王在照[1]2000年在《编码四种甲壳动物蜕皮抑制激素的部分cDNA的克隆和序列分析》文中指出本文分别提取了中国对虾、中华绒螯蟹、鹰爪虾和蓝对虾的眼柄总RNA。用无DNA污染的眼柄总RNA为模板，根据日本对虾的MIH设计兼并引物P1和P2，进行RT-PCR扩增，在适宜的反应条件下，均分别得到一特异性的产物。以蓝对虾基因组DNA为模板的PCR扩增也能得到一与特异性cDNA片段大小相似的特异性的DNA片段。分别将这些片段亚克隆到载体中进行测序，测得中国对虾特异性cDNA片段由203个碱基组成，中华绒螯蟹、鹰爪虾、蓝对虾的特异性cDNA片段及蓝对虾的特异性DNA片段由215个碱基组成，其中蓝对虾的特异性cDNA与由蓝对虾的基因组DNA扩增得到的特异性DNA片段的碱基序列几乎完全相同。利用互联网上的在线工具Fasta3查找由这些cDNA推定的氨基酸序列的相似序列，可以发现大量的甲壳动物的CHH家族的神经肽与它们相似。 在所有的相似序列中，分别由中国对虾、中华绒螯蟹、鹰爪虾和蓝对虾的特异性cDNA片段推定的氨基酸序列与蜕皮抑制激素（MIH）的相似度最高，这一结果提示分别由中国对虾、中华绒螯蟹、鹰爪虾和蓝对虾的眼柄特异性cDNA片段推定的氨基酸序列可能是这四种甲壳动物的MIH片段。 根据核苷酸数据和氨基酸数据，比较这四种甲壳动物的MIH以及已发表的六种MIH之间的相似度，同时分析这十种MIH的系统进化关系，结果是蓝对虾、鹰爪虾和中华绒螯蟹的MIH相似性较高，亲缘关系较近，这与物种的系统演化不相符。
江红霞[2]2017年在《日本沼虾雌性性早熟相关基因的筛选、克隆、表达与功能分析》文中指出日本沼虾是一种具有很高经济价值的十足目甲壳动物,是我国淡水养殖的主要种类之一。近年来,由于日本沼虾自然资源的锐减,其养殖规模不断扩大,但养殖的日本沼虾却出现了生产性能下降、种质资源不断退化的情况,最为严重的是出现性早熟现象。性早熟是指日本沼虾提前进入繁殖期,当其尚未达到商品规格大小时,性腺就已经发育成熟,同时个体生长停止,使虾的商品率降低、产品贬值。性早熟的雌性个体还会产生低质量的后代,这样年复一年的繁育,加重了日本沼虾种质资源退化现象,制约了日本沼虾养殖业的健康发展。因此对雌性日本沼虾的性早熟现象进行研究,对性早熟相关基因进行筛选和功能分析,对阐明日本沼虾性早熟的分子机制,解决日本沼虾种质资源退化问题具有重要的意义。本研究采用转录组测序的方法,通过差异表达分析鉴别出了性早熟的和正常性成熟的日本沼虾卵巢中的差异基因(DEGs),通过对这些DEGs的注释、表达模式聚类分析,以及显著富集性分析筛选出可能与日本沼虾性早熟相关的基因;利用基因克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)PCR技术获得了其中5个可能与日本沼虾性早熟相关的基因的全长cDNA序列,并对其序列进行了生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(QPCR)技术检测了这5个基因的mRNA的表达规律并利用RNA干扰(RNAi)技术沉默其表达,探索了这5个基因在日本沼虾卵巢发育过程中的作用,获得的主要研究成果如下:1.正常性成熟的和性早熟的日本沼虾卵巢转录组测序本次转录组测序从正常性成熟的和性早熟的日本沼虾的卵巢中共获得63,336个unigenes以及大量的繁殖相关unigenes和代谢通路。鉴别出了26,008个SSRs,并分别从正常性成熟和性早熟的日本沼虾卵巢转录组中预测了80,516个和80,529个SNPs,还预测出了29,851个性早熟和正常性成熟的日本沼虾卵巢转录组中之间的SNPs。首次从性早熟和正常性成熟的日本沼虾的卵巢中鉴别出了549个DEGs,包括212个上调基因和337个下调基因。另外,从这549个DEGs中鉴别出了187个正常性成熟的日本沼虾的卵巢中特异表达的DEGs和90个性早熟的日本沼虾的卵巢中特异表达的DEGs。通过对这549个DEGs的GO分类分析、KEGG通路分析、以及GO和KEGG显著富集性分析,鉴别出12个可能与日本沼虾性早熟相关的DEGs,即卵黄蛋白原(Vg)、组织蛋白酶L(CTSL)、半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)、胰岛素样受体(INSR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、环氧化酶(COX)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)、铜锌超氧化物过氧化物酶(sod1)、脂肪酸合成酶(fasn)、二磷酸核苷激酶(nm23)、核糖体蛋白l24(rpl24)和核糖核苷还原酶调节因子1(rrm1)基因。2.性早熟相关基因的克隆及序列分析克隆出了日本沼虾mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因全长cdna序列,这5个基因的cdna全长分别是829bp、564bp、3238bp、6199bp和2941bp,其orf区分别为531bp、486bp、1845bp、2709bp和2436bp,分别编码177、162、615、903和812个氨基酸。通过对这5个基因的生物信息学分析,发现mnnm23蛋白具有保守的ndk结构域及ndk活性部位基序(nxxh[g/a]sd),与罗氏沼虾的nm23(mrnm23)蛋白的氨基酸序列相似性最高;mnrpl24蛋白具有一个保守的trash结构域,20个磷酸化位点和两个典型的核定位信号,不具有线粒体类型的rpl24蛋白所具有的标签序列,是一种细胞质类型的核糖体蛋白;mncox具有一个明显的egf-like结构域、一个跨膜螺旋结构域和8个保守的对环氧化酶活性起重要作用的氨基酸残基,其mrna的3’端非编码区(3’utr)序列具有多个au富集元件(au-richelements,ares),其结构和功能应与脊椎动物的cox2最为接近;mncst氨基酸序列中含有6个cystatin-like结构域,是一种multicystatin蛋白;mnrrm1具有第i类rr酶的大亚基所具有保守的酶活性位点,大小亚基聚合所必须的两个α-螺旋结构域,因此mnrrm1属于第i类rr酶的大亚基。3.性早熟相关基因mrna的表达分析在日本沼虾的受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾及成虾这6个生长阶段中,mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因均在受精卵中的表达量较低;在日本沼虾的Ⅰ-Ⅵ期的卵巢中,mnnm23、mnrpl24、mncox和mnrrm1基因的表达量均在Ⅰ期卵巢中最高,而mncst基因在Ⅳ期卵巢中的表达量最高;在日本沼虾的卵巢、肝胰腺、肌肉、心脏、肠、鳃、胃、腹神经节和眼柄这9个组织中,mnnm23基因在日本沼虾肝胰腺和肌肉中的表达量最高,mnrpl24和mncst基因在日本沼虾肠中的表达量最高,mncox和mnrrm1基因在日本沼虾鳃中的表达量最高;这5个基因在性早熟的和正常性成熟的日本沼虾的卵巢中的表达量均有显著差异(p<0.05)。4.性早熟相关基因的功能验证mnnm23基因沉默后,日本沼虾卵巢中卵黄生成作用标志基因vg和vgr,卵母细胞成熟标志基因cyclinb和cdc2基因的表达水平和虾的gsi在一个卵巢发育周期中与对照组相比提前达到峰值。mnrpl24、mncox和mnrrm1基因沉默后vg、vgr、cyclinb和cdc2基因的表达水平和虾的gsi在一个卵巢发育周期中与对照组相比在多个时间点都显著下降(p<0.05)。mncst基因沉默后,日本沼虾卵巢中ctsl基因在一个卵巢发育周期的多个时间点与对照组相比显著下降(p<0.05),而vg、vgr、Cyclin B和Cdc2基因的表达水平和虾的GSI在一个卵巢发育周期中与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。卵巢组织学观察发现MnNM23基因沉默后日本沼虾的卵母细胞的发育加快,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因沉默后日本沼虾的卵母细胞的发育被延迟,而MnCST基因沉默后日本沼虾的卵母细胞的发育不受影响。因此,MnNM23对日本沼虾卵黄生成和卵母细胞的成熟具有负相关的作用,MnNM23基因的低表达会促进卵巢的快速发育。MnRPL24、MnCOX和MnRRM1对日本沼虾的卵黄生成和卵母细胞的成熟的具有正相关的作用,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因的低表达会延迟卵巢的发育。而MnCST对卵黄生成和卵母细胞的成熟没有影响,因而对卵巢的发育也没有影响。卵巢发育过程中,尤其是在卵巢发育早期阶段,MnNM23的不足,或者是MnRPL24、MnCOX和MnRRM1的过量都有可能是导致日本沼虾性早熟的一个重要的原因,但确切的分子机制还需要进一步的深入研究。综上所述,本研究鉴别出了性早熟的和正常性成熟的日本沼虾卵巢的差异表达基因,并筛选出了可能的日本沼虾性早熟相关基因。对5个可能的日本沼虾性早熟相关基因进行了克隆、序列分析和mRNA的表达分析。最后探索了这5个基因在日本沼虾卵巢发育过程中的作用。本研究结果将为阐明日本沼虾性早熟的分子机制奠定基础。
王宁[3]2010年在《青虾性腺抑制激素和高血糖激素基因全长cDNA的克隆及序列分析》文中研究说明青虾,学名日本沼虾Macrobrachium nipponense),隶属十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae),广泛分布于全国各地,是我国重要的淡水养殖虾类。近年来青虾出现了种质退化现象,规格小、性早熟等严重影响了青虾的养殖效益。甲壳动物眼柄中合成分泌的甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)家族神经肽具有调节血糖水平,调控生殖、发育和蜕皮等活动的作用。因此本文以青虾眼柄为材料,对CHH家族中两个重要成员性腺抑制激素(gonad-inhibting hormone,GIH)和CHH的全长cDNA序列进行了克隆,为青虾相关功能基因的研究奠定基础。分离得到高质量的青虾眼柄总RNA是克隆青虾眼柄神经激素的先决条件。本试验先后使用RNAiso Plus、RNeasy Mini Kit、Unizol等产品抽提青虾眼柄总RNA并在方法上进行了改良,通过电泳、紫外分光光度计和RT-PCR对总RNA进行检测和分析。结果显示RNAiso法抽提的RNA色素含量高；改良RNAiso法抽提的RNA有部分降解,含色素少,对反转录酶有一定的抑制作用但不影响RT-PCR; RNeasy Mini Kit能有效去除抑制反转录酶活性的色素且RNA无降解,但DNA污染严重；RNAiso结合RNeasy Mini Kit法和Unizol结合RNeasy Mini Kit法提取的RNA均无DNA污染,也没有抑制反转录酶活性的色素,但后者所提的RNA完整性好。经比较,本文最终确立了Unizol结合RNeasy Mini Kit法为青虾眼柄总RNA提取的最佳方法,为后续分子生物学实验奠定了基础。采用RT-PCR以及快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)法分离得到了青虾GIH两个亚型(GIH-A和GIH-B)的全长cDNA序列。GIH-A cDNA序列全长918bp,包括455bp的5’非翻译区,333bp的阅读框,118bp的3’非翻译区[不包括poly(A)],阅读框编码的GIH-A前体包括32个氨基酸组成的信号肽和78个氨基酸组成的成熟肽。GIH-B cDNA序列全长1350bp,包括205bp的5’非翻译区,339bp的阅读框,794bp的3’非翻译区[不包括poly(A)],阅读框编码的GIH-B前体包括34个氨基酸组成的信号肽和78个氨基酸组成的成熟肽。两个亚型的成熟肽中都包含6个在CHH家族中位置保守的Cys残基以及一个CHH家族Ⅱ型肽所特有的Gly12。成熟肽氨基酸同源性分析显示,GIH-A和GIH-B与Rimicaris Kairei GIH的相似性分别为94%和67%,与美洲鳌龙虾Homarus americanus)GIH的相似性分别为71%和59%,与其它甲壳动物的蜕皮抑制激素(]molt-inhibiting hormone, MIH)、大颚器官抑制激素(mandibular organ-inhibiting hormone, MOIH)的相似性分别为39-60%和35-51%,与其它甲壳动物的CHH的相似性为28-34%。甲壳动物CHH家族系统发育树显示,GIH-A和GIH-B先与真虾下目的Rimicaris Kairei GIH聚在一起,然后再与海螯虾GIH聚在一起,最后与其它十足目的虾蟹CHH Ⅱ型肽聚在一起。采用RT-PCR以及RACE法分离了青虾CHH的cDNA序列,得到1017bp的全长cDNA,包括241bp的5’非翻译区,408bp的阅读框,355bp的3’非翻译区[不包括poly(A)].阅读框编码的CHH前体包括26个氨基酸组成的信号肽、33个氨基酸组成的CHH前体相关肽(CHH-precursor related peptide, CPRP)和74个氨基酸组成的成熟肽。成熟肽包含6个在CHH家族中位置保守的Cys残基,没有CHH家族Ⅱ型肽所特有的G1y12。成熟肽氨基酸同源性分析显示,青虾CHH与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)CHH和Macrobrachium lanchesteri CHH的相似性均为99%,与抱卵亚目其它虾蟹CHH的相似性为52-69%。CHH系统发育树显示,甲壳动物CHH分为两支,抱卵亚目和枝鳃亚目,抱卵亚目分支中,长尾类的CHH先与真虾下目的CHH聚在一起,然后再与短尾类CHH聚在一起。本文首次成功克隆了性腺抑制激素(GIH)和高血糖激素基因(CHH),为进一步研究青虾GIH和CHH基因的表达、功能和调控奠定了基础。
卜宪飞[4]2012年在《青虾咽侧体抑制激素（Allatostatin，AST）基因全长cDNA序列的克隆及表达分析》文中认为青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense),属节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium),广泛分布于全国各地。具有病害少、生长快、营养丰富等优点,是我国淡水虾蟹类的重要养殖品种。近年来随着青虾累代养殖规模逐渐扩大,出现了种质退化,规格小,性早熟等现象,严重影响了青虾的养殖效益。因此,开展青虾蜕皮及生殖发育相关功能和机制的研究十分迫切。节肢动物门的昆虫和甲壳动物都具有周期性蜕皮等相似的生理特性。首先在昆虫中发现的咽侧体抑制激素具有调节蜕皮和生殖的重要功能。甲壳动物脑神经细胞分泌的甲壳动物咽侧体抑制激素(Allatostatin,AST)神经肽也具有促进蜕皮、性腺成熟、卵成熟以及调控生殖等重要功能。因此本文以青虾脑组织为材料,对咽侧体抑制激素(AST)基因全长cDNA序列进行了克隆,并检测了AST基因在成体青虾不同组织中的表达,以期为青虾AST基因相关功能的研究奠定基础,同时也为青虾蜕皮机制及生殖发育的研究提供参考。本研究在传统基因克隆方法的基础上采用分段克隆的方法克隆了青虾AST基因的全长cDNA序列,即把青虾AST基因全长cDNA序列分成几个片段分别扩增。本实验共扩增了4段中间片段cDNA,经比对拼接后得到AST基因cDNA的全部中间序列,再与cDNA3'末端及5'末端拼接得出AST基因的全长cDNA序列。青虾AST基因cDNA序列全长2995bp,包括242bp的5’非编码区(UTR),647bp的3’UTR,2106bp的开放阅读框(ORF)。在poly(A)上游具有明显的加尾信号AATAAA,开放阅读框共编码701个氨基酸多肽前体,预测蛋白质分子量为78.7kDa,理论等电点为9.15。氨基酸多肽前体包括27个氨基酸组成的信号肽和674个氨基酸组成的成熟肽。成熟肽可加工成35个AST多肽,这些多肽在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide结构,属于典型的A型-AST,与昆虫纲蜚蠊目昆虫的AST多肽结构特征相同。将青虾的AST多肽与克氏螯虾(Procambarus clarkii)、三叶真蟹(Carcinus maenas)、斑节对虾(Penaeus monodon)、大海虾(Panulirus interruptus)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的AST多肽比对,结果显示保守氨基酸为Tyr、Phe、Gly、Leu几种,保守的多肽为AST-19,26,29,青虾特有的多肽为AST-3,8,16,20,24。部分昆虫和甲壳动物AST蛋白相似度比对显示,相似度均在60%以上,表明AST在无脊椎动物的进化中是相对保守的。系统进化树分析表明,甲壳动物和昆虫各自聚为一支,与传统分类学分类结果相吻合,其中青虾与罗氏沼虾最先聚在一起,亲缘关系最近。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了AST基因在青虾脑、肠道、肝脏、心脏、精巢、卵巢6种组织中的表达情况。以β-actin基因为内参基因。结果显示,AST mRNA在6种组织中均有表达,表达水平依次为：肝脏>肠道>精巢>脑>心脏>卵巢。已有的研究结果表明,AST多肽除了具有影响甲壳动物蜕皮和生殖的作用外,还能影响肠道和心脏的收缩频率和幅度。本研究中,AST在肝脏中检出量最高,与其他组织表达量均达到极显著差异,其次在肠道和精巢中也具有较高的表达量,在脑和心脏中的表达量相对较低,在卵巢的表达量最低,组织间差异不显著。本研究首次克隆得到了青虾AST基因的全长cDNA序列,对其结构特征进行了分析,并首次采用荧光定量PCR技术检测了该基因在青虾成体不同组织间的表达差异。研究结果为青虾AST基因功能的研究奠定了基础,并可为青虾蜕皮及生殖发育机制的研究提供参考,同时为甲壳动物相关研究提供借鉴。
许杨[5]2017年在《脊尾白虾生长蜕皮和生殖蜕皮的初步比较研究》文中提出脊尾白虾是我国沿海重要的中小型经济虾类之一,具有繁殖季节长、繁殖周期短等特点。每年的繁殖盛期为4-10月,已经抱卵的雌虾性腺仍然可以继续发育,待幼体孵化后又可进行第二次交尾抱卵,所以一尾雌虾1年可以多次交尾繁殖。由于雌性脊尾白虾无纳精囊结构,所以每当产卵前均需进行交配。性腺成熟以前的蜕皮称作生长蜕皮。当雌虾性腺成熟时,先行蜕皮而后进行交尾故此次蜕皮为生殖蜕皮。雌虾的生长、性成熟交尾与蜕皮密切相关,因此本研究对脊尾白虾生长蜕皮与生殖蜕皮进行了比较分析,探究两者之间的区别及卵巢发育调控系统与蜕皮调控系统之间的关系,可以为虾蟹类蜕皮机制的研究提供重要信息,还可以为雌虾同步性成熟及人工繁育提供理论依据。其主要结果如下:1、脊尾白虾不同蜕皮分期蜕皮激素浓度变化、几丁质酶、非特异性免疫酶活的比较分析本文对脊尾白虾两种蜕皮不同分期(间期C期、前期D期、后期AB期)的蜕皮激素(MH)浓度变化、几丁质酶(CHITINASE)及非特异性免疫指标酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)的活性进行了差异比较。结果显示,生长蜕皮时各分期CHITINASE活力和MH激素浓度变化趋势相同,呈逐渐升高趋势,且各分期差异显著(P<0.05),生殖蜕皮时呈先降低后升高趋势,且各分期差异显著(P<0.05);间期和前期生长蜕皮显著低于生殖蜕皮(P<0.05),后期时生长蜕皮显著低于生殖蜕皮(P<0.05)。生长蜕皮各分期PO活力差异不显著,生殖蜕皮各分期PO活性呈先降低后升高趋势,各分期差异显著(P<0.05);间期时生长蜕皮和生殖蜕皮PO活性差异不显著,前期时生殖蜕皮显著低于生长蜕皮(P<0.05),后期时生殖蜕皮显著高于生长蜕皮(P<0.05)。生长蜕皮各分期SOD活性逐渐升高,且差异显著(P<0.05),生殖蜕皮时期后期SOD活性显著低于间期和前期(P<0.05),间期和前期差异不显著;间期时生殖蜕皮显著高于生长蜕皮(P<0.05),前期两者差异不显著,后期时生殖蜕皮显著低于生长蜕皮(P<0.05)。生长蜕皮各分期AKP、ACP活力均呈先升高后降低趋势,且各分期差异显著(P<0.05),生殖蜕皮与生长蜕皮变化趋势相同;间期、前期、后期时生长蜕皮都显著高于生殖蜕皮(P<0.05)。综合蜕皮激素、几丁质酶、免疫相关酶三项指标的变化结果可知,生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢的发育而存在明显不同,卵巢发育会导致蜕皮过程中机体免疫力显著升高,而使蜕皮相关的几丁质酶和激素水平显著降低。2、脊尾白虾E75基因的克隆及其在不同蜕皮分期的表达分析通过RACE技术成功克隆了脊尾白虾E75基因cDNA序列全长,命名为EcE75(GenBank登录号:KY471317)。该基因全长3944bp,包括2520bp的开放阅读框(ORF),450bp的5’非编码区(5’UTR)和974 bp的3’非编码区(3’UTR)。脊尾白虾E75基因编码一个由839个氨基酸组成的多肽,分子量为92.307kDa,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含一个ZnF_C4(位于第32到104个氨基酸之间)、一个HOLI(位于第207到366个氨基酸之间)及六个低组分复杂区域。E75基因有一个明显的跨膜螺旋,跨膜方向为由内向外。脊尾白虾E75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹、黑背地蟹、凡纳滨对虾和中国对虾亲缘关系最近,同源性分别为79%、79%、78%、78%。EcE75基因在脊尾白虾的13种组织中均有表达,其中眼柄的表达量最高,卵巢次之。该基因在蜕皮各分期不同组织的表达可知,眼柄和鳃中的表达量一致,蜕皮前期表达量最高,蜕皮间期次之,蜕皮后期表达量最低。在大颚器中蜕皮间期表达量最高,推测可能与大颚器分泌的甲基法尼脂的调控作用有关。由此可知,E75基因在眼柄中表达量最高,在蜕皮前期大量表达说明该基因对脊尾白虾的蜕皮具有重要的调控作用。3、四种蜕皮相关基因在脊尾白虾不同蜕皮分期的表达分析通过RT-PCR技术,研究了ECR、RXR、E75、FAMeT四种基因在生长蜕皮和生殖蜕皮不同分期的表达规律。结果显示,RXR与ECR基因的表达规律基本一致。生殖蜕皮的蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高,可能是由于蜕皮激素对卵黄发生的刺激作用,而蜕皮激素的活性形式20E需要结合ECR和RXR形成的二聚体从而导致两者表达量升高的原因。RXR在生殖蜕皮的蜕皮后期表达量高于蜕皮前期可能是由于卵巢发育的关系。E75基因在生殖蜕皮的表大规律与ECR一致,而生长蜕皮蜕皮前期表达量与蜕皮间期表达量差异不显著与ECR和RXR的表达规律不一致原因未知,有待进一步研究。FAMeT生殖蜕皮各分期的表达量显著高于生长蜕皮各分期(P<0.05),说明MF对生殖的调节作用大于生长。在生殖蜕皮前期大量表达,充分证明了FAMeT是甲壳动物的促性腺激素,能促进卵母细胞的发育。该研究结果表明,生殖蜕皮时ECR、RXR、E75、FAMeT都受到卵巢发育的影响表达量上调从而促进卵巢发育和蜕皮的发生。
宋霞[6]2001年在《中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的PCR克隆及表达》文中研究说明甲壳类的生长包括蜕皮过程中外壳周期性的蜕壳。这个过程受两种相互拮抗的激素调控，即受到蜕皮激素(ecdysone)的刺激作用和蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)的抑制作用。MIH肽产生于端髓X器(MTXO)，储存在眼柄的窦腺中，通过抑制Y器分泌蜕皮激素来调节蜕皮。尽管MIH详细的作用机制仍未清楚，但已经在虾类和蟹类显示MIH可能经环核苷依赖途径抑制蜕皮激素的产生。 通过重组DNA技术，已经从几种甲壳类动物分离、克隆和鉴定了几个编码MIH肽的cDNA。不同甲壳类MIH的cDNA和氨基酸的序列都显示高度的同源性，不仅如此，MIH与CHH家族中其它成员，如甲壳类高血糖激素(CHH)、颚器官抑制激素(MOIH)和性腺抑制激素(GIH)，也显示了高度的同源性。这些激素的成熟肽通常由72-78个氨基酸残基组成，氨基酸的序列相似，均有6个保守的半胱氨酸残基。 中华绒螯蟹(Eriocheir japonicus sinensis)是我国重要的经济蟹类，俗称河蟹。近年来由于不同水系的河蟹种苗混杂，导致河蟹个体变小，严重影响了经济效益。蜕皮是河蟹生活史中重要的过程，但至今对河蟹蜕皮的激素调节尚未进行研究，蜕皮抑制激素的氨基酸序列及其基因的核苷酸序列尚未见报道。本文运用RT-PCR和反向PCR(inverse PCR，IPCR)技术，克隆了中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的cDNA和基因，并分析了基因的结构组成。 1．用RT-PCR技术从中华绒螯蟹眼柄总RNA中分离编码蜕皮抑制激素的部分cDNA 根据美洲黄道蟹Cancer magister，可口美青蟹Callinectes sapidus，三叶真蟹Carcinus maenas和斑纹蟳Charybdis feriatus的MIH成熟肽氨基酸序列的密码子使用频率，设计2个简并引物(F1和R48)。以10只蜕皮间期的河蟹眼柄总RNA，经随机六核苷引物逆转录合成第一链cDNA，然后用简并引物经PCR扩增河蟹眼柄cDNA。 结果：经过RT-PCR扩增得到一个与预期大小一样的片段，长163bp。将获得的部分cDNA片段连接到PinPoint~(TM)Xa-1质粒载体中，进行克隆测序。序列分析认为，获得的中华绒螯蟹蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone for Eriocheir japonicus sinensis，Ers-MIH)基因的部分cDNA编码的蛋白与另4种蟹类的MIH肽同源。
孙婧[7]2009年在《中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达cDNA文库的构建》文中研究表明中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹,是一种食用风味独特,营养保健价值极高的重要经济水产品。但是,在河蟹养殖的过程中,蟹种性早熟的问题给生产带来了巨大的损失,严重制约着河蟹养殖业的发展。其性早熟可能与蟹体内的神经肽类激素分泌不正常有关。甲壳动物眼柄神经分泌细胞所分泌的激素在调控其生长发育过程中起着极其重要的作用。本研究的目的在于利用抑制消减杂交(SSH)技术构建中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达的cDNA文库,为克隆眼柄视上神经节特异性表达的基因,研究这些基因的功能,探讨河蟹发育的分子机制,以及进一步阐明河蟹性早熟的分子机理奠定基础。本实验用Trizol法提取到了质量较好的中华绒螯蟹眼柄视上神经节和肌肉的总RNA,利用所得到的RNA成功进行反转录形成cDNA,经过RsaⅠ酶切后结果显示酶切比较充分,随后的接头连接效率检测也显示,Tester接头的连接效率大于30%,也满足后续实验要求(>25%)。两轮杂交和两次抑制PCR已经使看家基因Beta-actin被有效地消减下去,消减后看家基因的消减效率提高了215倍,使得眼柄视上神经节差异表达的基因得到了有效富集。两轮消减杂交后,初步构建了中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达的cDNA文库。将纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌JM109,经抗性筛选方法对消减文库进行初步筛选,得到324个阳性克隆。随机挑取的PCR克隆产物结果显示：75%以上的克隆都能够扩增出有效的产物,PCR扩增片段主要集中在200bp-500bp(含接头序列42bp),构建的消减cDNA文库质量较好。挑选3组PCR产物呈阳性的菌液送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。BLAST比对结果显示：所得227bp序列没有找到与之相似的序列,但是否就是新基因还需要进一步的验证；所得到的309bp序列是河蟹蜕皮抑制激素的片段；所得到的438bp序列经比对后推测其为河蟹高血糖激素前体。说明用该方法构建眼柄视上神经节特异性表达的文库是可行的,并且按照该方法继续筛选阳性克隆,最终可以得到河蟹眼柄视上神经节特异性表达的基因。本研究利用SSH技术,成功构建了中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达的cDNA消减文库,从而为进一步筛选想要得到的基因和发掘新基因提供素材。
李法君[8]2015年在《青虾IAG及相关基因的克隆及调控关系的研究》文中提出青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium nipponensis),是我国重要的淡水养殖品种。雌雄青虾生长差异显著,商品雄虾的平均规格为雌虾的2～2.5倍。因此,全雄化养殖可以大幅度提高青虾的产量和经济效益。性别控制技术是实现青虾单性化养殖的基础,而要实现青虾性别的人工控制,首先要确定性别决定基因及其调控机制,但有关研究几乎空白,制约了青虾性别控制技术的发展。促雄腺(androgenic gland,AG)是甲壳动物性别分化(雄性化)的关键器官,其分泌的胰岛素样促雄腺激素(insulin-like androgenic gland hormone,IAG)在甲壳动物的性别分化中起着关键作用。体外研究表明,胰岛素样促雄腺激素结合蛋白(insulin-like androgenic gland hormone binding protein gene,IAGBP)能特异地结合IAG激素,然而在甲壳动物体内IAG与IAGBP之间是否存在相互调控关系以及如何调控,迄今未见报道。另一方面,研究表明眼柄中的神经激素对IAG基因起着负调控作用,但具体那种(些)神经激素发挥作用尚不清楚。本文拟以青虾为研究对象,以促雄腺转录组文库为基础克隆青虾IAG和IAGBP的cDNA序列,并获得其基因组序列,在转录水平上研究了上述两个基因的相互调控关系;同时研究了神经激素—高血糖素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)、性腺抑制激素(gonad inhibiting hormone,GIH)和蜕皮抑制激素(molt inhibiting hormone,MIH)对IAG基因的调控作用,并克隆了它们的基因组序列;研究表明,IAG基因在甲壳动物的生长过程中起着生长调节因子的作用。因此本文在青虾IAG基因组内含子中进行了与生长性状相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)位点的筛选。1.青虾IAG和IAGBP基因的克隆及在发育过程和成体组织中的表达分析本文通过采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆青虾IAG和IAGBP的cDNA序列,并获得了其基因组序列。IAG基因的cDNA序列全长为1653bp,其中5'非翻译区(Untranslated Regions,UTR)为222bp,开放阅读框为528bp、3'UTR为903bp,3'端有一个Poly(A)尾巴,加尾信号AATAAA位于Poly(A)尾巴的前端。青虾IAG多肽由一个信号肽(27个氨基酸)和一个前体多肤(148个氨基酸)组成。青虾IAG前体多肽由A链、B链和C链构成。其中B链有40个氨基酸,C链有65个氛基酸,A链有43个氨基酸。青虾IAG基因组序列存在两个基因拷贝,这两个基因拷贝均由5个外显子和4个内含子组成。两者的区别在于,第4内含子的长度有所不同。具体构成如下,IAG基因组序列Ⅰ全长5579bp(GenBank:KF811212),具体为:外显子1(27bp)、内含子1(1795bp)、外显子2(172bp)、内含子2(615bp)、外显子3(113bp)、内含子3(1193bp)、外显子4(183bp)、内含子4(1448bp)、外显子5(33bp);IAG基因组序列Ⅱ全长4739bp(GenBank:KJ831646),此序列第4内含子为608bp,其它的内含子和外显子长度与IAG基因组序列Ⅰ相同。分析内含子的序列发现,这两个基因组序列所有内含子的5'端有GT碱基和3'端存在AG碱基,属于"GT-AG"型内含子。IAG基因在检测的组织中仅在促雄腺和肝胰腺中表达。在促雄腺中的表达量最高,在肝胰腺中也有表达,表达量约为促雄腺表达量的1%。IAG基因在不同发育时期的表达结果为,在胚胎期表达最低,其次是出膜后期,表达量最高的是变态后期。具体而言,在胚胎期,从卵裂期到无节幼体期,表达量一直较低,蚤状幼体期表达量升高;在出膜后的表达量相对稳定;在变态后阶段最高的表达量出现在第10天(PL10),且从变态后第20天(PL20)到成虾表达量呈相对稳定上升趋势。IAGBP基因的cDNA序列全长为1085bp(GenBank:KJ831645),其中5'UTR为60bp,开放阅读框为759bp、3'UTR为266bp,3'端有一个Poly(A)尾巴。IAGBP多肽结构域分为三部分:IB结构域(从第26个氨基酸到第100个氨基酸)、KAZAL结构域(从第97个氨基酸到第138个氨基酸)和IG_like(从第154个氨基酸到第233个氨基酸)。青虾IAGBP基因组序列和IAG基因组一样也存在两个拷贝,这两个拷贝均由4个外显子和3个内含子组成。两者的区别在于,第1内含子的长度上有所不同。具体构成如下,IAGBP基因组序列Ⅰ全长4055bp(GenBank:KJ831648),具体为:外显子1(98bp)、内含子1(2084bp)、外显子2(323bp)、内含子2(625bp)、外显子3(144bp)、内含子3(587bp)、外显子4(194bp);IABP基因组序列Ⅱ全长3678bp(GenBank:KJ831647),此序列第1内含子为1707bp,其它的内含子和外显子长度与IAGBP基因组序列Ⅰ相同。IAGBP基因在检测的组织中都有表达。在精巢的表达量最高,其次是肌肉和肝胰腺,表达量最少的组织是眼柄。IAGBP基因在胚胎期表达最低,出膜后表达量逐渐升高,在变态后保持较高的表达量,在成体的表达量最高。2.青虾IAG和IAGBP基因相互调控关系的研究本文采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)和荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)技术,在转录水平上研究了上述两个基因的相互调控关系。沉默IAGBP基因,IAGBP和IAG基因的表达量与对照组相比分别下降到21.4%和43.5%(P<0.01)。沉默IAG基因,IAG基因的表达量下降到对照组的11.6%(P<0.01),而在精巢、肌肉、促雄腺和肝胰腺等组织,IAGBP基因的表达量分别下降到对照组的52.4%(P<0.01)、58.4%(P<0.01)、55.3%(P<0.01)和59.7%(P<0.01);在眼柄、脑、心脏和神经索组织中,IAGBP基因的表达量没有明显变化。结果表明,青虾IAGBP和IAG基因存在相互的正调控关系。3.GIH,MIH和CHH基因对IAG基因调控作用的研究本文采用RNAi和qRT-PCR技术,研究了GIH,MIH和CHH基因对IAG基因的调控作用,同时运用基因组步移技术克隆了GIH,MIH和CHH基因组序列。基因组步移的结果显示,GIH,MIH和CHH基因组序列均由3个外显子和2个内含子组成。具体而言,GIH的基因组序列包括:外显子1(36bp)、内含子1(511bp)、外显子2(189bp)、内含子2(1507bp)、外显子3(114bp);MIH的基因组序列包括:外显子1(36bp)、内含子1(752bp)、外显子2(183bp)、内含子2(649bp)、外显子3(114bp);CHH的基因组序列包括:外显子1(18bp)、内含子1(1524bp)、外显子2(285bp)、内含子2(729bp)、外显子3(105bp)。在这三个多肽序列中GIH和MIH拥有相同的内含子插入位点:内含子1插入在Gln12和Lys13(GIH)/Arg13(MIH)之间,内含子2插入在成熟多肽的Lys41(GIH)/Arg41(MIH)和Lys42之间。而CHH的内含子插入位点则与它们不同,内含子1的插入位点在Val6和Met7之间,内含子2的插入位点在成熟多肽的Arg40和Glu41之间。本文第一次在DNA水平提供了CHH家族神经激素基因的分类依据。本文在转录水平研究了CHH家族神经激素基因对IAG基因的调控作用。实验设置3个眼柄处理组:未剪除组(对照组)、单侧眼柄剪除组和双侧眼柄剪除组;3个实验组:分别干扰GIH,MIH和CHH基因。沉默GIH,MIH和CHH基因发现,GIH,MIH和CHH基因的转录水平分别下降到对照组的13.5%(P<0.01)、19.4%(P<0.01)和22.5%(P<0.01)。本文进一步将3个干扰组中IAG基因的表达量与对照组、单侧眼柄剪除组和双侧眼柄剪除组做了对照。IAG基因的表达量与对照组相比分别上升了452.7%(P<0.01)(单侧眼柄剪除组)、660.2%(P<0.001)(GIH干扰组)、472.9%(P<0.01)(MIH干扰组)、112.4%(P>0.05)(CHH干扰组)、1049.1%(P<0.001)(双侧眼柄剪除组)。结果表明,GIH和MIH基因负调控IAG基因的表达。4.青虾IAG基因组序列中与生长性状相关的SNP位点筛选本文应用限制性酶切长度片段多态性(Restriction fragment length polymorphism-PCR,RFLP-PCR)技术在青虾IAG基因的内含子区域进行了与生长性状相关的SNP位点筛选。结果显示,在IAG基因组第一内含子和第二内含子中发现了4个SNP位点:509G>T、529G>T和590A>T位于内含子1,2226A>G位于内含子2。4个SNP位点的多态信息含量(PIC)为:根据多态信息含量(PIC)分类标准(PIC≤0.25,低度多态性;0.25<PIC<0.50,中度多态性;PIC≥0.50,高度多态性),位点529G>T和590A>T,属于高度多态性位点;位点2226A>G,属于中度多态性位点;位点509G>T,属于低度多态性位点。4个SNP位点与生长性状(体长,BL;体重,BW)的相关性分析表明,在位点2226A>G,GG基因型的个体比AA型和GA型个体拥有更长的体节(P<0.01)和更重的体重(P<0.05)。本文首次克隆了IAGBP基因的cDNA序列;IAG,IAGBP,CHH,GIH和MIH基因组序列;首次研究了IAG和IAGBP基因的相互调控关系;首次阐述了CHH家族神经激素基因对IAG基因的调控作用;首次在IAG基因组中筛选到与生长性状相关的SNP位点。本研究结果不仅有助于阐明青虾性别决定和调控机制,为青虾性别控制育种提供指导,而且可为甲壳动物其它物种性别决定机制的研究提供参考。
谢松[9]2006年在《中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）卵黄蛋白的生化性质及基因克隆》文中提出卵黄蛋白(Vitellin, Vn)是卵黄的主要成分,在雌性对虾性腺成熟过程中合成,为胚胎和幼体早期发育提供营养。本文对中国明对虾卵黄蛋白及其前体卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)的生化特征进行了研究,并克隆了Vg的全长cDNA序列。利用凝胶过滤(SephadexG-150)、离子交换(DEAE-Cellulose-32)以及电洗脱等方法纯化了中国明对虾Vn和Vg。Vn是一种糖脂磷类胡萝卜素蛋白,总分子量409 ku,等电点5.4,含糖量8.7%,具有5个亚基(202 ku、171 ku、105ku、80 ku和73 ku),亚基之间有1个二硫键。Vg也是一种糖脂磷类胡萝卜素蛋白,总分子量476 ku,等电点5.2,含糖量11.6%,亚基之间未发现二硫键。利用纯化的Vn免疫家兔制备抗血清。此抗血清能与对虾属内不同个体Vn或Vg发生免疫反应,但与属外个体间无此特性。免疫组织学观察证明对虾外源性Vg产生于肝胰腺,经血淋巴、滤泡细胞的转运,最终被卵母细胞吸收,加工成Vn。采用ELISA方法检测了对虾卵及无节幼体对Vn的利用过程。卵子排出后卵及幼体体内卵黄蛋白含量不断减少,N3-4至N5-6期和N5-6至Z1期两个时期Vn的消耗量最大,分别为1322 ng／mL和1213 ng／mL,占卵中卵黄蛋白总量的38.9%和35.7%,Z1期以后体内基本不含卵黄蛋白。通过同源克隆和RACE等方法从成熟中国明对虾卵巢中克隆到了一条VgcDNA序列。全长7956 bp,含有一个7761 bp的开放阅读框(ORF),编码2587个氨基酸残基。推导的氨基酸序列与其他已知甲壳动物Vg具有80-95%的同一性(identity)。其中,中国明对虾和墨吉明对虾Vg分子的亲缘关系最近。SingalP程序预测Vg前体N末端含有18个氨基酸残基的信号肽。其余2569个氨基酸中含有一个RXRR分裂位点,此位点能被枯草杆菌样蛋白内切酶(subtilisin-like endoproteases)所识别并裂解。推导的Vg的理论分子量是282 ku,理论等电点为6.13。氨基酸含量分析显示,Vg蛋白含有较多的Ala(11.56%)、Glu(8.99%)、Val(8.52%)和Ile(7.12%)。RT-PCR方法检测到Vg基因同时存在于雌性和雄性对虾基因组中,但其转录只发生在卵黄形成期的雌性对虾的卵巢和肝胰腺中。
关建义[10]2017年在《KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其机制研究》文中指出日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属甲壳纲(Crustacea)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium),广泛分布于各地的淡水中,由于其自身的环境适应优势和经济价值,使其成为了我国具有较大发展潜力的淡水养殖品种。我们前期研究证实,咪唑类物质KK-42处理能显著促进凡纳滨对虾(Penaeus schmitti)、日本沼虾幼虾的生长,但作用机制并不十分清楚。甲壳动物的生长与蜕皮密切相关,为了探索KK-42的作用机理,本文以日本沼虾幼虾为材料,采用生测方法,在进一步明确KK-42促生长效应的基础上,首先测定了幼虾蜕皮周期的时程,深入分析了3个与蜕皮有关的基因表达变化和蜕皮周期的关系,观察了表皮超微结构的变化,具体方法和结果如下:以水产基地自行繁殖的2月龄幼虾(体长1.2~2.0 cm)为材料,捕捞后暂养于流水养殖水槽,水温(26±1)℃,每天投喂2次,1周后用于实验研究。用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液(处理组)或不含KK-42溶液(对照组)浸润1 min,取出,一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定;从剩余部分中选择处于不同蜕皮阶段的幼虾,分别在不同时间段取处理组和对照组的不同组织,用于RNA的提取、基因的克隆、几丁质酶(Chitinase)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)m RNA的相对表达水平、相应的酶活性测定和表皮超微结构观察。在实验观察期间,KK-42处理组平均体质量均显著高于对照组,体质量增长率的升高出现在处理后的前2周。随着幼虾的生长,蜕皮周期的持续时间均趋于延长,在4个连续测定的蜕皮周期中,KK-42处理能明显缩短前2个周期的时程,分别从(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期缩短为(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。首次从日本沼虾表皮组织中克隆出2个几丁质酶基因(M.nipponense Chitinase gene,MnChi)c DNA全长序列:MnChi-1和MnChi-3,其c DNA全长分别为1532 bp和1413 bp,各含有一个66 bp和26 bp的5'非翻译区,236 bp和247 bp的3'非翻译区,以及一个1230 bp和1140 bp的开放阅读框。其基因编码的蛋白质分别由410和380个氨基酸组成,预测其分子量为46.32 k Da和42.52 k Da,理论等电点(p I)为4.75和4.76。结构域分析表明,它们均含有一个信号肽、一个典型肽段催化域和糖基水解酶18家族保守域;氨基酸多重比对分析显示它们都缺泛S/T富集连接区和CBDs结构域。MnChi-1在表皮、肠道、尤其在肝胰腺组织高表达,其中,在表皮和肝胰腺中,蜕皮前期(D)表达量最高;Mnchi-3在表皮、肝胰腺、眼柄和肠道中均有表达,肠道组织最高,其周期表达模式与Mnchi-1类似。KK-42处理可显著上调蜕皮间期(C)表皮MnChi-1的表达,在第3、6和9h,其m RNA水平高于对照组10倍以上,酶活力同比提高2倍以上;KK-42处理对D期的影响相对较弱,该基因的表达水平及酶活性仅在12 h显著升高。KK-42对肝胰腺MnChi-1的影响类似。KK-42对表皮和肝胰腺MnChi-3转录及酶活性水平的影响与MnChi-1相似,显著的诱导作用主要发生在C期。首次从日本沼虾表皮中克隆出MnNAGase(M.nipponense NAGase,MnNAGase)c DNA全长序列,全长2536 bp,ORF长度为1854 bp,5′UTR为382bp,3′UTR为300 bp,预测蛋白的理论分子量为69.72 k Da,等电点为(PI)5.43。编码白617个氨基酸,结构域分析显示,它具有一个信号肽,一个糖苷水解酶20家族保守域,9个催化结构域特征保守位点,该段保守域氨基酸序列与凡纳滨对虾和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似度90.4%。该基因在表皮中的周期表达D期最高。KK-42处理可以显著上调C期表皮MnNAGase m RNA的表达,处理后3 h快速升高,6 h达到峰值,同比增加4倍以上(P<0.01);酶活性呈类似的变化趋势。KK-42对D期表皮MnNAGase的上调效应较弱,仅在处理后6 h,转录量明显升高,而酶活性在3、6和9 h均显著高于对照组。表皮上皮细胞层是蜕皮激素作用的靶组织,鉴于KK-42对C期Chitinase、NAGase活性及其基因表达显著的调节效应,采用透射电镜观察了分泌此酶的上皮细胞超微结构在C期的变化。结果显示,C期为单层假复层上皮细胞,扁平、排列规则;KK-42处理后9 h,上皮细胞延伸变长,多种细胞器如高尔基体、线粒体、粗面内质网、核糖体等大量出现。结论:KK-42处理能显著促进日本沼虾幼虾的生长和缩短其蜕皮周期;明显上调表皮和肝胰腺MnChi-1、MnChi-3和表皮MnNAGase的表达及酶活力;可以激发上皮细胞层的细胞活性,可能加速了多种酶的合成分泌和运输,进而加快了旧表皮的降解。这可能是KK-42缩短幼虾蜕皮周期的机制之一。
参考文献：
[1]. 编码四种甲壳动物蜕皮抑制激素的部分cDNA的克隆和序列分析[D]. 王在照. 中国科学院海洋研究所. 2000
[2]. 日本沼虾雌性性早熟相关基因的筛选、克隆、表达与功能分析[D]. 江红霞. 西北农林科技大学. 2017
[3]. 青虾性腺抑制激素和高血糖激素基因全长cDNA的克隆及序列分析[D]. 王宁. 南京农业大学. 2010
[4]. 青虾咽侧体抑制激素（Allatostatin，AST）基因全长cDNA序列的克隆及表达分析[D]. 卜宪飞. 南京农业大学. 2012
[5]. 脊尾白虾生长蜕皮和生殖蜕皮的初步比较研究[D]. 许杨. 上海海洋大学. 2017
[6]. 中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的PCR克隆及表达[D]. 宋霞. 南京师范大学. 2001
[7]. 中华绒螯蟹眼柄视上神经节特异性表达cDNA文库的构建[D]. 孙婧. 河北大学. 2009
[8]. 青虾IAG及相关基因的克隆及调控关系的研究[D]. 李法君. 南京农业大学. 2015
[9]. 中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）卵黄蛋白的生化性质及基因克隆[D]. 谢松. 河北大学. 2006
[10]. KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其机制研究[D]. 关建义. 河南师范大学. 2017
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