分析NEK2和HSP90α高表达组和低表达组患者的生存率差异。结果:1.NEK2和HSP90α在肝癌组织中的表达均显著上调,其中NEK2在肝癌组织中的表达水平是癌旁组织的19.036倍(P<0.001),HSP90α是癌旁组织的1.399倍(P<0.001)。与HSP90α相比,NEK2在肝癌组织中表达上调的更为明显。2.NEK2和HSP90α对肝癌均有较好的诊断准确性,并且NEK2诊断准确性高于HSP90α,其AUC分别为0.960(P=0.003)和0.703(P=0.029);NEK2和HSP90α对肝癌诊断的最佳临界点分别为52.73和17971.78;NEK2诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为0.98和0.82,HSP90α诊断肝癌的灵敏度和特异度分别为0.88和0.55,与HSP90α相比,NEK2诊断肝癌显示出更高的灵敏度和特异度。3.生存曲线分析结果显示,NEK2和HSP90α基因的表达情况均与患者生存率有关(P=0.0145和0.0032),并且高表达组患者生存率低于低表达组。结论:NEK2和HSP90α对肝癌均有较好的诊断价值,NEK2和HSP90α高表达的肝癌患者预后较差;与AFP相比,NEK2诊断肝癌显示出更高的灵敏度和特异度,具有更好的临床应用前景。
陈雪松[9]2001年在《STAT1和STAT3在hsp90α基因表达调控中的作用》文中研究指明HSP90是热激蛋白家族(HSP)的主要成员之一，它在细胞中呈高组成性表达，热激和其它应激条件可进一步诱导其表达。HSP90作为分子伴侣广泛参与细胞的信号转导、激素应答及细胞周期调控过程，对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥了重要作用。因此研究HSP90蛋白基因表达调控机制具有重要的生物学意义。目前研究得比较清楚的是热休克因子(HSF)和热休克元件(HSE)在hsp90基因热诱导表达中的作用，而对于其它反式作用因子的在该基因表达调控中的作用研究得较少。 哺乳动物的HSP90分两种，即HSP90α和HSP90β，分别由hsp90α和hsp90β基因编码，HSP90β可被热激及植物凝集素(PHA)双重诱导，HSP90α蛋白的表达对热激诱导的敏感性大于HSP90β，但不受植物凝集素(PHA)诱导。这两种基因的转录调控机制不同，第一内含子对hsp90β基因的基础转录必不可少，并且对该基因的热诱导表达也非常重要。而hsp90α基因一定范围内的5′上游调控片段对其启动子活性极为重要。本组在研究hsp90α基因表达调控机制时发现，在其启动子的TATA盒上游30碱基处有6个5核苷酸(nGAAn)连续排列的两个典型的和一个非典型的HSE在，称其为HSE复和元件(HSEC，-96／-60bp)，仅由TATA盒驱动的报告基因基础表达量很低，而包括此HSEC的报告基因基础表达可提高10倍以上，说明HSEC对于该基因的高组成性表达非常重要，同时该元件与远端的HSE在调控hsp90α热诱导表达方面有协同作用。我们对HSEC的序列进行了分析，发现有二个典型的STAT结合序列与其中的三个HSE相叠加。对基因启动子调控区的删切分析表明，hsp90α基因5′上游调控区的-1756／-1463bp片段对其高表达非常重要，删除该片段后，hsp90α基因的热诱导表达明显下降，但该区域并没有HSE元件，而我们在-1615／-1601区发现了一个典型的STAT1结合元件，其核心序列为AAGTTCCTACAAGTG。以上研究提示我们，STAT蛋白是否会在hsp90α基因的表达调控中起作用。 STAT(Signal Transducer and Activators of Transcription)家族是一类新发现的反式作用因子，它既参与细胞跨膜信息向核内的传入，又直接参与靶基因的转
闫天中[10]2005年在《前列腺癌雄激素非依赖的发生机理及熊果酸治疗作用的实验研究》文中研究表明在欧美国家中,前列腺癌(PCa)的发病率占男性恶性肿瘤的第一位,肿瘤致死的第二位。我国前列腺癌的发病率也呈明显的上升趋势。雄激素阻断是PCa 治疗的最有效方法。但不幸的是,约80%的PCa 在去雄治疗后的18 个月左右发生雄激素非依赖性生长,而失去治疗作用,癌肿继续生长并恶化,病人死于该病。雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的发生成为PCa 治疗中最棘手的问题。AIPC 发生的机制比较复杂,目前多认为雄激素受体(AR)的扩增和突变及甲基化所导致的经典的AR 激活途径的活性增高是其主要原因。尽管一些雄激素抵抗性前列腺癌有AR 表达的增高,但研究显示:PCa 在雄激素非依赖发生前后AR 基因扩增率很低,不足于单独解释AIPC 的进展,而突变的细胞也只占所有肿瘤细胞的一小部分,无法解释肿瘤整体上的雄激素非依赖状态。而在原发肿瘤中有AR 的扩增,其对雄激素撤除仍然有反应,在激素非依赖性肿瘤,针对AR 的治疗也没能逆转其雄激素非依赖性。可见,AR 途径活性增高学说尚缺乏有效依据。AR的丢失或失活在AIPC发生中的作用逐渐受到关注。雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)细胞株LNCaP和AIPC细胞株DU145在AR和GR(糖皮质激素受体)的表达方面存在巨大差异提示AR的丢失或失活,GR表达增高可能是AIPC发生的重要原因。HSP90是调节GR作用的最重要的分子伴侣,能激发GR功能与活性的发挥,GR途径的活化能引发下游炎性因子如IL-6等的大量分泌,且IL-6具有雄激素活性,这些炎症因子也是促进前列腺癌细胞不依赖雄激素生长的重要因素。我们推测,在去雄治疗所导致的生存压力下,癌细胞发生“细胞应激”,在HSP90的辅助下,通过高表达GR可以快捷地获得新的生长动力,在无雄激素情况下继续生长。所以,研究GR及其下游炎症因子IL-6等在前列腺癌中的表达及作用对探索AIPC的发生机制和治疗途径有重要意义。同时,探索应用调节激素平衡,调节代谢及免疫作用的药物来调节GR、AR途径之间的平衡,抑制异常活化的GR途径及其下游炎症因子的释放,以维持或恢复前列腺癌细胞对雄激素的反应性,使去雄治疗长期有效成为我们探索治疗方法的思路及途径。主要研究内容:
参考文献：
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[9]. STAT1和STAT3在hsp90α基因表达调控中的作用[D]. 陈雪松. 中国协和医科大学. 2001
[10]. 前列腺癌雄激素非依赖的发生机理及熊果酸治疗作用的实验研究[D]. 闫天中. 第三军医大学. 2005
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