摘要：代谢组学是“后基因时代”的一门新型学科，其与基因组学、蛋白组学同是系统生物学的重要组成部分。代谢组学主要研究的是生物体受扰动前后（生理或病理前后）小分子代谢物，筛选与疾病相关的生物标志物，从而从代谢角度揭示其机理。目前，代谢组学在癌症疾病的应用越来越广泛，如肿瘤标志物的筛选、癌症的筛查。近年来，国内外的研究学者分析了癌症患者的特征图谱，以求在癌症的诊断与治疗中寻求到更为坚实的理论依据，为癌症的治疗提供新视觉。本文主要讲述了代谢组学在肺癌、肝癌及乳腺癌中的应用。
关键词：代谢组学；质谱；肝癌；肺癌；乳腺癌
Abstract：Metabolomics is a new discipline in the "post-gene era", which is an important part of system biology together with genomics and proteomics. Metabolomics is targeted on the small moleculars of organism before and after the disturbance (physiological or pathological), screening biomarkers related to diseases, so as to reveal their mechanism from the perspective of metabolism. At present, metabolomics is widely used in cancer diseases, such as the screening of tumor markers and cancer screening. In recent years, domestic and foreign researchers have analyzed the characteristic map of cancer patients, in order to seek more solid theoretical basis in the diagnosis and treatment of cancer, and provide new vision for the treatment of cancer. This article mainly describes the application of metabolomics in lung cancer, liver cancer and breast cancer.
Key words：Metabolomics；Mass spectrometry；liver cancer；lung cancer；breast cancer
1 代谢组学
代谢组（Metabolome），是指生物体内源性代谢物质的动态整体(1)。代谢组学（Metabolomics），一词源于代谢组，指的是生物体（小到细胞，大到组织或生物体本身）受外部因素干扰（如环境的改变或基因突变）所产生的小分子代谢产物的变化或生物体随时间变化对其代谢物进行研究的一门学科，以实现对体液、细胞及组织提取物等复杂的生物样本中所有代谢产物的定性、定量为研究目标(2)。代谢组学通常分为靶向代谢组学（Targeted Metabolomics）与非靶向代谢组学（Untargeted Metabolomics）。靶向代谢组学主要监测一种或几种与研究目的相关的目标代谢产物。选择特异性的样本前处理方法，优化色谱分离及质谱条件对目标代谢物进行最优化检测，从而对目标代谢物进行绝对定量研究(3)。非靶向代谢组学则为无目的性代谢分析，主要设计思路为实验组与对照组相比较，以寻找代谢差异的一种研究方法。运用质谱、核磁等高通量技术检测生物体受外部刺激前后体内大多数小分子代谢物的动态变化，重点寻找在实验组和对照组中有显著变化的代谢物，进而研究这些代谢物与疾病、药物毒理研究等相关关系(4)。可以通过非靶向代谢组学寻找差异物，然后通过靶向代谢组学进一步定性定量验证。
2 代谢组学研究方法
代谢组学研究起始于生物学问题，经过实验设计、样本采集、数据获取、数据预处理与数据分析等步骤，获得最具有生物意义的化学特征（MS或NMR），随后对标志物做进一步的功能性验证或者代谢通路分析，其研究流程如下图1。
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图1 代谢组学研究流程图
生物体内代谢物的数量尚无定论，有说4000-20000，亦有研究者指出大约有1000-200000。这些物质的极性、浓度大小及质核比范围构成了物质检测的多样性。该多样性对于物质的检测技术提出了多重挑战，无论从物质的检测还是物质的定量方向。到目前为止，还没有一种检测技术可以鉴定所有类别的化合物，一般都采用几种技术的联合利用对于物质的检测起到互相补充的作用。目前，应用比较广泛的鉴定技术有核磁共振技术（Nuclear magnetic resonance, NMR）和质谱技术（Mass spectrometry）。
2.1 质谱技术
质谱分析是一种测量分子质核比的分析方法，其基本原理是样本在离子源中发生电离，在库仑力的作用下爆破形成带电荷的离子，后经加速电场的作用，形成离子束、进入质量分析器。在质量分析器中，利用电场和磁场的作用，将物质信号聚焦从而得到质谱图，从而确定其质量(5)。质谱仪可以采用直接进样技术（Direct infusion，DI），进行物质的定性与定量分析。质谱仪的直接进样技术，样品通过爆热探头进行迅速汽化，并直接进入离子源电离后进行质谱分析。该技术具有一定的局限性，适合于组分含量单一的样品。它具有分析速度快，样品预处理简单、样品损失少等优点(6)。流动注射质谱（Flow-injection mass spectrometry，FI-MS）是将样品以流动注射方式直接注入质谱仪快速分析，该进样方式可以省去色谱条件的优化并能降低流动相对于质谱检测的影响。有研究报道了该进样技术可适用于复杂基质中低残留药物的高通量定量分析；但该技术的主要缺点是样本前处理需要相对严苛刻的过程以避免基质效应的干扰，因此也限制了该技术的广泛应用(7)。在DI-MS和FI-MS的实际应用中，样本和基质的共洗脱模式增加了样本的复杂程度，会降低样本的分辨率和灵敏度。为了解决这个问题，基于MS的代谢组学平台，常与气相色谱（Gas chromatography）、液相色谱（Liquid chromatography）串联运用。色谱的优势在于分离能力，为混合物的分离提供了最为有效的选择。气相色谱法是以惰性气体作为流动相，其基本分离原理是利用组分在气相和固定相的分配系数不同而得以分离，汽化后的试样被载气带入分离系统，借助固定相对各组分的吸附能力不同，使得组分在色谱柱分离。液相色谱法是色谱法的一个重要分支，其以液体为流动相，高压输液系统提供动力将流动相泵入分离系统，固定相对各组分的吸附能力不同得以分离，随后进入检测器，实现了整个分离检测过程。GC-MS主要检测的是易挥发或衍生后易挥发的物质。LC-MS分析中等极性、极性、不易挥发、高分子量及对热不稳定的化合物。LC-MS常与电喷雾离子化技术（ESI）、大气压化学离子化技术（APCI）组合进行物质的检测。ESI为软电离技术、通常只产生分子离子峰，主要针对于极性较强的化合物；而APCI通常作为ESI源的补充，主要分析中等极性和弱极性小分子化合物(8, 9)。离子化技术的联合使用拓宽了物质的检测范围。
3 代谢组学流程
3.1 样本的采集与预处理
代谢组学涵盖样本范围较为广泛，主要包括血液、尿液、脑脊液、唾液提取液或细胞提取物等(10)。而样本的选择主要考虑实验的研究目的，样本的收集难易程度及主要的分析检测平台。血液与尿液是研究人类代谢组学最常用的样本。在研究人体肠道消化吸收时，也会将粪便作为研究样本(11)。在样品采集过程中，血液样本需要加入含抗凝剂的收集管(肝素类抗凝剂不建议用、可用EDTA和柠檬酸钾抗凝剂)的收集管(12)。收集到的样本一般储藏在-80℃冰箱待测。对于血液样本，特别需要注意的是血浆与血清的分离过程，该过程需要在4℃环境下进行分离，分离的条件与程度会直接影响代谢结果，这也可能是后续血液组学分析误差的主要来源之一(13)。目前普遍认为血液样品采集到细胞的分离不超过35min，因为延长等待时间可能会使细胞中葡萄糖代谢持续，增加乳酸水平；此外，在实验中还应该避免反复的冻融步骤，避免样本代谢物的损失(14)。与血液样本相比，尿液由于其蛋白含量较低，处理过程想对简单，代谢物的提取过程想对简单，但由于尿液中尿素含量较大，在尿液样本处理时可以采用净化柱进行处理(15)。在处理组织时，需要对组织进行均值化和溶解以进行代谢物的释放。分析细菌代谢物时，应注意细胞的及时淬灭及代谢物的提取方式(16)。
3.2 数据采集与预处理
经前处理后的样本，需要对其进行数据采集。为了保证实验的稳定性，首先要确保仪器的稳定性。在样本分析之前，需要采集标准物质对仪器进行调谐，LC-MS标准物质的选取一般采用稳定性较好的化合物，以监测质谱的灵敏度和分辨率状态。GC-MS一般采用稳定、可挥发性物质进行调谐。组学样本一般采取梯度方式进行洗脱，洗脱液中可以添加离子对试剂对色谱峰进行优化，离子对试剂可采用可挥发性酸、碱及缓冲盐溶液。在获取代谢组学数据进行统计分析之前，需要对原始数据进行预处理，主要包括数据转换、信号提取、基线校准、信号校正和数据归一化(17)。数据标准化主要包括数据缩放、缺省值的筛查与异常值的删除(18)。代谢组学特别需要考虑的是个体因素对于结果的影响。在处理人体代谢组学样本时，要考虑个体因素（年龄、性别、饮食情况等）对结果的影响，变量统计方法能够处理这些参数数据。根据变量可分为单变量和多变量分析。单变量分析主要包括t检验与方差分析（ANOVA）等方法(19)。多变量分析主要分为无师监督（unsupervised）和有师监督(supervised)。无师监督包括主成分分析（principle component analysis，pca）、聚类分析（cluster analysis），无师监督主要用于识别样本的分类情况。主成分分析，是一种降维分析方法，是将多个变量通过线性变换选出较少个数变量的一种多元统计分析方法。聚类分析，是将数据分类到不同的类或者簇的过程，该分析方法主要计算法则是同簇有较大的相似性，而不同簇之间差异性较大(20)。有师监督主要包括偏最小二乘判别分析（partial least squares-data analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-data analyis，OPLS-DA）。有师监督方法运用PLS-DA，OPLS-DA建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。其参数R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，R2、Q2数值越接近1说明模型越好，越低说明模型的拟合准确性越差，通常情况下，R2、Q2高于0.5（50%）较好，高于0.4即可接受，且两者差值不应过大。但由于临床样本由于个体差异大，不可控，尤其大样本时，R2、Q2大小0.2左右亦可。
3.3 标志物的筛选与鉴定
生物标志物的筛选原则主要依据变量重要性（VIP）、p值、差异倍数(Fold change，FC)进行筛选。其参数选择范围可参照VIP≥1，p＜0.01，FC≥2。筛选到的标志物依据精确质量数、二级碎片（mass fragment）、同位数模型（Isotope fitness model）与标准数据库匹配，缩小目标代谢物范围。常用代谢数据库有人类代谢数据库（human metabolome database，HMDB），京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）等。靶向代谢物可以根据标准物质的相关图谱信息做进一步的对比验证。
3.4 代谢通路的构建
对已经定性的代谢物进行代谢通路富集分析，了解标志物在整个代谢通路的构架情况，
运用KEGG数据库进行信号通路分析，Met PA（MetaboAnalyst，3.0）网络软件对代谢产物路径进行可视化作图，能够可视化机体发生病变后小分子物质的代谢情况，对于疾病的预防及诊断起到重要作用(21)。
4 代谢组学在癌症筛查的应用
据美国癌症学会发表的《2018年全球癌症统计数据》共统计评估了185个国家36种癌症的发病率和死亡率。数据显示，2018年全球大约有1810万癌症新发病率，960万癌症死亡病例(22)。其中，亚洲和中国均是癌症病发率、死亡率最多的地区。欧洲虽然多为发达国家，但是癌症的病发并没有得到有效的控制，可能与欧洲高热量的饮食有很大的关系(23)。整体来说，肺癌在男性人群中最为常见，且也是造成男性死亡的头号癌症。在发病率方面，前列腺癌和结直肠癌紧随肺癌，而在死亡率方面，肝癌和胃癌却位居第二和第三。在女性中，乳腺癌是最常见的癌症，是癌症死亡的主要原因，其次是结直肠癌和肺癌，宫颈癌的发病率和死亡率都排在第四位。该报道也正在指出全球癌症的发病率和死亡率正在迅速增长。造成全球癌症负担日益严重有很多因素，如人口的老龄化和增长、社会经济的发展。在当今快速发展的社会经济体制中，该现象更为明显，如癌症的病因正与之前的贫困、感染因素转向为饮食、精神压力等生活方式。
4.1 代谢组学在肺癌疾病的应用
4.1.1 代谢组学在肺癌诊断与鉴别的应用
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤。而其临床症状并不明显，临床中70%~80%的肺癌患者临床就诊时就进入中晚期，对于人类的健康造成了巨大的危险。Carrola, J.(24)等通过NMR技术分析71例肺癌患者和54例对照健康组的尿液得出相关代谢组学特征，结合多组学分析法，确定了生物标志物马尿酸盐、葫芦巴碱、β-羟基异戊酸盐、α-羟基异戊酸盐、N-乙酰谷酰胺、肌酸酐。NMR更证实了组学技术在临床应用的前景，该项技术在模型的判识度，特异性及预测力都有着突出的优势，同时也鉴于其高通量的能力，能够比较全面的覆盖样本的信息，因此该技术在未来肺癌标志物的挖掘或鉴定中将有着不可估量的潜力。O'Shea, K.等基于LC-MS/MS技术分析了34名肺癌患者和33名健康对照组、34名肺癌患者中已经确诊的23名患者以及11名有症状的患者进行了对比，同时也对小细胞癌和非小细胞癌的患者的血清进行了分析。运用多变量偏最小二乘判别分析，其中异丁基癸酸盐、腐胺、戊二酸二乙脂、半胱氨酸能够准确区分患病组和对照组，苯乙酸、海藻糖、辛酸、乙酸、丙酸、甘氨酸能够准确区分小细胞癌和非小细胞癌。运用该物质作为特征标志物，分析ROC曲线，其灵敏度、特异性参数分别为（96%，94%）、（80%，100%），为基于代谢组学对于疾病的模式判别提供了更为有效的证明(25)。
4.1.2 代谢组学在肺癌治疗研究的应用
手术治疗是肺癌首选和最主要的治疗方法，主要适合于早中期（Ⅰ~Ⅱ期）肺癌、Ⅲa期肺癌和肿瘤局限在一侧胸腔的部分选择性的Ⅲb期肺癌，进而提高患者的生存率。现在医学也在不断探索术后患者复发率低、生存率提高的原因，因此，关于手术治疗后的生存期延长及肿瘤的复发机制，研究者基于代谢组学小分子水平也在不断寻求新的突破(26)。Chen(27)等基于LC-MS及GC-MS技术结合多元统计分析方法，对比了健康组、癌症术前与术后的特征代谢物，通路分析表明鞘磷脂代谢是肺癌的首要变化途径，代谢通路中甘油鞘磷脂、花生四烯酸和鞘磷脂等代谢物较传统代谢物表现出更高的特异性。同时对正常组、术后组与术前组进行了对比，发现术前2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇、β羟基丙氨酸含量降低、磷酸胆碱、异亚麻酸等表现出不同水平的升高；而与正常组相比，术前、后睾丸酮、三乙基丁酸含量均降低，α-羟丁酸的含量均升高，该代谢通路的可视化为肺癌的治疗提供了更为明确的方向。
4.2 代谢组学在肝癌疾病的应用
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤死亡顺位中占第二位。肝癌的临床病象极不明显，特别是在病程早期。肝病在临床的表象有很大的差异，患者的性别、年龄等因素都会影响病变的类型，其次是否带有肝硬化都会影响其病变程度。一般患者可以分为4个类型：肝硬化型、肝脓肿型、肝肿瘤型、癌转移性等。传统甲胎蛋白（AFP）结合影像学的应用，特别是AFP和超声显像用于肝癌高危人群的检测，使肝癌能够在无症状和体征的亚临床期作出诊断，伴随各种局部治疗非手术治疗方案及成熟的外科手术技术并行，使得肝癌的诊断及治疗较过去都有了明显的提高，但是其发病机理并未得到揭示。肝癌的发生、发展与体内的代谢状态息息相关。代谢组学通过分析生物样本尿液或血液等标本中的特征代谢物，进而探索得到肝癌的生物标志物，揭示其发病机制，对于肝癌的诊断、治疗及预后提供更为坚实的基础。Liu等基于NMR、LC技术分别检测了正常人、肝硬化患者及肝癌患者（Hepatocellular carcinoma，HCC）的血清，结合随机森林统计算法（random forest）发现了HCC患病发生变化的代谢通路主要表现在酮体的合成、柠檬酸的合成、磷脂代谢、脂肪酸氧化、氨基酸分解及胆汁酸的代谢(28)。Yang等利用亲水作用色谱质谱（HILIC-MS）结合反相色谱质谱技术(RPLC-MS)分析了35个肝癌患者与32个健康人群的尿液，同时运用偏最小二乘判别分析法，筛选得到11个潜在标志物。其中10个代谢物是通过亲水作用色谱所分离得到，其余是通过反相色谱所得，代谢物包括氨基乙磺酸、马尿酸、哌啶酸等物质，运用该类标志物可以很好地将健康组与肝癌组分开。同时，所开发的HILIC-MS/RPLC-MS技术的结合对于高度复杂的代谢组学样本信息可以做到更为深度的挖掘(29)。
4.3 代谢组学在乳腺癌疾病的应用
乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，该病恶化后会在肺、骨、脑等器官发生转移，并破坏其正常机体的代谢，已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤(30)。据中国抗癌协会公布的统计数据显示，我国近年来乳腺癌发病率以每年3%的速度增长，成为乳腺癌发病率增长最快的国家之一。乳腺癌发病呈现上升的趋势有多个影响因素，如环境、饮食。此外，一些代谢疾病如糖尿病和肥胖病也会带来患乳腺癌的风险(31, 32)。
然而，值得庆幸的是，乳腺癌患者如果在早期得到相应的治疗，其存活率大约为75%(30)。定期对乳房做一些预防性检查，如乳房B超、超声等技术，医生可以根据检测结果对乳腺癌做到及早的预测判断，在很大程度上可以起到预防作用。然而，一些生理因素如乳房组织过密，硅胶隆胸会使得检测技术不能够很好的实施；很大一部分人由于缺乏早期诊断的优势，会导致较大的死亡率。
代谢组学作为一种新的检测工具，目前已较成功地应用于乳腺癌标志物的识别中。因此，应用代谢组学的思路研究乳腺癌，对于乳腺癌的早期筛查、预后评估等方面具有重要的意义。Silva等(33)基于NMR技术对40例乳腺癌患者和38例健康人的尿液样本进行代谢组学数据采集，研究发现共得到10个差异代谢物，该类差异物参与的代谢途径主要包括氨基酸、糖、酯类代谢等多条途径。因此，研究者认为代谢图谱研究技术在疾病标志物的发现是一个更潜有力的工具，对于疾病发病机理提供新视觉、新方向。众所周知，虽然两个人可能同时被临床诊断为乳腺癌，但个体肿瘤对治疗的反应可能会因肿瘤内在的分子异质性而有所不同(34, 35)。因此，了解伴随疾病亚型的具体生化变化，为开发新的治疗方法提供了一个更为吸引力的平台，可用于定制反应，从而改善乳腺癌的临床结果(36, 37)。代谢组学技术可以同时检测数千种代谢物，并同时使我们能够识别出在乳腺癌发生过程中表现不足或过强的关键代谢途径。迄今为止，在乳腺癌细胞模型、肿瘤、血清或尿液中的一些研究已被用来了解乳腺癌进展的潜在原因和特定抗癌的治疗的反应。这些研究支持代谢组学在区分乳腺癌亚型做出的贡献，也可视化了细胞对抗癌治疗做出的反应(38-41)。Cao等(42)基于代谢组学技术评估了乳腺癌细胞对阿霉素的药效学和耐药性。乳腺癌细胞持续暴露于阿霉素可诱导P-gp的高表达和多重耐药。然而，逐渐诱导耐药的生化过程及机制尚不清楚。为了探讨阿霉素的抗肿瘤作用机制，采用气相色谱质谱法对细胞内代谢物进行分析，采用阿霉素对药敏MCF-7S和耐药MCF-7Adr乳腺癌进行治疗，评价阿霉素的抗肿瘤作用及耐药效果。其中主成分数据分析显示，两种细胞系对阿霉素表现出明显不同的代谢反应。结果显示阿霉素对药敏MCF-7S有明显的调节作用，但对耐药MCF-7Adr细胞影响较小。阿霉素治疗法显著抑制蛋白、嘌呤、嘧啶和谷胱甘肽的生物合成和糖酵解，同时增强MCF-7s细胞的甘油代谢。利用代谢物开发精确的检测工具，可以作为疾病状态或尿液药物反应的生物标志物，这可为临床提供非侵入性诊断方法。
5 小结
代谢组学作为继基因组学和蛋白组学系统生物学的下游分支，主要研究的是机体受扰动前后已经发生的反应。基于代谢组学技术的高通量、高灵敏度等优势，代谢物更能较全面地反映生理和病理的微小变化，因此，代谢组学在癌症等疾病的筛查诊断中具有不可估量的前景。结合已有的资源如人类代谢数据库（HMDB）、而且人体相关代谢途径比较清楚，因此，基于代谢组学的癌症诊断方法具有一定优势，而且其在疾病的应用范围也越来越广。虽然临床验证仍是研究者需要攻克的障碍，但我们有理由相信，癌症代谢组学标志物的新发现能够给患者带来更大的福音。
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第一作者：王淑华，女，内蒙古自治区赤峰市敖汉旗，本科，副主任检验师，检验与遗传，内蒙古赤峰市妇幼保健院，内蒙古赤峰市红山区钢铁街中段，024000，18147100504，mdmzhh_2008@126.com
通讯作者：刘云秋，女，内蒙古赤峰市元宝山区，本科，主任护师，遗传与护理，内蒙古赤峰市妇幼保健院，内蒙古赤峰市红山区钢铁街中段，024000，18047168855，Mizh@faith-m.com
论文作者:王淑华
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年1期
论文发表时间:2020/3/5
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