黄厚斌[1]2003年在《大鼠视神经不同程度部分损伤与再生的实验研究》文中指出目的 建立一种标准化的大鼠视神经不同程度部分损伤动物模型，特别对致伤强度和损伤程度以及它们之间的关系进行量化分析，并探讨不同程度视神经损伤后视网膜节细胞和轴突的继发损伤变化和神经再生能力以及损伤后基因表达谱的变化。 方法 1．用压力恒定的反向镊和微型动脉夹夹持大鼠视神经建立不同程度视神经损伤的动物模型，用经颅荧光金逆行标记视网膜节细胞和电镜下轴突计数的方法衡量损伤程度，并用坚牢蓝心脏灌注的方法评价损伤模型中眼部血供的变化。 2．利用视网膜节细胞和轴突计数的方法以及节细胞和轴突的存活率和丢失率观察不同程度视神经损伤后的继发损伤反应，利用透射电镜和GAP-43免疫电镜技术以及神经特殊染色技术观察损伤后的再生反应，并基于银染技术用再生指数衡量不同程度视神经损伤后神经再生能力。 3．利用高密度基因芯片技术检测视神经部分损伤后视神经和视网膜基因表达谱的变化。 结果 1．视神经夹持损伤模型不会引起视网膜缺血。用致伤冲量和平均冲量能全面反映致伤强度，荧光金逆行标记视网膜节细胞计数或电镜 中国人民解放军总医院／军医进修学院博士学位论文下轴突计数是衡量损伤程度的良好指标，且节细胞计数要优于轴突计数。随着致伤强度的增加，节细胞和轴突的数目减少，视网膜节细胞的数目与致伤冲量之间呈幂函数曲线关系。 2．视神经部分损伤后视网膜节细胞和轴突在伤后两周内迅速丢失，其后因继发损伤继续缓慢丢失，总体呈指数形式下降，随着损伤程度的加重，节细胞和轴突的丢失越严重，轻度损伤时这种继发损伤具有自限性。 3．损伤区后可看到大量丛状聚集、区域化分布的无髓再生纤维，GAP43在损伤区前朗飞氏结处的轴突和损伤区后的细小无髓神经纤维中均有表达。 4．不同程度损伤后神经的再生能力可能不同，轻度损伤的再生能力强。 5．视神经损伤后有大量基因表达异常，包括细胞生长和存活、细胞骨架、细胞外基质和细胞粘附、自由基和氧化损伤、能量和代谢、炎症、神经传递和离子转运、细胞信号转导、结构蛋白、转录和翻译等有关的基因。结论 1．利用反向镊夹持的方法可以很简便地建立一种易于标准化的视神经部分损伤模型，该模型可以用冲量、平均冲量和视网膜节细胞计数的方法来评价。 2．不同程度视神经部分损伤后继发反应和再生能力不同，轻度损伤后的继发损伤具有自限性并具有更强的再生能力。 3．全面了解视神经损伤后基因表达的变化对于深入研究损伤后反应特别是再生反应的机制具有重要意义。
范建国[2]2001年在《大鼠视神经不同程度部分损伤后自发性再生的实验研究》文中研究说明目的：通过建立具有良好定量化及可重复性的大鼠视神经不同程度部分损伤模型，从不同侧面和角度观察在损伤后不同的时间点及不同的损伤程度下大鼠视神经轴突自发性再生的部位和进程，探讨和证实大鼠视神经在部分损伤的情况下自发性再生的可能性。 方法：1．在距球后2mm处用反向镊（使用这种镊子可以保证对ON致伤作用力的一致性）以不同的作用时间（5、10、20、30、40秒）夹持大鼠ON，伤后第七天取标本，树脂包埋，半薄切片，甲苯胺兰染色，计算机测量视神经内轴突的总数所占的面积与视神经横截面积的比，作为划分损伤程度的标准，将损伤分为轻、中、重叁级，这样以相同的作用力乘以不同的作用时间（致伤量＝相同的致伤压力×不同的致伤时间），造成大鼠ON不同程度的部分损伤，建立大鼠不同程度部分损伤的模型。2．采用兔疫组织化学技术检测不同损伤程度及损伤后不同的恢复时间点生长相关蛋白－43（GAP－43）在受损ON轴突中的阳性表达；3．采用RT－PCR技术检测不同损伤程度及损伤后不同的恢复时间点生长相关蛋白－43（GAP－43）mRNA在受损ON轴突中的定量表达：4．用亲脂性的荧光染料碳花青（fast－DiI）顺行标记示踪ON部分损伤后自发性再生的行程和程度；5电镜下观察ON部分损伤后自发性再生时的超微结构改变。 结果：1.以损伤后视神经内轴突的总数所占的面积与视神经横截面积的比，作为划分损伤程度的标准，将损伤分为轻、中、重叁级，基金项目：全军“十五”重点攻关课题基金 大鼠视神经不同程度部分损伤后自发性再生的实验研究 中文摘要分别相当于面积比的 70％（5秒）、40％（10秒）、10％（30秒）。2．GAP一43免疫组织化学染色显示：损伤早期门周人 损伤处近端GAP43呈强阳性，远端为阴性，此为损伤反应；伤后半月远端出现局限性阳性反应；到伤后2月，远端GAP叶3表达达到高峰，此为再生反应；3。RT干CR结果示：损伤早期GAP－43mRNA呈阴性表达，损伤后1月左右出现阳性表达，2 月后达到高峰，之后表达逐渐减弱；表达强弱与损伤程度呈负相关关系。4．fasto 示踪及其强度：损伤早期，荧光局限于视神经损伤近端，而损伤远端荧光较弱；损伤半月后远端荧光开始逐渐加强。损伤远端荧光的强度与损伤程度呈负相关关系，与恢复时间呈正相关关系j．电镜结果显示大鼠ON部分损伤后存在自发性再生的轴突纤维。 结沦：1．以相同的致伤压力乘以不同的致伤时间作为致伤量，可以成功地建立大鼠ON不同程度部分损伤的模型，易于量化，可重复性好。2．部分损伤后大鼠的ON存在自发性再生现象，再生的高峰期在伤后2月左右。3．大鼠ON部分损伤后自发性再生的程度与损伤程度密切相关。4．GAP叶3是反映ON再生的可靠指标。
刘婉莹[3]2004年在《视神经切开减压对大鼠不完全视神经损伤保护作用的实验研究》文中提出目的 利用一种规范化的大鼠视神经不完全损伤的动物模型，观察视神经切开减压(optic nerve incision decompressio,ONID)术后损伤的视通路在功能学、形态学及视神经损伤后的修复和再生等方面的变化，同时与单纯的视神经鞘膜减压术(optic nerve sheath fenestration or decompression,ONSD)进行对比，探讨该手术对不完全视神经损伤的保护作用及机制，从而判断视神经切开减压术的可行性及有效性，并掌握减压的最佳时机，为下一步的临床应用提供参考。 方法 1．观察不同程度视神经损伤及减压后闪光视觉诱发电位(flash-visual evoked potentials, F-VEP)的变化。通过对比减压组与对照组F-VEP潜伏期和振幅的变化，初步判断减压是否有效，并选择减压的最佳时机。 2．观察减压后视通路的形态学变化。通过光镜、电镜和荧光显微镜对ONID后视神经轴突及其胞体——视网膜神经节细胞(retinal 第四军医大学硕士学位论文 ganglion cen，RGC)的观察，反映视通路上各部位的形态、结构 及数量的变化，进一步验证切开减压对视神经不完全损伤的保护 作用。其中光镜包括视神经和视交叉的H.E染色及Luxol坚牢蓝 染色;透射电镜观察轴突形态及数目;荧光金逆行标记RGC进 行记数。3.观察ONID后视神经损伤的修复和再生情况。利用免疫组织化学 的方法，观察急性期巨噬细胞的聚集和细胞微管蛋白(Tubulin)Q 的表达;透射电镜观察再生结构。4.对比ONID与ONSD后F一VEP、神经结构、再生潜能的异同。结果1.F一vEP表明，ONID后，中度损伤组的减压眼较未减压眼峰潜时 提前，振幅增大;越早减压效果越好，48h减压就己基本无效。 ONID对轻、重度损伤后F一VEP的转归不理想。2.荧光金逆行标记中度损伤后，ONID组和对照组RGC计数结果表 明，ONID组RGC数目比对照组明显增多，下降速度明显减缓。3.视神经超微结构显示，ONID组髓鞘和轴突变性的程度明显小于 对照组。减压术后3个月视神经结构基本趋于稳定，即髓鞘结构 稳定，星型胶质细胞增生，无定形物质无增多:同时轴突的数目 不再继续下降，基本恒定。4.损伤后脱髓鞘现象普遍存在，视神经和视交叉中的大多有髓结构 受累。ONID组的脱髓鞘严重程度均比对照组明显减轻;视交叉 处细胞数目比对照组有明显增多，3个月后存活的细胞数基本 恒定，不再减少。5.ONID组损伤后3天至3周，于损伤中心可见巨噬细胞大量聚集， 1周时达高峰，有效清除损伤处神经组织的碎片和残骸，4周后 巨噬细胞才逐渐消失。对照组巨噬细胞的活动过程很短暂，这些 第四军医大学硕士学位论文 细胞聚集出现晚，随后很快消退，并且聚集的数目大大减少。6.ONID组Tubulin一。阳性，6个月时阳性结果最为明显。对照组 基本均为阴性。7.ONID组的视神经损伤区后可见大量丛状聚集、区域化分布的无 髓再生或芽生(sPouting)纤维，数目明显增多。8.ONSD对F一VEP的振幅的提高有一定作用，但对峰潜时的改善无 作用:ONSD组脱髓鞘的程度介于ONID组和对照组之间;髓鞘 和轴突变性程度较对照组在2个月内有减小，但3个月后视神经 结构的破坏程度没有停止，继续恶化;荧光金逆行标记RGC， ONSD组和对照组数目没有差异。ONSD组巨噬细胞数量明显少 于ONID组，2周时才见有细胞聚集，随后很快消失。结论1.ONID对中度视神经损伤后F一VEP的变化有一定改善作用，对轻 度和重度损伤却无益处。需尽早(48h内)进行减压有利减轻继 发性损伤。ONID对F一VEP的保护效果优于ONSD。2.ONID有效阻止继发性损伤对视神经结构的进一步破坏，明显延 缓了胞体的死亡速度及轴突的变性进程，对视神经结构起到了保 护作用，并且这种保护力度明显强于ONSD。3.oNID后各种利于中枢神经系统(eentral nervous system，eNs) 再生的因素表现较为活跃，例如某些炎性细胞和骨架蛋白。巨噬 细胞的活跃和微管蛋白的积极表达都提示我们，不论在短期还是 在长期，ONID都能使视神经表现出较强的自我修复能力和再生 潜能。
刘永生[4]2004年在《神经干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的实验研究》文中提出临床上颅脑损伤合并视神经损伤的发生率较高，约为5％，约有50％的患者遗留有永久性视力损害。由于视神经是脑白质的延伸，损伤后缺乏神经修复和再生的能力，所以临床治疗视神经损伤颇为棘手。长期以来，对视神经损伤的治疗方案一直存有争议。保守观察，药物(主要是激素)治疗和手术治疗都是可选用的方法。但大组病例分析认为：激素治疗、手术减压和未经特殊治疗之间疗效无显着性差异。且有学者证明在手术组中，伤后不同时间手术，其疗效亦无显着性差异。况且有些药物的剂量、应用时间及副作用并未完全弄清，手术适应证和手术时机还存有争议。因此寻找促进神经修复与再生的有效手段，成为现代神经生物学领域的热点。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)具有未分化特性，增殖和自我更新能力，分化产生中枢神经系统(central nerve system，CNS)主要类型细胞(神经元和神经胶质细胞)的多向分化潜能和修复损伤组织的能力。NSCs存在于哺乳动物胚胎和成体CNS的部分区域中。利用NSCs移植治疗某些神经系统疾病和损伤，已取得了成功。目前国际上有关NSCs移植治疗视神经损伤的研究报道极少，国内还无人涉及。本实验采用无血清培养基对16-18d胎鼠脑室区／脑室下区(Ventricular Zone／Subventricular Zone，VZ／SVZ)NSCs进行培养、增殖，鉴定后植入成年大鼠损伤的视神经鞘膜内，在视神经损伤后的不同时间点移入NSCs并在植入后的不同时间点观察损伤视神经超微结构和视传递功能的恢复情况。探讨了NSCs移植对视神经损伤的治疗效应。 方法 采用机械分离法分散16-18d胎鼠VZ／SVZ组织，用无血清培养基进行培养、增殖；用免疫细胞化学方法检测Nestin(神经上皮干细胞蛋白)阳性表达。应用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。实验动物共分为叁大组：Ⅰ组：阴性对照组，视神经损伤后不施加任何影响因素；Ⅱ组：阳性对照组，伤后局部注射碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)800Au，分为3个亚组：ⅡA组(伤后立即注射bFGF)，ⅡB组(伤后1wk注射bFGF)和ⅡC组(伤后4wk注射bFGF)；Ⅲ组：治疗组，视神经损郑州大学2004届硕士研究生毕业论文神经干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的实验研究伤后局部注射NSCslxl护个，亦分为3个亚组:nIA组(伤后立即注射NSCs)，IllB组 (伤后iwk注射NsCs)和xxxe组(伤后4wk注射NSCs)。所有实验动物均在术后lwk和4wk制作损伤视神经电镜标本，观察超微结构改变，同时检测闪光视觉诱发电位(nash-visual evoked potential，F一vEP)的变化。 结果①体外培养的细胞生长状态良好，且Nestin表达阳性。②视神经超微结构变化:正常视神经结构清晰，轴突排列有序，髓鞘板层致密清晰;急性损伤视神经轴突和髓鞘两部分变化明显:轴突排列紊乱，肿胀扩大，髓鞘变薄，厚度不均，局部有破碎缺损，以粗纤维变化最为明显。阴性对照组(l组)上述改变进一步加重，lwk时部分轴突降解消失，残留的腔隙出现少量纤维组织，髓鞘进一步变薄，板层分离现象多见;4wk时，轴突变得透明空虚，胶质纤维填充腔隙，髓鞘变成薄膜样结构，并可见到泡状分离和碎屑。阳性对照组(n组):IIA组lwk时，轴突呈现大小不一的空泡样变性，部分降解遗留有残腔，髓鞘变薄，结构疏松;4wk时轴突仍有节断性变性崩解，残腔有胶质纤维填充，髓鞘仍可见局部缺损和板层分离;nB组lwk时，轴突数目稍有增多，仍可见部分轴突变性降解后遗留的残腔，髓鞘厚薄不均;4wk时残腔已被胶质增生物填充，其余变化不大;Ilc组lwk时，轴突数目稍有增多，髓鞘有所增厚，结构仍疏松;4wk时轴突微丝微管增多，部分轴突变性降解后的腔隙由胶质纤维填充，髓鞘板层结构有所修复。NSCs移植组(m组):nIA组lwk时，轴突数目开始增多，髓鞘结构仍疏松，局部有板层分离和崩解破损，许多新生小轴突外绕着薄层髓鞘;‘4Wk时，轴突内己发生变性坏死的区域，由大量胶质纤维填充，部分髓鞘进一步变性;mB组lwk时，轴突数目有所增加，部分轴突变性坏死遗留有小腔隙，有胶质纤维填充，髓鞘还未见明显修复，可见所生的小轴突，外绕以厚髓鞘;4wk时上述情况有好转，轴突数目进一步增加，微丝微管排列较整齐，髓鞘修复，但不完整，坏死区已形成胶质修复;mc组lwk时轴突数目明显增多，微丝微管数目也增多，排列较整齐，髓鞘有修复，仍不完整，坏死区己被胶质纤维填充;4wk时轴突和髓鞘进一步修复，轴突数目明显增多，微丝微管数目亦明显增多，分布较均匀，排列较整齐，髓鞘大部修复，板层结构清晰，未修复部位由胶质纤维填充。③F一vEP变化:大鼠正常眼F-vEP波形潜伏期短，振幅陡直;视神经急性损伤后波形低而宽;分组治疗后，n组F一vEP波形低缓，nl组波形较正常平缓，I组无波形诱出。④F一vEP各指标比较:视神经急性损伤后，损伤眼F，vEP各指标与自身健眼相比均有显着性差异切<0 .01)。NScs叁亚组lwk和4wk时，损伤眼各指标与自身健眼相比，亦均有显着性差异切<0 .01或p、0.05)。Nscs叁亚组lwk各指标(以左、右眼郑州大学2004届硕士研究生毕业论文神经干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的实验研究差值为统计量)与急性损伤组比较:
朱奇[5]2014年在《慢病毒介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理视神经损伤是眼科临床常见的眼外伤，严重者常导致视力永久性的丧失，是重要的致盲性眼病之一。目前临床上治疗本病主要以药物为主，如伤后给予大剂量激素的冲击治疗等，但治疗效果不明显，视力恢复程度较差，而且副作用较多，因此视神经损伤的视力恢复成为眼科界难以攻克的命题，寻找一种有效的治疗方法备受眼科学者的关注。视神经损伤的病理学研究证实视神经损伤后的主要病理改变是视网膜神经节细胞(RGCs)轴索发生溃变，轴浆运输障碍导致的视网膜神经节细胞的水肿和凋亡。因此，促进视神经损伤再生的首要条件为RGCs的存活，研究神经节细胞的相关凋亡机制并选择合适的方法对凋亡加以抑制是其存活的先决条件。国内外对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的研究已经趋于白热化，对其在各种诱导条件下分化成不同的细胞，通过移植治疗不同的疾病兴趣不减，但应用在眼科方面的研究报道不多。GAP-43是一种神经生长的相关蛋白，与神经发育与再生密切相关。本研究将GAP-43与骨髓间充质干细胞这两者热门研究结合到一起，通过建立了大鼠的视神经损伤模型，探究慢病毒介导GAP-43基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的可行性。第一部分构建慢病毒介导的GAP-43过表达及抑制表达载体目的：构建慢病毒介导的GAP-43过表达及抑制表达载体，并在293T细胞中测定病毒滴度。方法：1、慢病毒介导的GAP-43过表达载体的构建以pCDNA-GAP-43为模板，设计含NotI和NsiI酶切位点的上下游引物，将扩增的PCR产物和慢病毒载体LV5双酶切，将酶切产物以T4连接酶连接。感受态细胞转化后挑选正确的克隆酶切鉴定，经测序证实表达载体构建正确。应用Lipofectamine2000叁质粒系统包装慢病毒共同转染293T细胞，72h后收获病毒离心过滤，最后超速离心将沉淀重悬得到病毒储存液，测定病毒滴度。2慢病毒介导的shmRNA-GAP-43载体的构建构建针对靶基因的四个干扰质粒（Gap43-rat-619、Gap43-rat-844、Gap43-rat-1215、Gap43-rat-678）把这四个都有特定抗性表达序列的干扰质粒分别与前期构建的GAP-43过表达载体共转染293T细胞，选择出干扰效果最佳的质粒，然后构建慢病毒shmRNA-GAP-43克隆载体；用构建的慢病毒克隆载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。结果：1、经酶切和测序鉴定慢病毒过表达载体LV5-GAP-43序列正确。293T细胞包装后收获了病毒储存液，病毒滴度为2*108TU/ml。2、干扰载体在293T细胞中的干扰结果提示Gap43-rat-619干扰效果最佳，经酶切和测序鉴定慢病毒抑制表达载体LV3-GAP-43-shRNA序列正确。经过293T细胞包装后收获了病毒储存液，病毒滴度为2*108TU/ml。结论：成功构建GAP-43基因的过表达及抑制表达的慢病毒载体，并包装产生了慢病毒，在293T细胞中内证实了病毒滴度的高效性。第二部分慢病毒介导的GAP-43基因转染骨髓间充质干细胞表达的实验研究目的：大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定。将携带GAP-43基因的慢病毒转导至BMSCs，检测其过表达水平及细胞形态学变化。方法：单纯贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，倒置显微镜观察细胞生长形态，流式细胞学检查骨髓间充质干细胞标志抗原的表达青况。携带GAP-43的慢病毒以MOI=20感染BMSCs后，利用qPCR及Western blot检测GAP-43表达水平。观察GAP-43基因转染后BMSCs形态学变化，行RT-PCR检测NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA的表达情况。结果：培养的BMSCs为多角形或梭形，呈漩涡状排列生长。流式细胞学检查细胞表面标志抗原CD90、CD44高表达，而CD11b、CD34低表达情况。GAP-43-BMSCs经qPCR和Western blot检测证实有外源性GAP-43表达。GAP-43基因转染后BMSCs3天，BMSCs胞体开始收缩，折光性增强，细胞有突起伸出，5天时可见典型的神经样细胞形态改变，RT-PCR检测NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA表达阳性。结论：采用单纯贴壁法可在体外成功地分离、培养和纯化大鼠BMSCs。慢病毒介导的GAP-43能高效感染BMSCs，并随着时间延长分化成神经样细胞。第叁部分抑制GAP-43基因表达后骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究目的：抑制GAP-43基因表达后骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化研究方法：应用慢病毒介导的GAP-43-shRNA转染骨髓间充质干细胞，确定特异性筛选药物嘌呤霉素的浓度，利用qPCR及Western blot检测GAP-43表达水平。观察视网膜条件分化液条件下shmRNA-GAP-43基因转染后BMSCs形态学变化，行RT-PCR检测NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA的表达情况。结果：慢病毒介导的GAP-43-shRNA转染骨髓间充质干细胞，在视网膜条件分化液诱导条件下，qPCR和Western blot检测GAP-43、NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulinmRNA的表达，GAP-43-shRNA组较阴性对照组（BMSC组）GAP-43的表达明显减少，差异有统计学意义（p<0.05）。结论：抑制GAP-43基因后BMSCs向神经样细胞分化的能力被明显减弱。第四部分慢病毒表达载体介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞修复大鼠视神经损伤的实验研究目的：观察慢病毒表达载体介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞修复大鼠视神经损伤的作用及其相关机制，期望为视神经损伤治疗提供新思路，探索一条新途径。方法：采用钳夹视神经法建立大鼠视神经损伤模型。120只大鼠随机均分为假手术组（Sham组）、溶剂对照组（PBS组）、空载慢病毒组（GFP/BMSCs组）、GAP-43重组慢病毒组（GAP-43/BMSCs组）和shRNA-GAP-43/BMSCs重组慢病毒组（shRNA-GAP-43/BMSCs组），每组24只，按术后3天、7天、14天、28天均分为4个亚组，将5ul1×PBS溶液或1×105/眼细胞数注射到视网膜下腔。HE染色观察细胞移植后视网膜病理变化。采用Western-blot检测各实验组大鼠视网膜GAP-43蛋白表达，Realtime PCR检测视网膜组织GAP-43mRNA表达变化。结果：在视神经损伤模型建立后第3、7、14、28日，GAP-43/BMSCs组的视网膜病理改变均明显轻于其他各组。此外，与sham组，PBS组、GFP/BMSCs组、shRNA-GAP-43/BMSCs组相比，GAP-43/BMSCs组视网膜组织GAP-43基因的mRNA及蛋白表达表达上调，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。结论：成功构建大鼠视神经损伤模型。慢病毒介导的GAP-43转染BMSCs移植到视网膜下腔可以高效表达GAP-43基因，在神经修复过程中起到了一定的作用。
赵琳, 范建国, 马志中[6]2006年在《大鼠视神经不完全损伤后自发性再生的实验研究》文中提出目的观察大鼠视神经夹伤后轴突中神经生长相关蛋白-43(GAP-43)的表达变化,探讨大鼠视神经部分损伤后自发性再生的可能性。方法在眼球后2mm处用反向镊以不同的作用时间夹持视神经,制作不同损伤程度SD大鼠视神经夹伤模型,采用免疫组织化学技术和RT-PCR技术检测损伤后不同时间点GAP-43及其mRNA在受损视神经轴突中的表达。结果免疫组织化学结果显示,损伤后2个月时轻、中、重组GAP-43表达水平几乎同时达到高峰,轻度损伤组表达水平最高。RT-PCR结果表明,轻、中、重不同损伤组之间及不同恢复时间点的GAP-43mRNA表达水平有差别。结论大鼠视神经部分(不完全)损伤后存在自发性再生的现象,再生的程度与损伤的程度密切相关。
申永刚[7]2003年在《大鼠视神经不全损伤动物模型的建立及重组人睫状神经营养因子对视神经不全损伤后视网膜节细胞保护作用研究》文中研究指明目的 建立实验性大鼠视神经不同程度不全损伤模型，在此基础上观察重组人睫状神经营养因子对视神经不全损伤后视网膜节细胞的保护作用。方法 用同一把大号无创血管夹在球后1.5mm处分别钳夹成年大鼠视神经5秒、10秒、20秒、40秒，7天后取材观察不同致伤量对视神经病理、超微结构的影响；钳夹前及钳夹后即时、3天、7天、14天、28天时观察F-VEP变化情况，并以轴突占视神经横截面积的比例和F-VEP恢复程度作为划分损伤程度的标准。以大鼠视神经中度损伤为模型，实验组伤后即时、7天、14天、28天时玻璃体腔内注射rhCNTF 溶液2μl (1μg/μl)，对照组注射等量蒸馏水（rhCNTF溶剂）。伤后7天、14天、28天、56天取材检测。1.取材前48小时每组部分大鼠用粒蓝逆行标记RGCs，48小时后取视网膜荧光显微镜下观察、计数RGCs密度。2.用RT-PCR方法检测、观察rhCNTF对视网膜组织表达GAP-43mRNA 影响。3.用免疫组化方法检测、观察rhCNTF对视网膜组织GAP-43、GFAP蛋白表达的影响。结果1、以大号无创血管夹钳夹视神经不同时间，可以造成视神经轻，中，重度不全损伤。2、轻度损伤（5秒）后7天轴突占视神经横截面积比例为74.11%，F-VEP潜伏期恢复正常，伤后28天时振幅恢复至正常的70.00%；中度损伤（10秒）后7天轴突所占面积比例约等于54.71%， F-VEP潜伏期恢复正常，伤后28天时振幅恢复到正常的33.99%；重度损伤（20秒、40秒）后7天轴突占面积比例为30.80%-15.14%，伤后28天F-VEP潜伏期仍未恢复正常，振幅只恢复到正常的31.04%-22.58%。3、rhCNTF可以促进中度视神经不全损伤后RGCs的存活。实验组伤后7天、14天、28天、56天时RGCs存活率分别为70.18%、53.09%、37.30%、23.97%；对照组分别为42.25%、31.61%、14.92%、8.51%。伤后7天、14天实验组和对照组相比有非常显着差异(p<0.01)，伤后28天、56天两组间有显着差异（p<0.05）。4、免疫组化结果显示伤后7天两组间GAP-43表达差异不明显，伤后14天、28天、56天实验组GAP-43表达呈强阳性，对照组表达呈弱阳性。伤后7天、14天、28天、56天实验组GFAP蛋白表达强于对照组。<WP=7>5、RT-PCR结果显示，伤后7天两组GAP-43mRNA表达都较弱,两组之间差异不明显，伤后14天、28天GAP-43mRNA在视网膜组织表达呈强阳性，对照组表达呈弱阳性,两组间表达差异明显。伤后56天实验组GAP-43mRNA仍较高,对照组表达微弱。结论：1、用大号无创血管夹于球后1.5mm处钳夹视神经5秒，可以造成视神经轻度不全损伤；钳夹10秒造成中度不全损伤；钳夹大于20秒造成视神经重度不全损伤。其中视神经中度不全损伤比较适合用于研究各种干预因素对视神经损伤后神经保护与修复的作用。2、rhCNTF玻璃体腔内重复注射可以促进视神经中度不全损伤后RGCs的长期存活，对RGCs起到保护作用；并且可以促进视神经中度不全损伤后视网膜组织GAP-43mRNA、GAP-43蛋白的表达，可能在视神经损伤后的再生、修复中起重要作用。3、rhCNTF玻璃体腔内重复注射可以促进视网膜组织GFAP蛋白的表达，提示rhCNTF可能也通过间接的途径对RGCs起保护作用
周丹[8]2009年在《人脐血干细胞移植治疗大鼠外伤性视神经部分损伤的实验研究》文中指出外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)病情复杂,预后不良,常遗留永久性视力损害。因此应积极处理以挽救视力。目前TON的治疗方法有药物治疗、手术治疗以及药物和手术联合治疗,但各种治疗方法的疗效差别很大。近期有学者提出采用移植干细胞治疗视神经损伤的构想,并已在动物实验中取得了一定的进展,因此该方向很可能成为TON治疗中的一条有效的、崭新的途径。干细胞是指一类具有高度增值和自我更新能力,并具有多项分化潜能的原始细胞,随着干细胞技术的不断发展及干细胞本身所具有的生物学特性,体外培养某些干细胞,定向诱导分化为所需的组织细胞以治疗某些疾病已成为当前研究的热点。脐血是干细胞的主要来源,作为外周血,其取材方便,来源广泛,加之脐血中富含的间充质干细胞具有免疫调节及加速造血恢复等特点,因此,脐血的移植成功率高,移植反应弱,移植物抗宿主病少见。视神经作为视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的轴突,其损伤与RGCs的凋亡密切相关。本实验用夹持法制作了大鼠外伤性视神经损伤模型,并采用闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potentials,F-VEP)、苏木精-伊红(hematomylin-eosin,HE)染色、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)以及RT-PCR等方法,对损伤后视神经和RGCs的存活情况,以及人脐血干细胞移植对外伤所致的大鼠RGCs是否具有保护作用及其可能机制进行了较为详细的实验研究。第一部分人脐血干细胞移植对大鼠外伤性视神经部分损伤闪光视觉诱发电位的影响目的观察大鼠外伤性视神经部分损伤模型中F-VEP的改变;研究人脐血干细胞移植对大鼠外伤性视神经部分损伤F-VEP修复的影响。方法健康成年96只SD大鼠随机分为视神经钳夹30s(中度损伤)组及60s(严重损伤)组,每组48只,所有大鼠的左眼为损伤眼,右眼为正常对照眼。两组按视神经损伤后处理方式的不同随机分为损伤组(A组)和治疗组(B、C、D组),每组均为12只,A组不予以药物治疗,治疗组分别予以玻璃体腔内注射神经营养因子(B组)、人脐血干细胞(C组)、人脐血干细胞+神经营养因子混合液(D组)。大鼠的损伤眼均以夹持力为40g的特制视神经夹,在大鼠眼球后2mm处夹持视神经30s或60s,制成大鼠外伤性视神经部分损伤模型。所有大鼠均在损伤后1小时、1周、2周、3周和4周分别进行损伤眼和正常对照眼的F-VEP检查,记录波幅及峰潜时,并进行统计分析。结果1.正常对照眼的F-VEP:所有大鼠正常对照眼的F-VEP的波形稳定,随时间延长均无明显变化。其波幅波动于12.7±0.6μV:峰潜时波动于73.8±3.2ms。2.损伤组(A组)的F-VEP:所有大鼠损伤眼的F-VEP的潜伏期明显延长,振幅明显降低。钳夹30s组,在损伤后1小时、1周、2周、3周和第4周,其波幅分别为6.41±0.6μV、5.38±0.6μV、4.56±0.76μV、3.78±0.53μV和3.17±0.75μV,P1峰潜时依次为86.5±1.2ms、100.6±3.3ms、109.6±7.2ms、111.2±8.1ms和104.2±4.9ms;钳夹60s组,依上述时间点,其波幅各自为6.32±0.4μV、5.27±0.4μV、4.41±0.56μV、3.60±0.32μV和2.99±0.51μV,P1峰潜时分别为81.4±1.0ms、95.5±3.1ms、104.5±7.0ms、106.1±8.3ms和99.3±3.9ms。3.神经营养因子移植组(B组)的F-VEP:钳夹30s组,在损伤后1小时、1周、2周、3周和第4周,其波幅分别为6.46±0.9μV、6.00±0.7μV、5.89±0.8μV、5.29±0.65μV和4.27±0.57μV,P1峰潜时依次为86.9±1.5ms、95.7±2.7ms、97.2±6.9ms、102.6±4.4ms和98.1±4.5ms;钳夹60s组,依上述时间点,其波幅各自为6.37±0.7μV、5.89±0.6μV、5.74±0.60μV、5.11±0.44μV和4.09±0.38μV,P1峰潜时分别为82.0±1.2ms、90.7±2.5ms、92.3±6.5ms、97.5±4.3ms和94.2±3.5ms。4.人脐血干细胞移植组(C组)的F-VEP.钳夹30s组,在损伤后1小时、1周、2周、3周和第4周,其波幅分别为6.54±1.2μV、6.08±1.0μV、5.97±1.1μV、5.37±0.9μV和4.39±0.65μV,P1峰潜时依次为87.2±2.5ms、91.8±1.8ms、93.2±6.6ms、98.6±3.8ms和94.1±3.8ms;钳夹60s组,依上述时间点,其波幅各自为6.45±1.0μV、5.97±0.8μV、5.82±0.90μV、5.20±0.85μV和4.23±0.55μV,P1峰潜时分别为82.7±2.0ms、86.2±1.8ms、88.7±6.3ms、93.6±3.5ms和89.8±2.7ms。5.混合药物移植组(D组)的F-VEP:钳夹30s组,在损伤后1小时、1周、2周、3周和第4周,其波幅分别为6.61±1.4μV、6.15±1.2μV、6.04±1.3μV、5.67±1.1μV和4.82±0.95μV,P1峰潜时分别为87.5±2.0 ms、89.5±1.6 ms、91.2±6.0 ms、96.6±3.2 ms和91.9±3.0ms:钳夹60s组,依上述时间点,其波幅各自为6.52±1.2μV、6.04±1.0μV、5.89±1.1μV、5.51±1.0μV和4.66±0.85μV,P1峰潜时分别为82.9±2.2 ms、84.5±1.6 ms、86.6±6.0 ms、91.6±3.0 ms和85.5±2.0ms。6.损伤组与正常对照眼的比较:无论钳夹30s组还是钳夹60s组,与正常对照眼相比,损伤眼的F-VEP的波形均在损伤后1小时即出现明显变化:各时间点波幅和峰潜时与正常对照眼相比,差异均有统计学意义(P＜0.01)。钳夹30s组和钳夹60s组的波幅和峰潜时比较,各个时间点的差异均有统计学意义(P＜0.05)。随损伤后观察时间的推移,F-VEP的波幅逐渐降低,潜伏期明显延长,两者均于第3周达到高峰。7.损伤组与治疗组之间的比较:波幅:无论是钳夹30s组还是钳央60s组,在损伤后各个时间点,损伤组与各治疗组之间的两两比较,差异均有统计学意义(1小时和1周时P＜0.05,余时间点P＜0.01);损伤后第3周,损伤组与各治疗组之间波幅差异最大,钳夹30s组中,A、B、C、D各组的波幅分别为3.78±0.53μV、5.29±0.65μV、5.37±0.9μV、5.67±1.1μV;钳夹60s组中,A、B、C、D各组的波幅依次为3.60±0.32μV、5.11±0.44μV、5.20±0.85μV、5.51±1.0μV。锋潜时:钳夹30s组和60s组中,损伤组与各治疗组之间的两两比较,除损伤后1小时组的差异无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点的差异均有统计学意义(1周P＜0.05,2、3、4周P＜0.01);损伤后第2周,损伤组与各治疗组之间的峰潜时差异最大,钳夹30s组中,A、B、C、D各组的峰潜时分别为109.6±7.2ms、97.2±6.9ms、93.2±6.6ms、91.2+6.0ms钳夹60s组,A、B、C、D各组的峰潜时分别为104.5±7.0ms、92.3±6.5ms、88.7+6.3ms、86.6±6.0ms。损伤后第4周,30s组和60s组的峰潜时均较前缩短。8.钳夹30s组和钳夹60s组之间的比较:无论是波幅还是峰潜时,在损伤后相同时间点的两两比较,二者的差异均具有统计学意义(P＜0.01),与30s组相比,60s组的波幅明显降低,潜伏期延长。9.各个治疗组之间的比较:钳夹30s组和60s组,自第1周开始后的各个时间点,D组(混合药物移植组)的波幅均高于B组(神经营养因子移植组),锋潜时的峰值较之缩短,差异均有统计学意义(P＜0.05):其余各治疗组之间在相同时间点的两两比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论1.正常大鼠的视神经用夹持力为40g的视神经夹夹持30s或60s后,可造成视神经的部分损伤,表现为被夹持视神经F-VEP的波幅明显降低,峰潜时明显延长;视神经被夹持的时间越长,其受损程度越重,F-VEP的改变越明显;伤后观察时间越长,F-VEP的潜伏期延迟越显着,波幅降低程度越大,F-VEP的熄灭越早。2.神经营养因子、人脐血干细胞和人脐血干细胞+神经营养因子混合液对大鼠外伤性视神经部分损伤后视神经传导功能的恢复有促进作用,人脐血干细胞和神经营养因子的联合使用,可以提高其促进神经传导功能恢复的作用。第二部分人脐血干细胞移植对大鼠外伤性视神经部分损伤保护作用机制的探讨目的观察大鼠外伤性视神经部分损伤后其RGCs形态学以及内质网应激相关因子GRP78和CHOP表达的改变;探讨人脐血干细胞对外伤所致的大鼠RGCs是否具有保护作用及其可能机制。方法102只健康成年SD大鼠建立外伤性视神经部分损伤模型(视神经钳夹60s),所有大鼠左眼均为损伤眼,右眼为正常对照眼。随机分为叁组:A组(HE染色组)30只,B组(TUNEL检测组)36只,C组(RT-PCR检测组)36只。A组又随机分为A_1、A_2两组,各15只,A_1组为损伤组,视神经钳夹60s,仅制作视神经部分损伤模型,A_2组为人脐血干细胞移植组(治疗组),即在制作视神经部分损伤模型后立即予以玻璃体下腔注射脐血干细胞;两组均在制模后3d、7d、14d、21d和28d处死动物,并应用光镜观察大鼠RGCs形态学的改变。B组和C组又分别分为两组:B_1、B_2组和C_1、C_2组,每组18只大鼠,B_1组和C_1组为损伤组,仅制作模型而不进行药物治疗;B_2组和C_2组为治疗组,制作视神经部分损伤模型后立即予以玻璃体下腔注射人脐血干细胞。在损伤后3h,12h,24h,48h,72h和1w,B组行TUNEL,C组行RT-PCR,以检测凋亡细胞和内质网应激相关蛋白的表达。结果RGCs的数量(个/10个视野):正常对照组:随损伤后观察时间的延长,A组正常对照眼RGCs的数量无明显变化,在术后3d、7d、14d、21d和28d,RGCs数量分别为46.56±1.87、45.38±0.65、46.35±0.96、45.98±1.02和45.65±0.97,相邻各时间点两两比较,RGCs数量的差异无统计学意义(P＞0.05);损伤组(A_1组):钳夹视神经60s后,A_1组RGCs的数量严重减少,在术后3d、7d、14d、21d和28d,RGCs数量分别为30.50±1.31、27.03±1.22、20.16±0.87、18.16±0.84和15.68±0.79。在损伤后14天内,RGCs数量减少较快。与正常对照组相比,术后第14天时RGCs的数量减少50%左右:第14天以后,RGCs数量缓慢减少;第28天时,RGCs数量较正常组丢失60%左右。与正常对照组相比,在损伤后各个时间点,RGCs数量的差异均有统计学意义(P＜0.01);治疗组(A_2组):A_2组RGCs数量降低趋势较缓和,损伤后3d、7d、14d、21d和28d,RGCs数量分别为40.13±1.31、36.22±2.67、32.26±1.43、31.61±0.76和30.31±0.51;治疗组与正常对照组,或损伤组相比,在损伤后5个不同时间点RGCs数量的差异均有统计学意义(P＜0.01)。TUNEL阳性细胞率:损伤组(B_1组):损伤后3h、12h、24h、48h、72h和1w时TUNEL阳性细胞率依次为4.23%±1.19、6.21±1.03%、15.33%±2.78%、39.41±1.86%、58.83%±8.36%和41.15%±6.37%。相邻各时间点的两两比较,其凋亡细胞数量的差异有统计学意义(P＜0.01);治疗组(B_2组):损伤后3h、12h、24h、48h、72h和1w时,其TUNEL阳性细胞率分别为0、0、0、12.33±2.63%、34.23%±1.98%和22.13±1.93%。自损伤后24h开始,相邻各时间点的两两比较,其凋亡细胞数量的差异有统计学意义(P＜0.01);损伤组在伤后3h内核层即可见少量凋亡细胞,治疗组在伤后48h方可见凋亡细胞,两组的凋亡细胞数量均在伤后72h达高峰,并在1w时逐渐减少。在相同时间点的两两比较,损伤组与治疗组的TUNEL阳性细胞数量的差异有统计学意义(P＜0.01)。GRP78与CHOP的表达:GRP78:在损伤后3h、12h、24h、48h、72h和1w,损伤组(C_1组)GRP78mRNA的OD值依次为1.221±0.12、1.313±0.22、1.226±0.18、1.220±.14、1.197±0.10和1.190±0.09;治疗组(C_2组)GRP78mRNA的OD值分别为1.732±0.21、2.370±0.18、2.251±0.22、2.038±0.15、1.945±0.09和1.835±0.12;在同一时段,治疗组与损伤组相比,GRP78的差异均有统计学意义(P＜0.01);CHOP:在损伤后3h、12h、24h、48h、72h和1w,损伤组(C_1组)CHOPmRNA的OD值依次为2.251±0.21、2.31±0.15、2.370±0.14、2.038±0.09、1.945±0.12和1.835±0.12:治疗组(C_2组)CHOPmRNA的OD值分别为1.226±0.22、1.262±0.14、1.313±0.21、1.220±0.18、1.197±0.11和1.190±0.09;在相同时间点,治疗组与损伤组相比,CHOPmRNA的差异均有统计学意义(P＜0.01);损伤后GRP78和CHOP的表达在损伤组和治疗组均出现上升,GRP78的表达在损伤后12h达高峰,其在治疗组的变化高于损伤组;CHOP的表达在伤后24h达高峰,其在治疗组的表达较损伤组微弱。结论1、大鼠外伤性视神经部分损伤后,其RGCs的丧失以凋亡为主,且随大鼠存活时间的推移,RGCs呈渐进性丧失。2、内质网应激机制参与了外伤所致大鼠视神经部分损伤引起的RGCs凋亡。3、人脐血干细胞可明显延缓外伤所致大鼠视神经部分损伤引起的RGCs凋亡,对RGCs损伤提供保护部分作用。
柳浩然[9]2006年在《神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究》文中研究表明视神经损伤(optic nerve injury，ONI)是颅底骨折的常见并发症，也是致盲的重要因素之一，由于视神经是中枢神经系统的一部分，其损伤后的再生能力非常有限，目前临床尚缺乏行之有效的治疗手段，为此寻找促进神经再生和修复的有效方法成为治疗视神经损伤也是现代神经生物领域的热点。近年来，随着对视神经损伤机制的深入研究，其治疗方法逐渐多样化，周围神经、嗅鞘细胞、雪旺细胞移植及神经营养因子注射等已见较多实验研究报道，虽取得了一定进展，但由于来源限制或组织移植物引起免疫排斥反应、疗效持续性短暂等问题，限制了其临床应用。 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植目前在许多中枢神经系统疾病的治疗研究中显示了其巨大的潜力和优势，其中，干细胞移植治疗脑血管疾病、肌萎缩侧索硬化、帕金森综合征、脊髓损伤、青光眼及缺血引起的视力下降等疾病已取得了可喜的成果，由于NSCs具有不断更新、自我增殖和多向分化潜能等特性，使之成为较为理想的移植细胞源。本课题组在以往几年对NSCs培养和移植的相关研究的基础上，采用玻璃体下腔注射NSCs移植治疗视神经部分损伤的动物模型，观察NSCs在视网膜内的存活、迁移与分化，通过研究NSCs移植后视网膜节细胞的变化及其对视觉电生理的影响，即形态学及功能恢复两个方面来探讨NSCs对ONI的治疗保护作用，并且进一步深入探讨了NSCs对视神经损伤保护功能的机理。由于视神经损伤后神经营养因子的剥夺是导致节细胞凋亡的根本原因之一，而有研究表明NSCs在体外体内均可分泌神经营养因子，那么移植的NSCs是否通过在视网膜内分泌神经营养因子来保护受损视神经呢?本研究对此进行了验证。论文各部分均进行了较为详细的时间分段比较，
丁慧芳[10]2017年在《PKC/NF-κB在大鼠晶状体损伤后促进视神经再生的研究》文中研究表明视神经是中枢神经系统的重要组成部分,随着哺乳动物中枢神经系统的成熟,视神经损伤后的再生修复将变得极其困难。临床上大多数创伤性视神经疾病、退行性视觉通路疾病或缺血性视神经损伤的患者将承受不可逆的视力损害,更严重的会导致视力完全丧失,因此关于视神经损伤后再生修复的研究对于患者视力的提高及生活自信心的增强有重要的实践意义。视神经的起始部是视网膜处的视盘,而视网膜的视盘处汇集了大量视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)的轴突。在高等动物中,视网膜视觉输出的相关细胞只有RGCs,所以关于视神经损伤后视网膜神经节细胞的探讨对视网膜的再生修复来说是很有必要的。目前,关于视神经损伤后修复再生的方向主要关注于如何在视神经损伤后保留更多的RGCs、如何使保留的RGCs轴突延长、如何恢复视觉靶点之间的联系和功能叁个方面。晶状体损伤如何促进受损视神经的再生是当今科研范畴的一大热点和难点。国内外学者从调节各个细胞内信号通路、清除再生抑制因子、激活神经胶质细胞、单独或联合应用神经营养因子等方面进行了一系列深入的探讨,从不同方面都证明了大鼠视神经损伤伴晶状体损伤可以在一定水平上促进视神经的再生。本课题组对神经损伤后视网膜中Müller细胞、Nogo-AmRNA及Nogo-A的表达,巨噬细胞、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、锌指蛋白核转录因子4(Kruppel-like transcription factor 4,KLF4)、白血病抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF)的实验研究中,一方面从不同的角度运用了不同的方式探索了视神经晶状体联合损伤促进受损视神经的再生修复的机制,另一方面也为视神经损伤后的治疗策略的制定、治疗药物的选用、治疗效果的评估提供了新的思路。本次通过对视神经损伤伴晶状体损伤PKC活性与NF-κBp65蛋白表达量的研究,对晶状体损伤后促进视神经再生的机制进行更深一步的探索。目的通过对单纯视神经钳夹损伤及视神经钳夹损伤联合晶状体损伤大鼠视网膜中PKC活性与NF-κBp65蛋白表达量的研究,初步探讨视神经损伤伴晶状体损伤促进视神经再生修复的作用机制,证实晶状体损伤可通过对PKC与NF-κBp65表达的调节来发挥保护视网膜神经节细胞的作用,为临床治疗视神经损伤提供新的靶点和思路。方法清洁健康Wistar成年大鼠60只,雌雄不分,按随机数字表法分成四组:正常对照组6只(即A组),假手术组18只(仅暴露而不损伤视神经组,即B组),视神经钳夹损伤组18只(即C组),视神经钳夹损伤联合晶状体损伤组18只(即D组)。A组于正常饲养7d后麻醉过量处死大鼠6只,B组、C组、D组于术后7d、14d、21d分别麻醉处死大鼠各6只。各组每个时间点取2只大鼠行荧光金逆行标记后RGCs进行观察并计数,2只应用氚标记的二丁酸佛波醇脂(([3H]PDBu))检测各组大鼠不同时间点视网膜PKC的活性变化,2只行Western blot检测视网膜NF-κBp65蛋白的表达情况。结果1荧光金标记的大鼠视网膜神经节细胞在荧光显微镜下观察A组及B组大鼠视网膜铺片中荧光金标记的RGCs,可见被荧光金标记的RGCs的形态学特征具有特异性,呈金黄色,形状大多数为圆形或椭圆形,边界较清晰,大小不一,部分细胞突起清晰可见,A组及B组RGCs分布在各个时间点比较稳定。而C、D组视网膜铺片,随着钳夹损伤时间的增加,RGCs的分布逐渐稀疏,RGCs的形状缩小变圆,荧光着色增强,突起肿胀或消失。损伤后7d、14d、21d同一时间点C、D组与B组RGCs计数及标识率相比,差异均有统计学意义(均P<0.05);同一时间点,D组RGCs计数高于C组,且差异均有统计学意义(均P<0.05);而A、B两组RGCs计数相互比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。2各组PKC活化水平之间相互比较A组及B组PKC活化水平基本稳定,C组及D组视网膜在伤后7d、14d、及21d均可见PKC的活性增加,PKC的活性在视神经钳夹伤后7d后显着增加,并在视神经钳夹伤后14d达到高点,在21d在仍维持较高水平。B组暴露视神经后7d、14d、及21d的PKC活性与A组PKC的活性相比差异无统计学意义(P>0.05);C组及D组视神经钳夹伤后7d、14d、21d与B组同一时间点PKC的活性相比有统计学意义(P<0.05);同一时间点,D组神经钳夹伤后PKC的活性高于C组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。3各组NF-κB p65蛋白表达量之间相互比较A组、B组NF-κB p65蛋白表达量相互比较,差异无统计学意义(P>0.05),C组及D组视网膜视神经钳夹伤后可见NF-κB p65蛋白表达量增加,在视神经钳夹伤后14d后达到高点后开始下降。在相同时间点C、D两组相互比较,C组神经钳夹伤后的NF-κB p65蛋白表达量高于D组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.随着视神经钳夹损伤后时间的延长,RGCs计数不断下降,PKC活化水平及NF-κBp65磷酸化水平不断增高至最高点后开始下降。2.视神经钳夹损伤后,晶状体损伤可以上调PKC活化水平,下调NF-κB p65蛋白表达量。3.视神经损伤后,PKC及NF-κB可能参与了晶状体损伤保护神经节细胞的机制。
参考文献：
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[9]. 神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究[D]. 柳浩然. 中南大学. 2006
[10]. PKC/NF-κB在大鼠晶状体损伤后促进视神经再生的研究[D]. 丁慧芳. 郑州大学. 2017
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